第十一课流式细胞术测定植物基因组大小
基于本草基因组学应用流式量测序技术检测人参基因组大小
基于本草基因组学应用流式量测序技术检测人参基因组大小张小燕;刘志香;廖保生;肖水明;徐江;盛玮【摘要】Ginseng is the dried root and rhizome of Panax ginseng.The lack of genomic data has restricted the development of ginseng industry and basic research.The genome size of P.ginseng was estimated to be 3.42 Gb by using the genome data of Oryza sativa ssp.Nipponbare and Glycine max (L.) Merrill as the reference and the flow cytometricanalysis.Meanwhile,shotgun libraries with the insert size of 250 bp and 500 bp were constructed,and sequenced for double terminal PE 150 by using Illumina Hiseq X Ten platform.Totally,183.82 Gb high quality data was obtained after filtering the raw data.The genome size of P.ginseng was 3.35 Gb and the sequencing depth was 54.87 X by K-mer analysis.In this study,flow cytometry and K-mer analysis were used to identify the genome size of ginseng,which provided basic data for the further whole genome sequencing and herbgenomics studies.%人参(Ginseng)是五加科植物人参(Panax ginsengC.A.Mey.)的干燥根和根茎.由于其基因组数据的缺乏制约了人参基础研究和产业发展.本实验以水稻(Oryza sativa ssp.Nipponbare)和大豆(Glycine max (L.) Merrill)为内参,通过流式细胞术检测人参基因组大小约为3.42 Gb;同时,分别构建人参基因组插入片段大小为250 bp和500 bp的鸟枪法(shotgun)文库,利用Illumina HiseqXTen平台进行双端PE 150高通量测序,过滤原始测序数据后获得183.82 Gb高质量数据,K-mer分析法预估人参基因组大小为3.35 Gb,测序深度为54.87 X.本研究采用流式细胞术结合K-mer分析法测定人参基因组大小,为人参全基因组测序以及本草基因组学的研究提供基础数据.【期刊名称】《世界科学技术-中医药现代化》【年(卷),期】2017(019)010【总页数】5页(P1724-1728)【关键词】人参;基因组大小;流式细胞术;高通量测序;本草基因组学【作者】张小燕;刘志香;廖保生;肖水明;徐江;盛玮【作者单位】淮北师范大学生命科学学院淮北235000;中国中医科学院中药研究所北京100700;中国中医科学院中药研究所北京100700;中国中医科学院中药研究所北京100700;中国中医科学院中药研究所北京100700;中国中医科学院中药研究所北京100700;淮北师范大学生命科学学院淮北235000【正文语种】中文【中图分类】R331本草基因组学（herbgenomics）是利用组学技术研究中药基原物种的遗传信息及其调控网络，阐明中药防治人类疾病分子机制的学科，从基因组水平研究中药及其对人体作用的前沿科学[1,2]。
211004201_利用流式细胞术鉴定68份三角梅基因组大小与染色体倍性
接收日期：2022-11-18接受日期：2022-12-14基金项目：厦门市科技计划项目(3502Z20214ZD4001、3502Z20199008) *通信作者。
E-mail:****************利用流式细胞术鉴定68份三角梅基因组大小与染色体倍性陈宜木，周 群，钟颖颖，张万旗*，李可威，林悦其(厦门市园林植物园，福建 厦门 361000)摘 要：以国内外收集的54份三角梅(Bougainvillea )资源和14份实生种质为材料，选用番茄(Solanum lycopersicum )为内参，采用流式细胞术估测三角梅基因组大小，并以二倍体品种为对照，计算三角梅染色体倍性。
结果表明：(1) 所选用的内参与待检测样品的最高值能完全分开，没有重叠峰，峰型比较清晰集中，可以对三角梅基因组大小进行有效估测。
(2) 供试材料中有34份二倍体，基因组大小为2.48～2.86 Gb ；有28份三倍体，基因组大小为3.65～4.22 Gb ；有5份四倍体，基因组大小为4.98～5.12 Gb ；另外，‘大金边杨梅’为2X 、4X 、6X 混倍体。
利用流式细胞法鉴定三角梅染色体倍性可缩短鉴定时间，提高鉴定效率。
关键词：三角梅；流式细胞术；基因组大小；染色体倍性；育种Doi: 10.3969/j.issn.1009-7791.2022.06.001中图分类号：S685 文献标识码：A 文章编号：1009-7791(2022)06-0417-07Genome Size Estimation and Ploidy Identification of 68 ServingsBougainvillea by Flow CytometryCHEN Yi-mu, ZHOU Qun, ZHONG Ying-ying, ZHANG Wan-qi *, LI Ke-wei, LIN Yue-qi(Xiamen Botanical Garden, Xiamen 361000, Fujian China)Abstract: Using diploid variety tomato as the internal reference, the genome sizes of 54 collected germplasm at home and abroad and 14 seedlings of Bougainvillea resources were estimated by flow cytometry, and the chromosome ploidy was calculated with diploid as the control. The results showed that: (1) the peaks of the selected samples assayed were completely separated from that of the control without overlapping, and the peak shape was clear and concentrated, suggesting that the estimation of Bougainvillea genome size and ploidy was effective; (2) among the tested materials, 34 germplasm were diploids with genome sizes of 2.48–2.86 Gb, 28 germplasm were triploids with genome sizes of 3.65–4.22 Gb, 5 germplasm were tetraploid with genome sizes of 4.98–5.12 Gb. In addition, a Bougainvillea germplasm resource ‘Big Phnom Penh bayberry’ was identified as a mixoploid of 2X, 4X and 6X. The usage of flow cytometry assay could shorten the time while improve the efficiency towards the identification of Bougainvillea chromosome ploidy. Key words: Bougainvillea ; flow cytometry; genome size; ploidy; breeding三角梅是紫茉莉科(Nyctaginaceae)叶子花属(Bougainvillea )中具有园艺价值的一类藤状灌木[1]，也叫叶子花、三角花、南美紫茉莉、九重葛、宝巾花、簕杜鹃、贺春红等，至今已有250多年的栽培历史[2]。
基于流式细胞分析技术的茯苓基因组大小测定
基于流式细胞分析技术的茯苓基因组大小测定王亚之;李秋实;陈士林;孙超;宋经元【摘要】目的:茯苓是担子菌多孔菌科的著名传统中药.本研究的目的在于测定茯苓的基因组大小并考察了其倍性与基因组的关系.方法:真菌材料的前处理参考文献报道[1],并用DNA特异性染料碘化丙啶进行染色,通过调节离心转速、染色时间等条件对样品进行核分离的优化.DNA含量用流式细胞仪进行分析,通过比较茯苓与内参黑曲霉G0/G1期峰比值计算得出.结果:茯苓的基因组大小测定为55.79±3.03Mb,或相对DNA含量为0.12±0.01pg(1pgDNA=0.965×109bp).在结果中可以检测出黑曲霉和茯苓的G2/M期峰.结论:本研究探索了用流式细胞仪分析茯苓基因组大小的方法,所得数据可为基因组学研究提供了参考.【期刊名称】《世界科学技术-中医药现代化》【年(卷),期】2010(012)003【总页数】5页(P452-456)【关键词】茯苓;基因组大小;流式细胞术;黑曲霉【作者】王亚之;李秋实;陈士林;孙超;宋经元【作者单位】中国医学科学院北京协和医学院药用植物研究所,北京,100193;中国医学科学院北京协和医学院药用植物研究所,北京,100193;中国医学科学院北京协和医学院药用植物研究所,北京,100193;中国医学科学院北京协和医学院药用植物研究所,北京,100193;中国医学科学院北京协和医学院药用植物研究所,北京,100193【正文语种】中文茯苓为我国传统常用菌类药材，别名松腴、松薯，《中华人民共和国药典》2010版收载的茯苓来源于多孔菌科（Polyporaceae）、卧空菌属（Poria）真菌茯苓Poria cocos（Schw.）Wolf的干燥菌核。
野生茯苓多分布于北纬18°～37°、东经98°～121°之间的亚热带、热带[2]，其作为经济型真菌在我国已有2000多年的栽培历史[3]。
流式细胞术测定植物基因组大小 一、流式细胞术的基本知识 二、植物C值分析原理
Sheath fluid
Fluorescence signals Focused laser beam
液流中心由单列 匀速运动颗粒组 成的液柱
分选系统
488 nm laser FALS Sensor
Fluorescence detector
Charged Plates
+
Single cells sorted into test tubes
流式细胞仪(Flow Cytometer)
集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、电子计算机技术、细 胞荧光化学技术、流体力学为一体的一种新型高科技仪器。
流式细胞术特点
单细胞悬液 或生物颗粒 分析速度高 多参数 精度高 高灵敏度 无害分析 和分选
当代最先进的细 胞定量分析技术
国际两大流式细胞仪生产商：
流式细胞仪计算测量DNA 含量实际上是细胞周期的测 量，由于细胞核G1期的DNA含量反应一个细胞的倍性，因 此常用DNA含量来估计细胞倍性，包括DNA的绝对含量或相 对含量。
测量DNA的绝对含量时，须设一个已知DNA含量的标准样 品作对照，来换算出DNA的绝对含量。
样品2C DNA含量=[(样品G0/G1峰均值)/ (标准G0/G1峰均值)] ×标准2C DNA含量(pg DNA)
台式机和大型机
EPICS XL 流式 细胞分简便
使用寿命长
配备1-2根激光 细胞分选速度慢， 主要用于细胞分析
临床型(BD,FACSCalibur台式机)
特点： 分辨率高 选配多种波长和 类型激光器 可把感兴趣细胞 分选到特定培养孔 或板上（4路和24 孔板） 大型机(BD,FACSAria科研型) 适用于高速分选 和多色分析
基于流式细胞术和K-mer_分析的荆芥基因组大小评估
2
特
产
FCM）是 20 世纪 70 年代发展起来的一种利用流式细 胞仪对 DNA 含量进行测定的一种技术，具有方法简 单、快速敏捷、准确性高等优点，已成为测定基因组大 小的主要方法之一[4]。随着测序技术的发展，测序成本 已大幅下降，使全基因组测序成为可能。全基因组调查 （Genome Su快速获得物种的基因组 大小、杂合度和重复序列等相关信息[5]。Midin 等[6]基 于流式细胞术和 K-mer 分析测定了山竹染色体数目 和基因组大小，结果显示山竹染色体数目在 74~110 之 间，基因组大小大概为 5.92 Gb。马鹏举等[7]利用流式 细胞术和 K-mer 分析了油料植物好好芭的基因组大 小，为好好芭基因组学的研究提供了参考。梅启明等[8] 基于流式细胞术和 K-mer 测定了两种车前属植物（车 前和大车前）的基因组大小，结果显示车前的基因组是 大车前基因组的 3 倍。
研
究
2023 年第 45 卷第 6 期
过滤，即得到细胞核悬浮液。在细胞核悬液中添加适当 体积预冷的的碘化丙啶（Propidium iodide, PI）和RNAase 溶液，置于冰上避光染色 0.5~1 h。PI 染液和 RNAase 溶液的工作浓度均为 50 g/mL。
流式细胞仪检测和基因组大小计算 以玉米 和番茄为内参，其基因组大小分别为 2.3 Gb和 900 Mb， 采用内标法测定荆芥细胞核悬浮液和内参样品的细胞 核悬浮液。利用 BD FACScalibur 流式细胞仪对染色后 的细胞核悬浮液样品上机检测，采用 488 nm 蓝光激 发，检测 PI 的发射光荧光强度，每次检测收集 10 000 个颗粒。变异系数 CV%控制在 5%以内，使用 Modifit 3.0 分析软件作图分析。
流式细胞术 ppt课件
✓前向角散射(FS)反映被测细胞的大小，它由 正对着流动室的光电二极管装置，接收并 转变为电信号。
✓侧向角散射(SS)反映被测细胞的细胞膜、细 胞质、核膜的折射率和细胞内颗粒的性状， 它由一个光电倍增管(PMT) 接收并转变为 电信号，这些电信号存储在流式细胞仪的 计算机硬盘或软盘内。
➢荧光信号也有两种：
✓一种是细胞自发荧光，它一般很微弱。
✓一种是细胞样本经标有特异荧光素的单克 隆抗体染色后，经激光激发发出的荧光， 它是我们要测定的荧光，荧光信号较强。
✓这两种荧光信号的同时存在是我们测定时 需要设定阴性对照的理由，以便从测出的 荧光信号中减去细胞自发荧光和抗体非特 异结合产生的荧光。
(1)单参数数据显示和分析
➢ 细胞的每一个单参数测 量数据用直方图来显示
➢ 横坐标表示散射光或荧 光信号相对强度值，其 单位是道数，可以是线 性的，也可以是对数的
➢ 纵坐标表示细胞数。
(2)双参数数据显示和分析：
➢细胞的双参数测量数据和细胞数量的关系 用一维直方图、二维点阵图、假三维地形 图、等高线图和密度图显示和分析。
✓流动室孔径有60μm、100μm、150μm 、 250μm等多种，供检测者选择。小型仪器一 般固定装置了一定孔径的流动室。
➢流动室里的鞘液流一般是稳定流动，控制鞘 液流的装置是在流体力学理论的指导下由一 系列压力系统、压力感受器组成。
➢调整好鞘液压力和标本管压力, 鞘液流包绕 样品流并使样品流保持在液流的轴线方向， 能够保证每个细胞通过激光照射区的时间相 等，从而使激光激发的荧光信息准确无误。Fra bibliotek等高线图
分别是测定细胞的两种荧光双参数数据，横坐标 和纵坐标分别代表一种荧光参数，同理只要设定 “十字门”就可得到两种荧光的各种测定值，密 度图和等高线图较点阵图更直观。
海三棱藨草及其近缘种基因组大小的测定
㊀Ｇｕｉｈａｉａ㊀Ｏｃｔ.２０２３ꎬ４３(１０):１８３８－１８４８ｈｔｔｐ://ｗｗｗ.ｇｕｉｈａｉａ－ｊｏｕｒｎａｌ.ｃｏｍＤＯＩ:１０.１１９３１/ｇｕｉｈａｉａ.ｇｘｚｗ２０２２０９００７邓颢珂ꎬ罗凌ꎬ王若秋ꎬ等ꎬ２０２３.海三棱藨草及其近缘种基因组大小的测定[Ｊ].广西植物ꎬ４３(１０):１８３８－１８４８.ＤＥＮＧＨＫꎬＬＵＯＬꎬＷＡＮＧＲＱꎬｅｔａｌ.ꎬ２０２３.ＧｅｎｏｍｅｓｉｚｅｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆＳｃｉｒｐｕｓｍａｒｉｑｕｅｔｅｒａｎｄｉｔｓｒｅｌａｔｅｄｓｐｅｃｉｅｓ[Ｊ].Ｇｕｉｈａｉａꎬ４３(１０):１８３８－１８４８.海三棱藨草及其近缘种基因组大小的测定邓颢珂１ꎬ２ꎬ罗㊀凌１ꎬ２ꎬ王若秋１ꎬ２ꎬ高少羽１ꎬ２ꎬ张文驹１ꎬ２∗(１.复旦大学生物多样性与生态工程教育部重点实验室ꎬ上海２００４３８ꎻ２.复旦大学上海长江河口湿地生态系统国家野外科学观测研究站ꎬ上海２００４３８)摘㊀要:基因组大小是物种基因组的重要特征ꎬ通常用ＤＮＡＣ值来衡量ꎬ能够用于快速判断基因组倍性ꎬ并为分类学与进化生物学提供重要依据ꎮ海三棱藨草(Ｓｃｉｒｐｕｓｍａｒｉｑｕｅｔｅｒ)是长江口和杭州湾具有重要生态意义的标志性物种ꎬ被认为是扁秆藨草(Ｓ.ｐｌａｎｉｃｕｌｍｉｓ)和藨草(Ｓ.ｔｒｉｑｕｅｔｅｒ)的杂交种ꎬ因染色体小而难以准确确定倍性ꎮ近年来ꎬ部分研究者指出该物种的分类和命名存在疑点ꎮ该研究通过基因组Ｓｕｒｖｅｙ分析检测海三棱藨草样本ＣＪ１的基因组特征ꎬ测序深度约为１２０ˑꎬ并以绿豆(Ｖｉｇｎａｒａｄｉａｔａ)为参考标准ꎬ利用流式细胞术测定了海三棱藨草及其同域近缘种扁秆藨草和藨草以及海三棱藨草和扁秆藨草的杂交Ｆ１共１３个样本的ＤＮＡＣ值和相对倍性ꎮ结果表明:(１)基因组Ｓｕｒｖｅｙ分析测得ＣＪ１的基因组大小为２４４.１２Ｍｂｐꎬ杂合率为０.６８％ꎬ重复序列比例为４２.３８％ꎬＧＣ含量为３７.２５％ꎮ(２)流式细胞术测得来自不同区域的海三棱藨草各样本的基因组倍性相同ꎬ１Ｃ值在２３４.８７~２４２.５Ｍｂｐ之间ꎬ其中ＣＪ１的基因组大小与基因组Ｓｕｒｖｅｙ检测结果高度一致ꎮ(３)扁秆藨草的１Ｃ值在２５１.７７~２６４.１３Ｍｂｐ之间ꎬ藨草１Ｃ值为５３７.３３Ｍｂｐꎮ根据上述基因组大小ꎬ认为海三棱藨草不可能是这两者的杂交种ꎮ该研究补充了海三棱藨草及其近缘种的基因组特征ꎬ为后续全基因组测序奠定基础ꎬ同时也否定了海三棱藨草起源于扁杆藨草和藨草杂交的假说ꎮ关键词:流式细胞术ꎬ基因组大小ꎬ基因组Ｓｕｒｖｅｙ分析ꎬ海三棱藨草ꎬ藨草属中图分类号:Ｑ９４３㊀㊀文献标识码:Ａ㊀㊀文章编号:１０００￣３１４２(２０２３)１０￣１８３８￣１１ＧｅｎｏｍｅｓｉｚｅｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆＳｃｉｒｐｕｓｍａｒｉｑｕｅｔｅｒａｎｄｉｔｓｒｅｌａｔｅｄｓｐｅｃｉｅｓＤＥＮＧＨａｏｋｅ１ꎬ２ꎬＬＵＯＬｉｎｇ１ꎬ２ꎬＷＡＮＧＲｕｏｑｉｕ１ꎬ２ꎬＧＡＯＳｈａｏｙｕ１ꎬ２ꎬＺＨＡＮＧＷｅｎｊｕ１ꎬ２∗(１.ＭｉｎｉｓｔｒｙｏｆＥｄｕｃａｔｉｏｎＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｆｏｒＢｉｏｄｉｖｅｒｓｉｔｙＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＥｃｏｌｏｇｉｃａｌＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇꎬＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＢｉｏｄｉｖｅｒｓｉｔｙＳｃｉｅｎｃｅꎬＦｕｄａｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬＳｈａｎｇｈａｉ２００４３８ꎬＣｈｉｎａꎻ２.ＮａｔｉｏｎａｌＯｂｓｅｒｖａｔｉｏｎｓａｎｄＲｅｓｅａｒｃｈＳｔａｔｉｏｎｆｏｒＷｅｔｌａｎｄＥｃｏｓｙｓｔｅｍｓｏｆｔｈｅＹａｎｇｔｚｅＥｓｔｕａｒｙꎬＦｕｄａｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬＳｈａｎｇｈａｉ２００４３８ꎬＣｈｉｎａ)收稿日期:２０２２－１２－２９基金项目:国家自然科学基金(３２１７０２２５)ꎮ第一作者:邓颢珂(１９９７－)ꎬ硕士研究生ꎬ研究方向为生态与进化生物学ꎬ(Ｅ￣ｍａｉｌ)１９２１０７００００１＠ｆｕｄａｎ.ｅｄｕ.ｃｎꎮ∗通信作者:张文驹ꎬ博士ꎬ教授ꎬ研究方向为生态与进化生物学ꎬ(Ｅ￣ｍａｉｌ)ｗｊｚｈａｎｇ＠ｆｕｄａｎ.ｅｄｕ.ｃｎꎮＡｂｓｔｒａｃｔ:Ｇｅｎｏｍｅｓｉｚｅｉｓａｎｉｍｐｏｒｔａｎｔｆｅａｔｕｒｅｏｆａｓｐｅｃｉｅｓ ｇｅｎｏｍｅａｎｄｉｓｕｓｕａｌｌｙｍｅａｓｕｒｅｄｂｙｔｈｅＤＮＡＣ￣ｖａｌｕｅꎬｗｈｉｃｈｃａｎｂｅｕｓｅｄｆｏｒｑｕｉｃｋｌｙｔｅｓｔｉｎｇｇｅｎｏｍｅｐｌｏｉｄｙａｎｄｐｒｏｖｉｄｅａｎｉｍｐｏｒｔａｎｔｂａｓｉｓｆｏｒｔａｘｏｎｏｍｙａｎｄｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙｂｉｏｌｏｇｙ.ＳｃｉｒｐｕｓｍａｒｉｑｕｅｔｅｒｉｓａｓｐｅｃｉｅｓｗｉｔｈｉｍｐｏｒｔａｎｔｅｃｏｌｏｇｉｃａｌｅｆｆｅｃｔｓｉｎｔｈｅＹａｎｇｔｚｅＲｉｖｅｒｅｓｔｕａｒｙａｎｄＨａｎｇｚｈｏｕＢａｙꎬＣｈｉｎａ.ＩｔｉｓｃｏｎｓｉｄｅｒｅｄａｓａｈｙｂｒｉｄｏｆＳ.ｐｌａｎｉｃｕｌｍｉｓａｎｄＳ.ｔｒｉｑｕｅｔｅｒꎬａｎｄｉｔｉｓｄｉｆｆｉｃｕｌｔｔｏａｃｃｕｒａｔｅｌｙｄｅｔｅｒｍｉｎｅｐｌｏｉｄｙｄｕｅｔｏｉｔｓｓｍａｌｌｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ.ＨｏｗｅｖｅｒꎬｉｎｒｅｃｅｎｔｙｅａｒｓꎬｓｏｍｅｒｅｓｅａｒｃｈｅｒｓꎬｂａｓｅｄｏｎｍｏｌｅｃｕｌａｒｍａｒｋｅｒｓꎬｈａｖｅｒａｉｓｅｄｄｏｕｂｔｓａｂｏｕｔｔｈｅｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅｏｆＳ.ｍａｒｉｑｕｅｔｅｒ.ＴｈｅｒｅｆｏｒｅꎬｍｏｒｅｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｅｖｉｄｅｎｃｅｏｎｔｈｅｔａｘｏｎｏｍｉｃａｔｔｒｉｂｕｔｅｓꎬｇｅｎｏｍｉｃｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓａｎｄｐｏｓｓｉｂｌｅｐｌｏｉｄｙｖａｒｉａｔｉｏｎｏｆＳ.ｍａｒｉｑｕｅｔｅｒａｎｄｉｔｓｒｅｌａｔｅｄｓｐｅｃｉｅｓｉｓｎｅｅｄｅｄ.ＩｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙꎬｔｈｅｇｅｎｏｍｉｃｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｏｆＳ.ｍａｒｉｑｕｅｔｅｒｓａｍｐｌｅＣＪ１ｗｅｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄｂｙｇｅｎｏｍｅｓｕｒｖｅｙａｎａｌｙｓｉｓｗｉｔｈａｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｄｅｐｔｈｏｆａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ１２０ˑ.ＴｈｅＤＮＡＣ￣ｖａｌｕｅａｎｄｒｅｌａｔｉｖｅｐｌｏｉｄｙｏｆ１３ｓａｍｐｌｅｓｏｆＳ.ｍａｒｉｑｕｅｔｅｒａｎｄｉｔｓｓｙｍｐａｔｒｉｃꎬｒｅｌａｔｅｄｓｐｅｃｉｅｓ(Ｓ.ｔｒｉｑｕｅｔｅｒａｎｄＳ.ｐｌａｎｉｃｕｌｍｉｓ)ｗｅｒｅｅｓｔｉｍａｔｅｄｂｙｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙｗｉｔｈＶｉｇｎａｒａｄｉａｔａａｓａｒｅｆｅｒｅｎｃｅ.Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｗｅｒｅａｓｆｏｌｌｏｗｓ:(１)ＧｅｎｏｍｅＳｕｒｖｅｙａｎａｌｙｓｉｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｇｅｎｏｍｅｓｉｚｅｏｆＣＪ１ｗａｓ２４４.１２Ｍｂｐꎬｗｉｔｈａ０.６８％ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｓｉｔｙｒａｔｅꎬ４２.３８％ｓｅｑｕｅｎｃｅｒｅｐｅａｔꎬａｎｄ３７.２５％ＧＣｃｏｎｔｅｎｔ.(２)ＴｈｅｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｐｌｏｉｄｙｏｆＳ.ｍａｒｉｑｕｅｔｅｒｓａｍｐｌｅｓｆｒｏｍｄｉｆｆｅｒｅｎｔｒｅｇｉｏｎｓｗａｓｔｈｅｓａｍｅꎬｗｉｔｈ１Ｃｖａｌｕｅｓｒａｎｇｉｎｇｆｒｏｍ２３４.８７Ｍｂｐｔｏ２４２.５ＭｂｐꎬａｎｄｔｈｅｇｅｎｏｍｅｓｉｚｅｏｆＣＪ１ｗａｓｈｉｇｈｌｙｃｏｎｓｉｓｔｅｎｔｗｉｔｈｔｈｅｇｅｎｏｍｅＳｕｒｖｅｙｒｅｓｕｌｔｓ.(３)Ｔｈｅ１ＣｖａｌｕｅｏｆＳ.ｐｌａｎｉｃｕｌｍｉｓｗａｓｂｅｔｗｅｅｎ２５１.７７Ｍｂｐａｎｄ２６４.１３Ｍｂｐꎬａｎｄｔｈｅ１ＣｖａｌｕｅｏｆＳ.ｔｒｉｑｕｅｔｅｒｗａｓ５３７.３３Ｍｂｐ.ＢｅｃａｕｓｅｔｈｅｇｅｎｏｍｅｓｉｚｅｏｆｈｙｂｒｉｄｓｉｓｕｓｕａｌｌｙｂｅｔｗｅｅｎｏｒｌａｒｇｅｒｔｈａｎｔｈｏｓｅｏｆｔｈｅｉｒｐａｒｅｎｔｓꎬｉｔｉｓｕｎｌｉｋｅｌｙｔｈａｔＳ.ｍａｒｉｑｕｅｔｅｒｉｓａｈｙｂｒｉｄｏｆｔｈｅｔｗｏｓｐｅｃｉｅｓｂａｓｅｄｏｎｔｈｅａｂｏｖｅｍｅｎｔｉｏｎｅｄｇｅｎｏｍｅｓｉｚｅ.ＴｈｉｓｓｔｕｄｙｐｒｏｖｉｄｅｓｇｅｎｏｍｉｃｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｏｆＳ.ｍａｒｉｑｕｅｔｅｒａｎｄｉｔｓｒｅｌａｔｅｄｓｐｅｃｉｅｓａｎｄｌａｙｓａｆｏｕｎｄａｔｉｏｎｆｏｒｉｔｓｗｈｏｌｅ￣ｇｅｎｏｍｅｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ.ＡｔｔｈｅｓａｍｅｔｉｍｅꎬｉｔａｌｓｏｒｅｊｅｃｔｓｔｈｅｈｙｐｏｔｈｅｓｉｓｔｈａｔＳ.ｍａｒｉｑｕｅｔｅｒｏｒｉｇｉｎａｔｅｄｆｒｏｍｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎＳ.ｐｌａｎｉｃｕｌｍｉｓａｎｄＳ.ｔｒｉｑｕｅｔｅｒ.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ:ｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙꎬｇｅｎｏｍｅｓｉｚｅꎬｇｅｎｏｍｅＳｕｒｖｅｙａｎａｌｙｓｉｓꎬＳｃｉｒｐｕｓｍａｒｉｑｕｅｔｅｒꎬＳｃｉｒｐｕｓ㊀㊀海三棱藨草(Ｓｃｉｒｐｕｓｍａｒｉｑｕｅｔｅｒ)是莎草科(Ｃｙｐｅｒａｃｅａｅ)藨草属(Ｓｃｉｒｐｕｓ)的多年生克隆植物ꎬ主要分布在长江口和杭州湾潮间带㊁冲击岛屿和河口泥滩ꎬ其独特的生物学性状使其在河口以及滨海生态系统中发挥着重要的生态学功能(欧善华和宋国元ꎬ１９９２)ꎬ包括促进淤积(Ｙａｎｇꎬ１９９８)ꎬ其球茎和种子为白鹤等迁徙鸟类提供丰富的食物来源(Ｍａｅｔａｌ.ꎬ２００３)ꎬ为底栖动物和鱼类生长繁育提供重要栖息场所等(袁兴中等ꎬ２００２ꎻ张衡等ꎬ２０１７)ꎮ尽管海三棱藨草生态意义重要ꎬ但其分类和命名依然存在争议ꎬＴａｎｇ和Ｗａｎｇ(１９６１)在给其命名时认为它可能是藨草和扁秆藨草的杂交种(Ｓ.ｐｌａｎｉｃｕｌｍｉｓˑＳ.ｔｒｉｑｕｅｔｅｒ)ꎮ方永鑫(１９９２)对海三棱藨草及其假定亲本进行染色体数目分析ꎬ发现藨草２ｎ＝４０ꎬ海三棱藨草２ｎ＝６４ꎬ扁秆藨草２ｎ＝５０ꎬ但仍无法确定海三棱藨草是否为杂交起源ꎬＴａｔａｎｏｖ(２００７)视海三棱藨草为一个属间杂种(ˑＢｏｌｂｏｓｃｈｏｅｎｏｐｌｅｃｔｕｓｍａｒｉｑｕｅｔｅｒ)ꎮ杨梅(２０１０)用ＡＦＬＰ分子标记发现海三棱藨草和藨草之间的遗传距离约是海三棱藨草和扁秆藨草的４倍ꎬ同时ＩＴＳ序列也显示海三棱藨草是一个独立的分类群ꎮ鉴于有些莎草科植物类群即使在种内也常常存在多种倍性(Ｎｉｓｈｉｋａｗａｅｔａｌ.ꎬ１９８４)ꎬ我们在野外观察和同质园实验中也发现海三棱藨草长江口种群和杭州湾种群大部分表型都存在较大差异(李昕骥ꎬ２０１５)ꎬ在对该物种进行全基因测序研究之前ꎬ对该物种分类属性㊁基因组特征及可能的倍性变异需要更多实验研究ꎮ基因组大小(ｇｅｎｏｍｅｓｉｚｅ)能为研究物种间分类和进化提供关键信息(Ｄｏｌｅｚｅｌｅｔａｌ.ꎬ２００７)ꎬ通常用细胞ＤＮＡＣ值(ＤＮＡＣ￣ｖａｌｕｅ)来衡量ꎬ由于ＤＮＡＣ值这一概念存在多种定义(Ｇｒｅｉｌｈｕｂｅｒｅｔａｌ.ꎬ２００５)ꎬ为了避免术语歧义ꎬ本研究的 ＤＮＡＣ值 (简称Ｃ值)采用Ｂｅｎｎｅｔｔ和Ｓｍｉｔｈ(１９７６)的定义ꎬ特指配子细胞核的ＤＮＡ含量(１Ｃ)ꎬ等于未经复制的体细胞的细胞核ＤＮＡ含量(２Ｃ)的一半ꎬ这也是植物ＤＮＡＣ值数据库所采用的标准(Ｌｅｉｔｃｈｅｔａｌ.ꎬ２０１９)ꎮ基因组大小不仅可以用于判断倍性(郗连连等ꎬ２０２０)ꎬ也是确定杂交的重要指标(周香艳ꎬ２００９)ꎬ更是对其进行全基因组高通量测序的基础(伍艳芳等ꎬ２０１４)ꎮ流式细胞术是目前被广泛应用的测定基因组大小的方法之一ꎬ通过记９３８１１０期邓颢珂等:海三棱藨草及其近缘种基因组大小的测定录待测样品和标准品的相对荧光强度计算待测品基因组大小ꎬ快速而简便(Ｄｏｌｅｚｅｌ＆Ｂａｒｔｏｓꎬ２００５ꎻＨａｒｅ＆Ｊｏｈｎｓｔｏｎꎬ２０１２ꎻＪｉｎｇａｄｅｅｔａｌ.ꎬ２０２１)ꎬ这一方法需要精确而合适的参照种ꎮ近年来随着测序技术的提升和成本的下降ꎬ基因组Ｓｕｒｖｅｙ分析逐渐成为测定基因组大小的替代手段(Ｃｈｅｎｅｔａｌ.ꎬ２０１５ꎻ霍恺森等ꎬ２０１９ꎻＭｇｗａｔｙｕｅｔａｌ.ꎬ２０２０)ꎬ这一方法不需要特定的对照样品ꎬ但其费用依然比流式细胞术高很多ꎮ因此ꎬ将上述两者结合起来测定基因组大小不失为较好的方法ꎮ植物ＤＮＡＣ值数据库目前包含１２２７３个物种的Ｃ值(Ｌｅｉｔｃｈｅｔａｌ.ꎬ２０１９)ꎮＣ值的常用单位为ｐｇꎬ但也可以通过１ｐｇ＝９７８Ｍｂｐ进行单位换算ꎮ其中莎草科基因组大小范围很大ꎬ１Ｃ值在１９６~９６５７.９Ｍｂｐ之间(Ｎｉｓｈｉｋａｗａｅｔａｌ.ꎬ１９８４ꎻＫａｕｒｅｔａｌ.ꎬ２０１２)ꎮ测定结果主要集中于薹草属(Ｃａｒｅｘ)的物种ꎮ在藨草属中ꎬ过去的研究只测定了水葱(Ｓ.ｔａｂｅｒｎａｅｍｏｎｔａｎｉ)㊁林生藨草(Ｓ.ｓｙｌｖａｔｉｃｕｓ)㊁沼生水葱(Ｓ.ｌａｃｕｓｔｒｉｓ)的基因组大小(Ｍｏｗｆｏｒｔｈꎬ１９８６ꎻＬｅｉｔｃｈｅｔａｌ.ꎬ２０１９)ꎬ为了更好地保护和利用基因资源ꎬ亟须加强对海三棱藨草及其同域分布的近缘种如藨草(Ｓ.ｔｒｉｑｕｅｔｅｒ)和扁秆藨草(Ｓ.ｐｌａｎｉｃｕｌｍｉｓ)的基因组大小的研究ꎮ本研究以长江口和杭州湾地区的海三棱藨草及其近缘种为研究对象ꎬ通过基因组Ｓｕｒｖｅｙ分析测定海三棱藨草的基因组特征信息ꎬ并以绿豆(Ｖｉｇｎａｒａｄｉａｔａ)为标准品ꎬ通过流式细胞仪测定海三棱藨草及其近缘种和杂交材料共１３个样本的基因组大小ꎬ以探讨以下问题:(１)探究基因组Ｓｕｒｖｅｙ分析与流式细胞术测得藨草属物种基因组大小的准确性ꎻ(２)鉴定海三棱藨草是否起源于扁杆藨草和藨草杂交ꎻ(３)探讨海三棱藨草种内可能的倍性变化和基因组大小变化ꎬ以及基因组大小的进化意义ꎮ本研究旨在扩充藨草属植物基因组数据信息和鉴定海三棱藨草的物种起源ꎬ并为未来的全基因组测序工作提供重要参考信息ꎮ１㊀材料与方法１.１植物材料实验材料见表１ꎬ包括目标种海三棱藨草ꎬ同域分布的近缘种扁秆藨草和藨草ꎬ以及海三棱藨草和扁秆藨草的杂交材料ꎮ上述材料均属于多年生草本克隆植物ꎬ具有有性繁殖和克隆繁殖的能力ꎮ在生长季节ꎬ植株长出花穗并主要通过风媒传粉ꎬ同时一些根茎会在植株的基部发育ꎬ最终长成多个克隆分株ꎮ在秋末ꎬ种子逐渐成熟ꎬ植株地上部分枯死ꎬ地下部分根尖膨大形成球茎ꎮ种子和球茎在次年春天发芽为新苗和克隆分株(Ｓｕｎｅｔａｌ.ꎬ２００１)ꎮ本实验中海三藨草的６个样本为采自长江口地区的ＣＪ１㊁ＣＪ２㊁ＣＪ３和采自杭州湾地区的ＨＺ１㊁ＨＺ２㊁ＨＺ３ꎬ涵盖该物种的整个分布范围和主要的生境类型ꎮ在其他研究工作中ꎬ这些样本在遗传上的差异通过ＲＡＤ测序被确定ꎮ其中ꎬＣＪ１和ＣＪ３采自低盐围垦地ꎬ很少受到潮汐的影响ꎬ因此盐度逐渐降低至０ɢ~０.５ɢꎻＣＪ２和ＨＺ３采自中盐滩涂ꎬ夏季表层平均盐度约５ɢꎻＨＺ１和ＨＺ２采自高盐滩涂ꎬ受潮汐影响较大ꎬ夏季表层水体盐度均值约为１０ɢꎮ扁秆藨草的３个样本采自浙江杭州ꎬ生境水体盐度接近淡水ꎮ海三棱藨草(ɬ)和扁秆藨草(ȶ)杂交材料来源于杨梅等人的杂交实验(Ｙａｎｇｅｔａｌ.ꎬ２０１３)ꎮ藨草的１个样本采自江苏启东(表１)ꎮ上述材料均种植在复旦大学江湾校区玻璃温室ꎬ相同的淡水环境下对所有样品取球茎或地下茎进行克隆繁殖ꎬ待幼苗长至约２０ｃｍ高ꎬ取样品进行后续实验ꎮ１.２海三棱藨草基因组Ｓｕｒｖｅｙ分析１.２.１ＤＮＡ提取和检测㊀提取海三棱藨草样本ＣＪ１的基因组ＤＮＡꎬ紫外可见分光光度计检测ＤＮＡ浓度ꎬ１％琼脂糖凝胶电泳检验ＤＮＡ完整性ꎮ将海三棱藨草样本ＣＪ１的基因组ＤＮＡ送到北京诺禾致源科技有限公司进行基因组Ｓｕｒｖｅｙ分析ꎮ１.２.２建库测序和分析组装㊀将质检后的ＤＮＡ样品随机打断ꎬ经末端修复㊁加Ａ尾㊁加测序接头㊁纯化㊁ＰＣＲ扩增等(Ｒｏｚｅｎ＆Ｓｋａｌｅｔｓｋｙꎬ２０００)构建文库ꎬ对文库进行质量检测ꎬ检测合格后ꎬ通过ＩｌｌｕｍｉｎａＨｉｓｅｑＴＭ２０００平台进行Ｐａｉｒｅｄｅｎｄｓ(ＰＥ)双端测序ꎬ对测序得到的数据进行过滤ꎬ评估ＧＣ分布㊁质量值Ｑ２０㊁Ｑ３０等ꎮ对过滤后的高质量数据进行Ｋ￣ｍｅｒ分析ꎬ以Ｋ￣ｍｅｒ深度为横坐标ꎬＫ￣ｍｅｒ数量频率或Ｋ￣ｍｅｒ种类频率为纵坐标绘制频率分布图ꎬ通过公式(基因组大小＝Ｋ￣ｍｅｒ总数/Ｋ￣ｍｅｒ期望深度)得到海三棱藨草样本ＣＪ１的基因组大小㊁杂合情况和重复序列比例等ꎮ通过Ｓｏａｐｄｅｎｏｖｏ软件(Ｌｉｅｔａｌ.ꎬ２０１０)对基因０４８１广㊀西㊀植㊀物４３卷表１㊀实验材料及来源Ｔａｂｌｅ１㊀Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｎｍａｔｅｒｉａｌｓｕｓｅｄｉｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙ物种Ｓｐｅｃｉｅｓ样本Ｓａｍｐｌｅ采样点Ｓａｍｐｌｉｎｇｌｏｃａｔｉｏｎ生境Ｈａｂｉｔａｔ采样时间Ｓａｍｐｌｉｎｇｔｉｍｅ海三棱藨草ＳｃｉｒｐｕｓｍａｒｉｑｕｅｔｅｒＣＪ１启东ꎬ江苏ＱｉｄｏｎｇꎬＪｉａｎｇｓｕ低盐围垦地Ｌｏｗｓａｌｉｎｉｔｙｒａｃｌａｉｍｅｄｌａｎｄ２０１６ＣＪ２崇明ꎬ上海ＣｈｏｎｇｍｉｎｇꎬＳｈａｎｇｈａｉ中盐滩涂Ｍｅｄｉｕｍｓａｌｉｎｉｔｙｍｕｄｆｌａｔ２０１３ＣＪ３横沙ꎬ上海ＨｅｎｇｓｈａꎬＳｈａｎｇｈａｉ低盐围垦地Ｌｏｗｓａｌｉｎｉｔｙｒａｃｌａｉｍｅｄｌａｎｄ２０１４ＨＺ１乍浦ꎬ浙江ＺｈａｐｕꎬＺｈｅｊｉａｎｇ高盐滩涂Ｈｉｇｈｓａｌｉｎｉｔｙｍｕｄｆｌａｔ２０１６ＨＺ２慈溪ꎬ浙江ＣｉｘｉꎬＺｈｅｊｉａｎｇ高盐滩涂Ｈｉｇｈｓａｌｉｎｉｔｙｍｕｄｆｌａｔ２０１５ＨＺ３宁波ꎬ浙江ＮｉｎｇｂｏꎬＺｈｅｊｉａｎｇ中盐滩涂Ｍｅｄｉｕｍｓａｌｉｎｉｔｙｍｕｄｆｌａｔ２１０５扁秆藨草Ｓ.ｐｌａｎｉｃｕｌｍｉｓＳＰ１杭州ꎬ浙江ＨａｎｇｚｈｏｕꎬＺｈｅｊｉａｎｇ湿地Ｗｅｔｌａｎｄ２００７ＳＰ２杭州ꎬ浙江ＨａｎｇｚｈｏｕꎬＺｈｅｊｉａｎｇ湿地Ｗｅｔｌａｎｄ２００８ＳＰ３杭州ꎬ浙江ＨａｎｇｚｈｏｕꎬＺｈｅｊｉａｎｇ湿地Ｗｅｔｌａｎｄ２００９海三棱藨草(ɬ)ˑ扁秆藨草(ȶ)Ｓ.ｍａｒｉｑｕｅｔｅｒ(ɬ)ˑＳ.ｐｌａｎｉｃｕｌｍｉｓ(ȶ)ＭＰ１复旦大学ꎬ上海ＦｕｄａｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬＳｈａｎｇｈａｉ淡水Ｆｒｅｓｈｗａｔｅｒ２００９ＭＰ２复旦大学ꎬ上海ＦｕｄａｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬＳｈａｎｇｈａｉ淡水Ｆｅｓｈｗａｔｅｒ２００９ＭＰ３复旦大学ꎬ上海ＦｕｄａｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬＳｈａｎｇｈａｉ淡水Ｆｒｅｓｈｗａｔｅｒ２００９藨草Ｓ.ｔｒｉｑｕｅｔｅｒＳＴ１启东ꎬ江苏ＱｉｄｏｎｇꎬＪｉａｎｇｓｕ湿地Ｗｅｔｌａｎｄ２０１６组数据进行初步拼接ꎮ将ＤＮＡ片段随机截断成更小的序列ꎬ利用序列间重叠关系构建ｄｅＢｒｕｉｊｉｎ图ꎬ对ｄｅＢｒｕｉｊｉｎ图进行化简ꎬ截断重复区域边界获得Ｃｏｎｔｉｇ序列ꎬ将Ｃｏｎｔｉｇ序列构建成Ｓｃａｆｆｏｌｄ序列并对其Ｇａｐ区域进行填补ꎮ对组装的Ｃｏｎｔｉｇ绘制ＧＣ含量深度图(Ｌｉｅｔａｌ.ꎬ２０１０)ꎮ１.３流式细胞仪检测藨草属植物基因组大小１.３.１酶和裂解液㊀纤维素酶和果胶酶分别购买自麦克林试剂公司的生物技术级Ｃ６３３９纤维素酶㊁Ｍ６３４６果胶酶ꎬ配置１００ｍＬ２％的酶制剂:称取２ｇ纤维素酶和２ｇ果胶酶ꎬ加纯水定容至１００ｍＬꎬ４ħ保存ꎮ选取Ｇａｌｂｒａｉｔｈ和ＷＰＢ两种裂解液用于细胞核悬液制备ꎬ裂解液购买自青岛捷世康生物科技有限公司所配置好的１００ｍＬ成液ꎬ４ħ保存ꎮＧａｌｂｒａｉｔｈ裂解液和ＷＰＢ裂解液的成分参照汪艳等(２０１５)对多种裂解液的总结ꎮ１.３.２内标和外标㊀采用绿豆作为内标ꎬ绿豆的１Ｃ值为１Ｃ＝０.５３ｐｇ(５１８.３４Ｍｂｐ)(Ｂｅｎｎｅｔｔ＆Ｓｍｉｔｈꎬ１９９１)ꎮ测定藨草属各物种样本的相对倍性时ꎬ以同物种的一个样本(ＣＪ１或ＳＰ１或ＭＰ１)作为外标参考样品ꎮ１.３.３细胞悬液制备㊀细胞核悬液的制备参照Ｄｏｌｅｚｅｌ等(２００３)的实验方法并进行了部分改进ꎮ取新鲜的植物叶片ꎬ洗净并擦干ꎬ切成１ｃｍ左右的小段ꎮ取１.５ｍＬ预先配置的混合均匀的酶溶液置于２ｍＬＥＰ管中ꎻ在使用内标测定时分别加入０.１５ｇ待测植株叶片和０.１５ｇ内标叶片ꎬ使用外标测定时加入０.３ｇ待测植株叶片或外标叶片ꎬ进行１４８１１０期邓颢珂等:海三棱藨草及其近缘种基因组大小的测定３７ħ水浴３０ｍｉｎꎻ转移至培养皿中ꎬ加入０.５ｍＬＧａｌｂｒａｉｔｈ解离液以及０.５ｍＬＷＰＢ解离液ꎬ使用刀片快速切碎并置于室温孵化１５ｍｉｎꎻ通过尼龙膜过滤ꎬ进行５００ｒ ｍｉｎ￣１低速离心５ｍｉｎꎬ取上清液ꎬ再进行２０００ｒ ｍｉｎ￣１高速离心５ｍｉｎꎬ弃去上清液ꎬ加入０.５ｍＬＷＰＢ解离液对细胞核进行重悬ꎻ使用含ＲＮａｓｅＡ的碘化丙啶(ＰＩ)染液对细胞核进行避光染色１５ｍｉｎꎮ每个样品设置３次生物学重复ꎮ１.３.４流式细胞仪检测和分析㊀使用流式细胞仪检测被染色的细胞核的荧光强度ꎮ上机前使用滤膜再次过滤ꎬ并使用ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ软件的ＦＬ￣２荧光通道获取荧光强度ꎮ上机时先调整电压强度ꎬ使得待测样品的Ｇ０/Ｇ１峰均值在５０~１００之间ꎬ调整后保持参数不变ꎬ收集最少１００００个细胞ꎬ每个样品进行３次技术重复ꎮ使用ＭｏｄＦｉｔ软件对收集的数据进行分析ꎬ生成各样品荧光分布直方图ꎬ根据公式[待测植物的基因组大小１Ｃ值(ｐｇ或Ｍｂｐ)＝参考样品的基因组大小１Ｃ值ˑ目标样品Ｇ０/Ｇ１峰荧光均值/参照样品Ｇ０/Ｇ１峰荧光均值]计算１Ｃ值(Ｄｏｌｅｚｅｌｅｔａｌ.ꎬ２００７)ꎬ比较相同物种各样本Ｇ０/Ｇ１峰荧光均值比例以确定物种内是否存在多种倍性ꎮ使用ＳＰＳＳ软件对数据进行统计分析ꎬ使用单因素方差分析比较藨草属植物基因组大小ꎬＦｉｓｈｅｒＬＳＤ多重比较法(Ｐ<０.０５ꎬｎ＝３)对藨草属植物基因组大小进行物种间两两比较ꎮ２㊀结果与分析２.１海三棱藨草样本ＣＪ１基因组Ｓｕｒｖｅｙ分析２.１.１基因组数据统计和特征㊀我们对海三棱藨草样本ＣＪ１的基因组原始数据进行过滤处理ꎬ并获得了高质量数据共３１.１７Ｇꎮ我们采用Ｋ￣ｍｅｒ＝１７进行分析ꎬ频率分布图见图１ꎬ在横坐标Ｋ￣ｍｅｒ深度１０２有一个纯合峰ꎬ即Ｋ￣ｍｅｒ期望深度为１０２(图１)ꎮＫ￣ｍｅｒ总数约２３.６６Ｇꎬ由公式计算得到海三棱藨草样本ＣＪ１基因组大小(１Ｃ)为２４９.０７Ｍｂｐꎬ修正后为２４４.１２Ｍｂｐꎬ杂合率为０.６８％ꎬ重复序列比例为４２.３８％ꎮ２.１.２基因组初步组装结果㊀采用Ｋ￣ｍｅｒ＝４１对海三棱藨草样本ＣＪ１的测序数据进行基因组初步组装ꎬ对大于１００ｂｐ的Ｓｃａｆｆｏｌｄ及其内部的Ｃｏｎｔｉｇ虚线纵坐标对应Ｋ￣ｍｅｒ种类频率ꎬ实线纵坐标对应Ｋ￣ｍｅｒ数量频率ꎮＯｒｄｉｎａｔｅｏｆｔｈｅｄｏｔｔｅｄｌｉｎｅｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｓｔｏＫ￣ｍｅｒｓｐｅｃｉｅｓｆｒｅｑｕｅｎｃｙꎬａｎｄｏｒｄｉｎａｔｅｏｆｔｈｅｓｏｌｉｄｌｉｎｅｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｓｔｏＫ￣ｍｅｒｎｕｍｂｅｒｆｒｅｑｕｅｎｃｙ.图１㊀海三棱藨草样本ＣＪ１的１７￣ｍｅｒ分布曲线Ｆｉｇ.１㊀１７￣ｍｅｒｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｃｕｒｖｅｏｆＳｃｉｒｐｕｓｍａｒｉｑｕｅｔｅｒｓａｍｐｌｅＣＪ１进行统计ꎬ结果见表２ꎬ得到的ＣｏｎｔｉｇＮ５０为９０９６ｂｐꎬ总长为１８８３６４８７７ｂｐꎬ将Ｃｏｎｔｉｇ组装成ＳｃａｆｆｏｌｄＮ５０为１７２８７ｂｐꎬ总长为１８９８１９２１９ｂｐ(表２)ꎮ统计基因组Ｃｏｎｔｉｇ分布和ＧＣ含量信息ꎬ结果见图２ꎮ海三棱藨草样本ＣＪ１的Ｃｏｎｔｉｇ分布在７９左右有最高峰(图２:ＡꎬＣ)ꎬ基因组ＧＣ含量为３７.２５％ꎬＧＣ含量的深度信息显示ＧＣ图存在分离现象(图２:ＢꎬＤꎬＥ)ꎬＣｏｎｔｉｇ和ＮＣＢＩ核酸库比对条数最多的物种均为植物ꎬ而非微生物或昆虫ꎬ表明没有受到外源污染或污染程度低ꎬ可以忽略ꎮ２.２流式细胞仪测定藨草属植物ＤＮＡＣ值以绿豆为内标测定其他藨草属植物(共１３个样本)基因组大小的流式细胞分析图见图３ꎬ换算出各样本的ＤＮＡＣ值见表３ꎬ为了与基因组Ｓｕｒｖｅｙ分析所测基因组大小比较ꎬ流式细胞术所测１Ｃ值统一换算为Ｍｂｐ单位ꎮ由表３可知ꎬ标准品的ＤＮＡ峰平均变异系数(ＣＶ)值大部分在５％以下ꎬ少数在６％左右ꎬ待测样品的ＤＮＡ峰平均ＣＶ值在５.３１％~６.９７％之间ꎮ各藨草属植物１Ｃ值在２３４.８７~５３７.３３Ｍｂｐ之间:海三棱藨草１Ｃ值在２３４.８７~２４２.５０Ｍｂｐ之间ꎬ扁秆藨草１Ｃ值在２５１.７７~２６４.１３Ｍｂｐ之间ꎬ海三棱藨草和扁秆藨草的杂交材料１Ｃ值在２５４.０８~２６３.４４Ｍｂｐꎮ其中ꎬ最大的是藨草样本ＳＴ１[１Ｃ＝(５３７.３３ʃ２２.７５)Ｍｂｐ]ꎬ最小的是海三棱藨草样本ＨＺ１[１Ｃ＝(２３４.８７ʃ４.５３)Ｍｂｐ](图３ꎬ表３)ꎮ２４８１广㊀西㊀植㊀物４３卷表２㊀海三棱藨草样本ＣＪ１的基因组组装结果统计Ｔａｂｌｅ２㊀ＳｔａｔｉｓｔｉｃｓｏｆｔｈｅｇｅｎｏｍｅａｓｓｅｍｂｌｙｒｅｓｕｌｔｓｏｆＳｃｉｒｐｕｓｍａｒｉｑｕｅｔｅｒｓａｍｐｌｅＣＪ１项目Ｔｉｔｌｅ总长Ｔｏｔａｌｌｅｎｇｔｈ(ｂｐ)总数Ｔｏｔａｌｎｕｍｂｅｒ最大长度Ｍａｘｌｅｎｇｔｈ(ｂｐ)Ｎ５０(ｂｐ)Ｎ９０(ｂｐ)Ｃｏｎｔｉｇ１８８３６４８７７１１８２８２９０７０３９０９６７０８Ｓｃａｆｆｏｌｄ１８９８１９２１９９６９４０１４３１６３１７２８７８９０Ａ.Ｃｏｎｔｉｇ覆盖深度和长度分布图ꎻＢ.ＧＣ含量分布ꎬ其横坐标与Ｄ分图横坐标对应ꎻＣ.Ｃｏｎｔｉｇ覆盖深度和数量分布图ꎻＤ.横坐标为ＧＣ含量ꎬ纵坐标为测序深度ꎬ深色代表点密度大的区域ꎻＥ.Ｃｏｎｔｉｇ覆盖深度分布ꎬ其纵坐标与Ｄ分图纵坐标对应ꎮＡ.ＣｏｎｔｉｇｃｏｖｅｒａｇｅｄｅｐｔｈａｎｄｌｅｎｇｔｈｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎꎻＢ.ＧＣｃｏｎｔｅｎｔｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎꎬｉｔｓａｂｓｃｉｓｓａｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｓｔｏｔｈｅａｂｓｃｉｓｓａｏｆＦｉｇ.ＤꎻＣ.ＣｏｎｔｉｇｃｏｖｅｒａｇｅｄｅｐｔｈａｎｄｎｕｍｂｅｒｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎꎻＤ.ＡｂｓｃｉｓｓａｉｓｔｈｅＧＣｃｏｎｔｅｎｔꎬｔｈｅｏｒｄｉｎａｔｅｉｓｔｈｅｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｄｅｐｔｈꎬａｎｄｔｈｅｄａｒｋｃｏｌｏｕｒｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓｔｈｅａｒｅａｗｉｔｈｈｉｇｈｄｏｔｄｅｎｓｉｔｙꎻＥ.ＣｏｎｔｉｇｃｏｖｅｒａｇｅｄｅｐｔｈｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎꎬｉｔｓｏｒｄｉｎａｔｅｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｓｔｏｔｈｅｏｒｄｉｎａｔｅｏｆＦｉｇ.Ｄ.图２㊀海三棱藨草样本ＣＪ１的Ｃｏｎｔｉｇ分布及ＧＣ含量与测序深度关联分析Ｆｉｇ.２㊀ＣｏｎｔｉｇｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎａｎｄｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓｂｅｔｗｅｅｎＧＣｃｏｎｔｅｎｔａｎｄｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｄｅｐｔｈｏｆＳｃｉｒｐｕｓｍａｒｉｑｕｅｔｅｒｓａｍｐｌｅＣＪ１㊀㊀测量的藨草属内不同物种１Ｃ均值从小到大排列为海三棱藨草<杂交材料ʈ扁秆藨草<藨草ꎬ杂交材料１Ｃ均值(２５７.２５Ｍｂｐ)处于父本扁秆藨草(２５９.０８Ｍｂｐ)和母本海三棱藨草(２３８.２８Ｍｂｐ)之间ꎮ对藨草属内不同物种间基因组大小差异进行显著性分析ꎬ结果有显著差异(Ｐ<０.０５ꎬｎ＝３)ꎮ对内标法测得结果进行物种间两两比较ꎬ海三棱藨草与扁秆藨草㊁杂交材料以及藨草之间有显著差异ꎬ扁秆藨草与藨草之间差异显著ꎬ而与杂交材料之间差异不显著(表３)ꎮ测量结果显示同一物种不同样本之间１Ｃ值呈现一定的波动ꎬ但变化较小(表３)ꎬ同一物种各样本和同物种样本１(ＣＪ１或ＳＰ１或ＭＰ１)的１Ｃ值比率在０.９１~１.１６之间ꎬ即同一物种的各样本拥有相同倍性ꎮ３㊀讨论与结论３.１海三棱藨草及其近缘种基因组特征测定本研究首次通过基因组Ｓｕｒｖｅｙ分析对海三棱藨草基因组特征进行了评估ꎬ为流式细胞术测量藨草属植物基因组大小提供参考ꎬ同时Ｓｕｒｖｅｙ分３４８１１０期邓颢珂等:海三棱藨草及其近缘种基因组大小的测定表３㊀利用内标法测定的海三棱藨草及近缘种植物ＤＮＡＣ值及其ＣＶ值Ｔａｂｌｅ３㊀ＤＮＡＣ￣ｖａｌｕｅａｎｄＣＶｖａｌｕｅｏｆＳｃｉｒｐｕｓｍａｒｉｑｕｅｔｅｒａｎｄｉｔｓｒｅｌａｔｅｄｓｐｅｃｉｅｓｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙｔｈｅｉｎｔｅｒｎａｌｓｔａｎｄａｒｄｍｅｔｈｏｄ物种Ｓｐｅｃｉｅｓ样本ＳａｍｐｌｅＤＮＡＣ值１Ｃ(ｘʃｓꎬＭｂｐ)∗样品ＣＶ值ＳａｍｐｌｅＣＶ(ｘʃｓꎬ％)内标ＣＶ值ＩｎｔｅｒｎａｌｓｔａｎｄａｒｄＣＶ(ｘʃｓꎬ％)海三棱藨草Ｓ.ｍａｒｉｑｕｅｔｅｒＣＪ１２４０.４９ʃ１.８７ｃ４.０９ʃ０.５３５.２９ʃ１.２９ＣＪ２２３８.３１ʃ４.２１ｃ６.００ʃ０.８１４.８４ʃ０.９６ＣＪ３２４２.５０ʃ３.０１ｃ５.７５ʃ０.５５４.６６ʃ０.９２ＨＺ１２３４.８７ʃ４.５３ｃ６.３８ʃ０.３０６.３０ʃ０.８２ＨＺ２２３５.０７ʃ１.６９ｃ６.６０ʃ０.１８６.００ʃ０.２８ＨＺ３２３８.４４ʃ５.９３ｃ６.３８ʃ０.１６４.９６ʃ０.７６扁秆藨草Ｓ.ｐｌａｎｉｃｕｌｍｉｓＳＰ１２５１.７７ʃ２.２８ｂ５.３１ʃ０.６６３.８２ʃ０.０６ＳＰ２２６４.１３ʃ０.６３ｂ５.６４ʃ０.３９４.９７ʃ１.０１ＳＰ３２６１.３６ʃ１６.００ｂ６.９７ʃ０.８２３.３３ʃ１.１７海三棱藨草(ɬ)ˑ扁秆藨草(ȶ)Ｓ.ｍａｒｉｑｕｅｔｅｒ(ɬ)ˑＳ.ｐｌａｎｉｃｕｌｍｉｓ(ȶ)ＭＰ１２５４.０８ʃ１１.３８ｂ６.６５ʃ０.３７４.６３ʃ０.０５ＭＰ２２６３.４４ʃ５.５７ｂ５.８０ʃ０.３７４.６９ʃ０.６４ＭＰ３２５４.２３ʃ１４.０２ｂ５.６５ʃ０.６１４.２７ʃ０.７１藨草Ｓ.ｔｒｉｑｕｅｔｅｒＳＴ１５３７.３３ʃ２２.７５ａ６.５３ʃ１.０７４.６６ʃ１.３８㊀注:∗字母(ａꎬｂꎬｃ)不同的数值表示ＬＳＤ检验下存在显著差异(Ｐ<０.０５)ꎮ㊀Ｎｏｔｅ:∗Ｔｈｅｎｕｍｅｒｉｃａｌｖａｌｕｅｓｗｉｔｈｄｉｆｆｅｒｅｎｔｌｅｔｔｅｒｓ(ａꎬｂꎬｃ)ｉｎｄｉｃａｔｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ(Ｐ<０.０５)ａｃｃｏｒｄｉｎｇｔｏＬＳＤｔｅｓｔ.析比流式细胞法能获得更全面的信息ꎬ为后续基因组Ｄｅｎｏｖｏ技术策略的制定提供重要依据ꎮ根据基因组Ｓｕｒｖｅｙ分析获得的海三棱藨草样本ＣＪ１的基因组特征ꎬ判断该物种基因组为低重复㊁高杂合的一般复杂基因组ꎬ可能对组装造成一定影响(霍恺森等ꎬ２０１９)ꎻ其ＧＣ含量所处范围可以降低测序和拼接的偏差(Ａｉｒｄｅｔａｌ.ꎬ２０１１)ꎮ综合以上指标ꎬ后续可以采用全基因组鸟枪法进行基因组组装(霍恺森等ꎬ２０１９)ꎮ本研究还首次利用流式细胞仪测定了海三棱藨草㊁扁秆藨草㊁藨草的基因组的Ｃ值ꎬ海三棱藨草种内基因组大小存在小范围波动ꎬ但变异程度较低(样本间变异系数为１％)ꎬ其中流式细胞术测定的ＣＪ１的Ｃ值与前述利用Ｓｕｒｖｅｙ技术测定的基因组大小值十分接近ꎬ表明本实验测定的Ｃ值较为准确和可靠ꎮ本研究同时采用了内标法和外标法来保证检测流式结果的可靠性ꎬ前者主要用于检测样品Ｃ值ꎬ后者主要用于检测藨草属物种内各样本的相对倍性ꎮ内标法大多数标准品ＤＮＡ峰的ＣＶ值小于５％ꎬ但也有两个标准品ＣＶ值在５％~６.３％之间ꎬ同时待测品ＣＶ值在５.３１％~６.９７％之间ꎮ通常认为不可接受ＣＶ高于５％的测量结果ꎬ但也存在某些富含多酚㊁基因组很小的样品ꎬ无法实现低于５％的ＣＶ值(Ｄｏｌｅｚｅｌｅｔａｌ.ꎬ２００７)ꎮ然而ꎬ外标法测得样品ＤＮＡ峰的ＣＶ值均低于５％ꎬ证实仪器校准㊁取材质量㊁核裂解液成分等和ＣＶ值相关的因素对结果的负面影响较小ꎮ有研究证实ꎬ标准样品的选择也会影响ＣＶ值(Ｄｏｌｅｚｅｌ＆Ｂａｒｔｏｓꎬ２００５ꎻ方其等ꎬ２０１１)ꎬ我们猜测内标法测得ＤＮＡ峰的ＣＶ值略高于５％的结果可能是标准品和待测品混合而致ꎮ需要注意的是ꎬ虽然外标法样品ＤＮＡ峰的ＣＶ值较内标法低ꎬ但每次重复测量之间结果变化较大ꎬ导致标准差偏大ꎬ这可能是因为外标法制备细胞悬液时标准品和待测品为分开进行ꎬ处理时间㊁切碎手法可能有所差异ꎬ上机时测量标准品和待测品之间存在时间间隔也会导致峰值偏移ꎬ内标法更适于基因组大小测定(Ｖｉｎｄｅｌｏｖｅｔａｌ.ꎬ１９８３)ꎬ因此我们优先采用内标法的Ｃ值测量结果ꎮ４４８１广㊀西㊀植㊀物４３卷在Ａ至Ｌ分图中ꎬ以绿豆(Ｖｉｇｎａｒａｄｉａｔａ)为内标ꎻ在Ｍ分图中ꎬ以ＣＪ１为内标ꎬ材料信息见表１ꎮＩｎＦｉｇ.ＡｔｏＬꎬＶｉｇｎａｒａｄｉａｔａｉｓｔｈｅｉｎｔｅｒｎａｌｓｔａｎｄａｒｄꎻｗｈｉｌｅｉｎＦｉｇ.ＭꎬＣＪ１ｉｓｔｈｅｉｎｔｅｒｎａｌｓｔａｎｄａｒｄ.ＳｅｅＴａｂｌｅ１ｆｏｒｍａｔｅｒｉａｌｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ.图３㊀内标法测定的流式细胞分析图Ｆｉｇ.３㊀Ｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙｈｉｓｔｏｇｒａｍｓｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄｂｙｉｎｔｅｒｎａｌｓｔａｎｄａｒｄｍｅｔｈｏｄ３.２基因组大小鉴定海三棱藨草并非扁秆藨草和藨草的杂交种海三棱藨草的发现者根据形态性状的相似性和分布特点ꎬ推测该种可能是藨草和扁秆藨草的杂交种(Ｔａｎｇ＆Ｗａｎｇꎬ１９６１)ꎮ新形成的杂交种基因组大小往往介于父母本之间(Ｂａａｃｋｅｔａｌ.ꎬ２００５ꎻ周香艳ꎬ２００９ꎻ弓娜ꎬ２０１１)ꎬ自然环境中长期形成㊁成熟稳定的杂交种似乎表现出超过亲本基因组大小的普遍倾向(Ｂａａｃｋｅｔａｌ.ꎬ２００５ꎻ周香艳ꎬ２００９ꎻＣｉｃｅｋｅｔａｌ.ꎬ２０１５)ꎬ杂交基因组大小比两个５４８１１０期邓颢珂等:海三棱藨草及其近缘种基因组大小的测定亲本都低的例子似乎较为罕见ꎮ该研究测得海三棱藨草基因组显著低于其两个假定的亲本(藨草和扁秆藨草)ꎬ这从基因组大小层面否定了海三棱藨草是通过藨草与扁杆藨草杂交起源的假说ꎬ这与杨梅根据ＡＦＬＰ研究获得的结果一致(杨梅ꎬ２０１０)ꎮ尽管只检测了藨草的一个样本ꎬ但其他研究者检测到不同分布地区藨草染色体数目十分稳定ꎬ来自印度以及中国的多个样品的染色体数目都在４０~４２条之间(Ｂｉｒ＆Ｓｉｄｈｕꎬ１９９１ꎻ方永鑫ꎬ１９９２ꎻＢｉｒｅｔａｌ.ꎬ１９９３ꎻＨｏｓｈｉｎｏꎬ１９９３)ꎬ因此上述结论应该可靠ꎮ此外ꎬ本研究测定了海三棱藨草与扁秆藨草人工杂交Ｆ１的Ｃ值ꎬ杂交材料１Ｃ均值处于父母本之间ꎬ略大于两者之和的一半ꎬ与通常研究结果一致ꎬ也支持上述结果ꎮ本研究人工杂交材料偏向于基因组更大的父本扁秆藨草ꎬ而杂交材料与海三棱藨草基因组大小显著的差异意味着更容易辨别海三棱藨草和杂交类型ꎮ３.３海三棱藨草基因组大小与生境关联以往研究表明基因组大小与其地理位置㊁气候条件密切相关(Ｓｍｉｔｈ＆Ｇｒｅｇｏｒｙꎬ２００９)ꎬ这种差异甚至也存在于物种内(Ｃａｖａｌｌｉｎｉ＆Ｎａｔａｌｉꎬ１９９４)ꎬ特别是同一物种也可能存在不同倍性的类型ꎮ本实验所采集的海三棱藨草样品来自十分不同的生境且覆盖该种的主要分布区域ꎬ检测的海三棱藨草各样本拥有相同的倍性ꎬ表明该物种的基因组倍性较为稳定ꎮ但是ꎬ我们把海三棱藨草６个样本按基因组大小从小到大排列时ꎬ其基因大小似乎表现出和生境类型之间的联系:来自低盐围垦地的ＣＪ１和ＣＪ３基因组最大ꎬ来自中盐滩涂的ＣＪ２和ＨＺ３基因组次之ꎬ来自高盐滩涂的ＨＺ１和ＨＺ２基因组最小ꎮ我们猜测这种排序可能是由生境盐度而导致ꎬ较小基因组和较大生境压力的关联并不是个例(Ｐｒｉｃｅｅｔａｌ.ꎬ１９８１ꎻＰｒｉｃｅꎬ１９８８ꎻＣａｓｔｒｏｊｉｍｅｎｅｚｅｔａｌ.ꎬ１９８９)ꎮ例如ꎬＰｒｉｃｅ等(１９８１)测定加州２４个植物种群的基因组大小发现基因组较大的植物种群处于土壤发育良好的生境中ꎮ因此我们推测ꎬ海三棱藨草基因组大小的分布式样可能是受自然选择产生的适应性分化ꎬ盐度对ＤＮＡ合成的限制可能是高盐环境下倾向于小基因组植物的内在原因(Ｌａｚａｒｅｖｉｃ'ｅｔａｌ.ꎬ２０１５ꎻＺａｈｒａｄｎíｃ㊅ｅｋｅｔａｌ.ꎬ２０１８)ꎮ但是ꎬ本研究每一类生境只测定了两个样本ꎬ这一物种的Ｃ值与盐度的关系还需测定更多样本才能确认ꎮ参考文献:ＡＩＲＤＤꎬＲＯＳＳＭＧꎬＣＨＥＮＷＳꎬｅｔａｌ.ꎬ２０１１.ＡｎａｌｙｚｉｎｇａｎｄｍｉｎｉｍｉｚｉｎｇＰＣＲａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｂｉａｓｉｎＩｌｌｕｍｉｎａｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｌｉｂｒａｒｉｅｓ[Ｊ].ＧｅｎｏｍｅＢｉｏｌꎬ１２(２):１－１４.ＢＡＡＣＫＥＪꎬＷＨＩＴＮＥＹＫＤꎬＲＩＥＳＥＢＥＲＧＬＨꎬ２００５.Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎａｎｄｇｅｎｏｍｅｓｉｚｅｅｖｏｌｕｔｉｏｎ:ＴｉｍｉｎｇａｎｄｍａｇｎｉｔｕｄｅｏｆｎｕｃｌｅａｒＤＮＡｃｏｎｔｅｎｔｉｎｃｒｅａｓｅｓｉｎＨｅｌｉａｎｔｈｕｓｈｏｍｏｐｌｏｉｄｈｙｂｒｉｄｓｐｅｃｉｅｓ[Ｊ].ＮｅｗＰｈｙｔｏｌꎬ１６７(２):６２３－６３０.ＢＥＮＮＥＴＴＭＤꎬＳＭＩＴＨＪＢꎬ１９９１.ＮｕｃｌｅａｒＤＮＡａｍｏｕｎｔｓｉｎａｎｇｉｏｓｐｅｒｍｓ[Ｊ].ＰｈｉｌＴｒａｎｓＲｏｙＳｏｃＢ￣ＢｉｏｌＳｃｉꎬ３３４(１２７１):３０９－３４５.ＢＥＮＮＥＴＴＭＤꎬＳＭＩＴＨＪＢꎬ１９７６.ＮｕｃｌｅａｒＤＮＡａｍｏｕｎｔｓｉｎａｎｇｉｏｓｐｅｒｍｓ[Ｊ].ＰｈｉｌＴｒａｎｓＲｏｙＳｏｃＢ￣ＢｉｏｌＳｃｉꎬ２７４(９３３):２２７－２７４.ＢＩＲＳＳꎬＣＨＥＥＭＡＰꎬＳＩＤＨＵＭꎬｅｔａｌ.ꎬ１９９３.ＫａｒｙｏｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙｏｆｍｅｍｂｅｒｓｏｆＢｕｌｂｏｓｔｙｌｉｓＫｕｎｔｈａｎｄＳｃｉｒｐｕｓＬｉｎｎ.ｆｒｏｍＰｕｎｊａｂＳｔａｔｅꎬｎｏｒｔｈＩｎｄｉａ[Ｊ].ＰｒｏｃＩｎｄＮａｔｌＳｃｉＡｃａｄＰａｒｔＢꎬ５９(２):１４７－１５１.ＢＩＲＳＳꎬＳＩＤＨＵＭꎬ１９９１.ＣｙｔｏｌｏｇｉｃａｌｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎｓｏｎＳｃｉｒｐｕｓＬｉｎｎ.ｆｒｏｍｎｏｒｔｈＩｎｄｉａ[Ｊ].Ｃｙｔｏｌｏｇｉａꎬ５６(４):６４５－６５１.ＣＡＳＴＲＯＪＩＭＥＮＥＺＹꎬＮＥＷＴＯＮＲＪꎬＰＲＩＣＥＨＪꎬｅｔａｌ.ꎬ１９８９.ＤｒｏｕｇｈｔｓｔｒｅｓｓｒｅｓｐｏｎｓｅｓｏｆｍｉｃｒｏｓｅｒｉｓｓｐｅｃｉｅｓｄｉｆｆｅｒｉｎｇｉｎｎｕｃｌｅａｒＤＮＡｃｏｎｔｅｎｔ[Ｊ].ＡｍｅｒＪＢｏｔꎬ７６(６):７８９－７９５.ＣＡＶＡＬＬＩＮＩＡꎬＮＡＴＡＬＩＬꎬ１９９４.Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｅｎｄｏ￣ｒｅｄｕｐｌｉｃａｔｉｏｎｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙｉｎｃｕｌｔｉｖａｒｓｏｆＰｉｓｕｍｓａｔｉｖｕｍＬ.ａｎｄｉｔｓｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｔｏｂａｓｉｃｇｅｎｏｍｅｓｉｚｅ[Ｊ].Ｃｙｔｏｂｉｏｓꎬ７９(３１８):１８１－１８８.ＣＨＥＮＷＢꎬＨＡＳＥＧＡＷＡＤＫꎬＡＲＵＭＵＧＡＮＡＴＨＡＮＫꎬｅｔａｌ.ꎬ２０１５.ＥｓｔｉｍａｔｉｏｎｏｆｔｈｅＷｈｉｔｅｆｌｙＢｅｍｉｓｉａｔａｂａｃｉｇｅｎｏｍｅｓｉｚｅｂａｓｅｄｏｎｋ￣ｍｅｒａｎｄｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃａｎａｌｙｓｅｓ[Ｊ].Ｉｎｓｅｃｔｓꎬ６(３):７０４－７１５.ＣＩＣＥＫＭꎬＹＡＰＲＡＫＡＥꎬＡＬＡＮＡＲꎬ２０１５.ＭｏｒｐｈｏｍｅｔｒｉｃａｎｄｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃｅｖａｌｕａｔｉｏｎｓｏｆａｐｕｔａｔｉｖｅｎａｔｕｒａｌｈｙｂｒｉｄｏｆＣｅｎｔａｕｒｉｕｍ(Ｇｅｎｔｉａｎａｃｅａｅ)ｆｒｏｍＴｕｒｋｅｙ[Ｊ].Ｐｈｙｔｏｔａｘａꎬ２０４(１):２２－３２.ＤＯＬＥＺＥＬＪꎬＢＡＲＴＯＳＪꎬＶＯＧＬＭＡＹＲＨꎬｅｔａｌ.ꎬ２００３.ＮｕｃｌｅａｒＤＮＡｃｏｎｔｅｎｔａｎｄｇｅｎｏｍｅｓｉｚｅｏｆｔｒｏｕｔａｎｄｈｕｍａｎ[Ｊ].ＣｙｔｏｍｅｔｒｙＰａｒｔＡꎬ５１(２):１２７－１２８.ＤＯＬＥＺＥＬＪꎬＢＡＲＴＯＳＪꎬ２００５.ＰｌａｎｔＤＮＡｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙａｎｄｅｓｔｉｍａｔｉｏｎｏｆｎｕｃｌｅａｒｇｅｎｏｍｅｓｉｚｅ[Ｊ].ＡｎｎＢｏｔꎬ９５(１):９９－１１０.ＤＯＬＥＺＥＬＪꎬＧＲＥＩＬＨＵＢＥＲＪꎬＳＵＤＡＪꎬ２００７.ＥｓｔｉｍａｔｉｏｎｏｆｎｕｃｌｅａｒＤＮＡｃｏｎｔｅｎｔｉｎｐｌａｎｔｓｕｓｉｎｇｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙ[Ｊ].ＮａｔＰｒｏｔｏｃꎬ２(９):２２３３－２２４４.ＦＡＮＧＱꎬＹＩＮＬＰꎬＧＵＯＳＬꎬ２０１１.Ｏｎｅｍｅｔｈｏｄａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆ６４８１广㊀西㊀植㊀物４３卷ｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙｔｏｄｅｔｅｒｍｉｎｅｐｌａｎｔＤＮＡＣ￣ｖａｌｕｅ[Ｊ].ＰｌａｎｔＱｕａｒꎬ２５(２):４０－４４.[方其ꎬ印丽萍ꎬ郭水良ꎬ２０１１.应用流式细胞术测定植物ＤＮＡＣ－值的实验方法研究[Ｊ].植物检疫ꎬ２５(２):４０－４４.]ＦＡＮＧＹＸꎬ１９９２.ＴｈｅｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｎｕｍｂｅｒｓｏｆｔｈｒｅｅｓｐｅｃｉｅｓｏｆｇｅｎｕｓＳｃｉｒｐｕｓ[Ｃ]//ＯＵＳＨ.ＡｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｏｆｒｅｓｅａｒｃｈｐａｐｅｒｓｏｎｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｏｆＳｃｉｒｐｕｓｍａｒｉｑｕｅｔｅｒａｎｄｉｔｓｓｉｌｔ￣ｐｒｏｍｏｔｉｎｇｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙｉｎｔｈｅｃｏａｓｔａｌｔｉｄａｌｆｌａｔｓｉｎＳｈａｎｇｈａｉ.Ｓｈａｎｇｈａｉ:ＪＳｈａｎｇｈａｉＮｏｒｍＵｎｉｖ(ＮａｔＳｃｉ):４９－５２.[方永鑫ꎬ１９９２.藨草属三种植物的染色体[Ｃ]//欧善华.上海市海岸带滩涂海三棱藨草种群特征及其促淤效能研究论文集.上海:上海师范大学学报(自然科学版):４９－５２.]ＧＯＮＧＮꎬ２０１１.ＶａｒｉａｔｉｏｎｓｉｎｔｈｅｎｕｃｌｅａｒＤＮＡｃｏｎｔｅｎｔｏｆｔｈｅｈｏｍｏｐｌｏｉｄｈｙｂｒｉｄｓｐｅｃｉｅｓｉｎＳｅｎｅｃｉｏ[Ｄ].Ｌａｎｚｈｏｕ:ＬａｎｚｈｏｕＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ:１－３０.[弓娜ꎬ２０１１.千里光属同倍体杂交物种核ＤＮＡ含量变异[Ｄ].兰州:兰州大学:１－３０.]ＧＲＥＩＬＨＵＢＥＲＪꎬＤＯＬＥŽＥＬＪꎬＬＹＳÁＫＭＡꎬｅｔａｌ.ꎬ２００５.Ｔｈｅｏｒｉｇｉｎꎬｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｎｄｐｒｏｐｏｓｅｄｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｔｅｒｍｓ ｇｅｎｏｍｅｓｉｚｅ ａｎｄ Ｃ￣ｖａｌｕｅ ｔｏｄｅｓｃｒｉｂｅｎｕｃｌｅａｒＤＮＡｃｏｎｔｅｎｔｓ[Ｊ].ＡｎｎＢｏｔꎬ９５(１):２５５－２６０.ＨＡＲＥＥＥꎬＪＯＨＮＳＴＯＮＪＳꎬ２０１２.Ｇｅｎｏｍｅｓｉｚｅｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｕｓｉｎｇｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙｏｆｐｒｏｐｉｄｉｕｍｉｏｄｉｄｅ￣ｓｔａｉｎｅｄｎｕｃｌｅｉ[Ｍ]//ＯＲＧＯＧＯＺＯＶꎬＲＯＣＫＭＡＮＭ.Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｍｅｔｈｏｄｓｆｏｒｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙｇｅｎｅｔｉｃｓ.Ｔｏｔｏｗａ:ＨｕｍａｎａＰｒｅｓｓ:３－１２.ＨＯＳＨＩＮＯＴꎬ１９９３.ＣｙｔｏｌｏｇｉｃａｌｓｔｕｄｉｅｓｏｆＣｈｉｎｅｓｅＣｙｐｅｒａｃｅａｅ(１).ＣｈｒｏｍｏｓｏｍｅｃｏｕｎｔｓｏｆｎｉｎｅｓｐｅｃｉｅｓｃｏｌｌｅｃｔｅｄｆｒｏｍＪｉｌｉｎꎬＬｉａｏｎｉｎｇａｎｄＨｅｂｅｉｐｒｏｖｉｎｃｅｓ[Ｊ].ＪＪａｐＢｏｔꎬ６８(２):６５－６９.ＨＵＯＫＳꎬＣＡＯＱＨꎬＷＡＮＧＹꎬｅｔａｌ.ꎬ２０１９.ＧｅｎｏｍｅｓｕｒｖｅｙａｎａｌｙｓｉｓｏｆｒｅｌａｔｉｖｅｗｉｌｄｓｐｅｃｉｅｓＩｐｏｍｏｅａｌｉｔｔｏｒａｌｉｓｉｎｓｗｅｅｔｐｏｔａｔｏ[Ｊ].ＣｈｉｎＪＴｒｏｐＣｒｏｐｓꎬ４０(１０):２００１－２００５.[霍恺森ꎬ曹清河ꎬ王珧ꎬ等ꎬ２０１９.甘薯近缘野生种Ｉｐｏｍｏｅａｌｉｔｔｏｒａｌｉｓ全基因组Ｓｕｒｖｅｙ分析[Ｊ].热带作物学报ꎬ４０(１０):２００１－２００５.]ＪＩＮＧＡＤＥＰꎬＨＵＤＥＤＡꎬＭＩＳＨＲＡＭＫꎬ２０２１.Ｆｉｒｓｔｒｅｐｏｒｔｏｎｇｅｎｏｍｅｓｉｚｅａｎｄｐｌｏｉｄｙｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｆｉｖｅｉｎｄｉｇｅｎｏｕｓｃｏｆｆｅｅｓｐｅｃｉｅｓｕｓｉｎｇｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙａｎｄｓｔｏｍａｔａｌａｎａｌｙｓｉｓ[Ｊ].ＢｒａｚＪＢｏｔꎬ４４(２):３８１－３８９.ＫＡＵＲＮꎬＤＡＴＳＯＮＰＭꎬＭＵＲＲＡＹＢＧꎬ２０１２.ＧｅｎｏｍｅｓｉｚｅａｎｄｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｎｕｍｂｅｒｉｎｔｈｅＮｅｗＺｅａｌａｎｄｓｐｅｃｉｅｓｏｆＳｃｈｏｅｎｕｓ(Ｃｙｐｅｒａｃｅａｅ)[Ｊ].ＢｏｔＪＬｉｎｎＳｏｃꎬ１６９(３):５５５－５６４.ＬＡＺＡＲＥＶＩＣ'ＭꎬＫＵＺＭＡＮＯＶＩＣ'ＮꎬＬＡＫＵŠＩＣ'Ｄꎬｅｔａｌ.ꎬ２０１５.ＰａｔｔｅｒｎｓｏｆｃｙｔｏｔｙｐｅｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎａｎｄｇｅｎｏｍｅｓｉｚｅｖａｒｉａｔｉｏｎｉｎｔｈｅｇｅｎｕｓＳｅｓｌｅｒｉａＳｃｏｐ.(Ｐｏａｃｅａｅ)[Ｊ].ＢｏｔＪＬｉｎｎＳｏｃꎬ１７９(１):１２６－１４３.ＬＥＩＴＣＨＩＪꎬＪＯＨＮＳＴＯＮＥꎬＰＥＬＬＩＣＥＲＪꎬｅｔａｌ.ꎬ２０１９.ＰｌａｎｔＤＮＡＣ￣ｖａｌｕｅｓＤａｔａｂａｓｅ[ＥＢ/ＯＬ].Ｒｅｌｅａｓｅ７.１.ｈｔｔｐｓ://ｃｖａｌｕｅｓ.ｓｃｉｅｎｃｅ.ｋｅｗ.ｏｒｇ/.ＬＩＲꎬＺＨＵＨꎬＲＵＡＮＪꎬｅｔａｌ.ꎬ２０１０.Ｄｅｎｏｖｏａｓｓｅｍｂｌｙｏｆｈｕｍａｎｇｅｎｏｍｅｓｗｉｔｈｍａｓｓｉｖｅｌｙｐａｒａｌｌｅｌｓｈｏｒｔｒｅａｄｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ[Ｊ].ＧｅｎｏｍｅＲｅｓꎬ２０(２):２６５－２７２.ＬＩＸＪꎬ２０１５.ＥｃｏｌｏｇｉｃａｌａｄａｐｔａｔｉｏｎｏｆＳｃｉｒｐｕｓｍａｒｉｑｕｅｔｅｒｉｎｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｓｏｆｅｓｔｕａｒｉｅｓ[Ｄ].Ｓｈａｎｇｈａｉ:ＦｕｄａｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ:１－７０.[李昕骥ꎬ２０１５.海三棱藨草在河口异质性生境下的生态适应性[Ｄ].上海:复旦大学:１－７０.]ＭＡＺＪꎬＬＩＢꎬＪＩＮＧＫꎬｅｔａｌ.ꎬ２００３.Ｅｆｆｅｃｔｓｏｆｔｉｄｅｗａｔｅｒｏｎｔｈｅｆｅｅｄｉｎｇｅｃｏｌｏｇｙｏｆｈｏｏｄｅｄｃｒａｎｅ(Ｇｒｕｓｍｏｎａｃｈａ)ａｎｄｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｉｒｗｉｎｔｅｒｉｎｇｈａｂｉｔａｔｓａｔＣｈｏｎｇｍｉｎｇＤｏｎｇｔａｎꎬＣｈｉｎａ[Ｊ].ＥｃｏｌＲｅｓꎬ１８(３):３２１－３２９.ＭＧＷＡＴＹＵＹꎬＳＴＡＮＤＥＲＡＡꎬＦＥＲＲＥＩＲＡＳꎬｅｔａｌ.ꎬ２０２０.Ｒｏｏｉｂｏｓ(Ａｓｐａｌａｔｈｕｓｌｉｎｅａｒｉｓ)ｇｅｎｏｍｅｓｉｚｅｅｓｔｉｍａｔｉｏｎｕｓｉｎｇｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙａｎｄｋ￣ｍｅｒａｎａｌｙｓｅｓ[Ｊ].Ｐｌａｎｔｓꎬ９(２):２７０.ＭＯＷＦＯＲＴＨＭＡꎬ１９８６.ＶａｒｉａｔｉｏｎｉｎｎｕｃｌｅａｒＤＮＡａｍｏｕｎｔｓｉｎｆｌｏｗｅｒｉｎｇｐｌａｎｔｓ:ａｎｅｃｏｌｏｇｉｃａｌａｎａｌｙｓｉｓ[Ｄ].Ｓｈｅｆｆｉｅｌｄ:ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＳｈｅｆｆｉｅｌｄ:１－１０.ＮＩＳＨＩＫＡＷＡＫꎬＦＵＲＵＴＡＹꎬＩＳＨＩＴＯＢＡＫꎬ１９８４.ＣｈｒｏｍｏｓｏｍａｌｅｖｏｌｕｔｉｏｎｉｎｇｅｎｕｓＣａｒｅｘａｓｖｉｅｗｅｄｆｒｏｍｎｕｃｌｅａｒＤＮＡｃｏｎｔｅｎｔꎬｗｉｔｈｓｐｅｃｉａｌｒｅｆｅｒｅｎｃｅｔｏｉｔｓａｎｅｕｐｌｏｉｄｙ[Ｊ].ＪｐｎＪＧｅｎｅｔꎬ５９(５):４６５－４７２.ＯＵＳＨꎬＳＯＮＧＧＹꎬ１９９２.ＴｈｅｓｐｅｃｉａｌｓｉｔｕａｔｉｏｎｏｆＳｅａ￣ｂｕｌｒｕｓｈ(Ｓｃｉｒｐｕｓｍａｒｉｑｕｅｔｅｒ)ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｉｎＳｈａｎｇｈａｉ[Ｃ]//ＯＵＳＨ.ＡｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｏｆｒｅｓｅａｒｃｈｐａｐｅｒｓｏｎｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｏｆＳｃｉｒｐｕｓｍａｒｉｑｕｅｔｅｒａｎｄｉｔｓｓｉｌｔ￣ｐｒｏｍｏｔｉｎｇｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙｉｎｔｈｅｃｏａｓｔａｌｔｉｄａｌｆｌａｔｓｉｎＳｈａｎｇｈａｉ.Ｓｈａｎｇｈａｉ:ＪＳｈａｎｇｈａｉＮｏｒｍＵｎｉｖ(ＮａｔＳｃｉ):１－３.[欧善华ꎬ宋国元ꎬ１９９２.海三棱藨草种群在上海的特殊地位[Ｃ]//欧善华.上海市海岸带滩涂海三棱藨草种群特征及其促淤效能研究论文集.上海:上海师范大学学报(自然科学版):１－３.]ＰＲＩＣＥＨＪꎬ１９８８.ＤＮＡｃｏｎｔｅｎｔｖａｒｉａｔｉｏｎａｍｏｎｇｈｉｇｈｅｒｐｌａｎｔｓ[Ｊ].ＡｎｎＭｏＢｏｔＧａｒｄꎬ７５(４):１２４８－１２５７.ＰＲＩＣＥＨＪꎬＣＨＡＭＢＥＲＳＫＬꎬＢＡＣＨＭＡＮＮＫꎬ１９８１.ＧｅｏｇｒａｐｈｉｃａｎｄｅｃｏｌｏｇｉｃａｌｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｏｆｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡｃｏｎｔｅｎｔｖａｒｉａｔｉｏｎｉｎＭｉｃｒｏｓｅｒｉｓｄｏｕｇｌａｓｉｉ(Ａｓｔｅｒａｃｅａｅ) 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ｂｉｏｌｏｇｙｏｆＳｃｉｒｐｕｓˑｍａｒｉｑｕｅｔｅｒａｎｄｉｔｓｇｅｎｅｔｉｃｓｔｒｕｃｔｕｒｅｉｎＣｈｉｎａ[Ｄ].Ｓｈａｎｇｈａｉ:ＦｕｄａｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ:１－９７.[杨梅ꎬ２０１０.海三棱藨草的物种生物学和遗传结构研究[Ｄ].上海:复旦大学:１－９７.]ＹＡＮＧＳＬꎬ１９９８.ＴｈｅｒｏｌｅｏｆＳｃｉｒｐｕｓｍａｒｓｈｉｎａｔｔｅｎｕａｔｉｏｎｏｆｈｙｄｒｏｄｙｎａｍｉｃｓａｎｄｒｅｔｅｎｔｉｏｎｏｆｆｉｎｅｓｅｄｉｍｅｎｔｉｎｔｈｅｙａｎｇｔｚｅｅｓｔｕａｒｙ[Ｊ].ＥｓｔｕａｒＣｏａｓｔＳｈｅｌｆＳｃｉꎬ４７(２):２２７－２３３.ＹＵＡＮＸＺꎬＬＵＪＪꎬＬＩＵＨꎬ２００２.ＩｎｆｌｕｅｎｃｅｏｆｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｏｆＳｃｉｒｐｕｓｍａｒｉｑｕｅｔｅｒｃｏｍｍｕｎｉｔｙｏｎｔｈｅｂｅｎｔｈｉｃｍａｃｒｏ￣ｉｎｖｅｒｔｅｂｒａｔｅｉｎａｓａｌｔｍａｒｓｈｏｆｔｈｅＣｈａｎｇｊｉａｎｇＥｓｔｕａｒｙ[Ｊ].ＡｃｔａＥｃｏｌＳｉｎꎬ２２(３):３２６－３３３.[袁兴中ꎬ陆健健ꎬ刘红ꎬ２００２.河口盐沼植物对大型底栖动物群落的影响[Ｊ].生态学报ꎬ２２(３):３２６－３３３.]ＺＡＨＲＡＤＮÍＣ㊅ＥＫＪꎬＣＨＲＴＥＫＪꎬＦＥＲＲＥＩＲＡＭＺꎬｅｔａｌ.ꎬ２０１８.ＧｅｎｏｍｅｓｉｚｅｖａｒｉａｔｉｏｎｉｎｔｈｅｇｅｎｕｓＡｎｄｒｙａｌａ(ＨｉｅｒａｃｉｉｎａｅꎬＡｓｔｅｒａｃｅａｅ)[Ｊ].ＦｏｌｉａＧｅｏｂｏｔꎬ５３(４):４２９－４４７.ＺＨＡＮＧＨꎬＣＨＥＮＹＹꎬＹＥＪＹꎬｅｔａｌ.ꎬ２０１７.ＭｏｎｔｈｌｙｖａｒｉａｔｉｏｎｏｆｆｉｓｈｓｐｅｃｉｅｓｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｎｄｑｕａｎｔｉｔｙｉｎｔｈｅｈａｂｉｔａｔｏｆＰｈｒａｇｍｉｔｅｓａｕｓｔｒａｌｉｓａｎｄＳｃｉｒｐｕｓｍａｒｉｑｕｅｔｅｒｉｎＤｏｎｇｔａｎｗｅｔｌａｎｄｏｆＣｈａｎｇｊｉａｎｇｅｓｔｕａｒｙ[Ｊ].ＭａｒＦｉｓｈꎬ３９(５):５００－５０７.[张衡ꎬ陈渊戈ꎬ叶锦玉ꎬ等ꎬ２０１７.长江口东滩湿地芦苇和海三棱藨草生境下的鱼类种类组成和数量的月变化[Ｊ].海洋渔业ꎬ３９(５):５００－５０７.]ＺＨＯＵＸＹꎬ２００９.ＴｈｅｓｔｕｄｙｏｆｔｈｅｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｂｅｔｗｅｅｎｎｕｃｌｅａｒＤＮＡｃｏｎｔｅｎｔｏｆＨｉｐｐｏｐｈａｅＬ.ｓｐｅｃｉｅｓａｎｄｔｈｅｉｒｈｙｂｒｉｄｏｒｉｇｉｎ[Ｄ].Ｌａｎｚｈｏｕ:ＬａｎｚｈｏｕＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ:１－３０.[周香艳ꎬ２００９.沙棘核ＤＮＡ含量与杂交种起源的相关性研究[Ｄ].兰州:甘肃农业大学:１－３０.](责任编辑㊀李㊀莉)８４８１广㊀西㊀植㊀物４３卷。
流式细胞术实验报告
流式细胞术实验报告流式细胞术实验报告引言流式细胞术（Flow Cytometry）是一种广泛应用于生物学研究和临床诊断的技术。
它通过测量细胞在流动过程中的荧光信号，可以快速、准确地分析细胞的数量、大小、形态和功能等特征。
本实验旨在利用流式细胞术对细胞进行表型分析，并研究不同条件下细胞的变化。
材料与方法1. 细胞样本准备：从培养皿中取出细胞，用PBS洗涤，离心沉淀后，再用PBS 悬浮细胞，使其浓度达到所需的范围。
2. 细胞染色：将细胞悬浮液分装于离心管中，加入适量的荧光标记染料，轻轻摇匀，避免产生气泡。
3. 流式细胞术仪器设置：根据实验需要，调整流式细胞术仪器的参数，如激光功率、荧光信号检测通道等。
4. 样本检测：将细胞悬浮液注入流式细胞术仪器，开始检测。
记录细胞的散射信号和荧光信号，并设置相应的控制样本。
5. 数据分析：利用流式细胞术软件对获得的数据进行分析，包括细胞数量、比例、荧光强度等参数。
结果与讨论通过流式细胞术实验，我们成功地对细胞进行了表型分析，并观察到不同条件下细胞的变化。
以下是我们的结果和讨论。
1. 细胞数量和比例的变化我们首先对细胞数量和比例进行了分析。
结果显示，在不同处理条件下，细胞数量和比例存在显著差异。
例如，在处理A条件下，细胞数量明显增加，而在处理B条件下，细胞数量有所下降。
这表明不同条件对细胞生长和增殖有不同的影响。
2. 细胞大小和形态的变化我们进一步分析了细胞的大小和形态的变化。
通过测量细胞的散射信号，我们可以得到细胞的大小和形态信息。
结果显示，在处理A条件下，细胞的大小明显增加，形态变得更加圆润。
而在处理B条件下，细胞的大小和形态相对稳定。
这可能与处理A条件下的细胞分化和增殖有关。
3. 荧光信号的变化我们还对细胞中特定蛋白的表达进行了分析。
通过标记特定蛋白的荧光染料，我们可以测量细胞的荧光信号强度。
结果显示，在处理A条件下，特定蛋白的表达明显上调，而在处理B条件下，特定蛋白的表达下调。
利用流式细胞术鉴定茉莉花基因组大小和染色体倍性
热带作物学报2021, 42(5): 1231-1236 Chinese Journal of Tropical Crops收稿日期 2020-06-10；修回日期 2020-07-04基金项目 广西自然科学基金项目（No. 2020GXNSFAA297190）；广西科技基地和人才专项（桂科AD17195065）；广西重点研发计划项目（桂科AB18221064）。
作者简介 李春牛（1983—），男，硕士，副研究员，研究方向：茉莉花栽培与育种。
*通信作者（Corresponding author ）：卜朝阳（BU Zhaoyang ），E-mail ：**************。
利用流式细胞术鉴定茉莉花基因组大小和染色体倍性李春牛1，李先民1，黄展文1，卢家仕1，李 琴2，黄昌艳1，卜朝阳1*1. 广西农业科学院花卉研究所，广西南宁 530007；2. 广西农业科学院农业资源与环境研究所，广西南宁 530007摘 要：以收集的16份茉莉花资源及50份实生种质为材料，以玉米B73为内参，采用流式细胞术估测茉莉花基因组大小，并以二倍体品种为对照，计算茉莉花染色体倍性。
结果表明：内参与待测样品峰值能完全分开，无重叠峰，峰型清晰集中，可对茉莉花基因组大小进行有效估测；供试材料中有56份二倍体，基因组大小为0.54~0.63 Gb ，有7份三倍体，基因组大小为0.79~0.96 Gb ，有3份四倍体，基因组大小为1.04~1.12 Gb ；从收集的资源中鉴定出二倍体和三倍体，未见四倍体，而从实生种质中鉴定出3个四倍体、2个三倍体，表明实生选种是茉莉花种质创新的一条有效途径；在已明确花冠类型的材料中，三倍体及四倍体均为单瓣型茉莉。
该研究结果为茉莉花倍性育种及实生选种提供科学依据。
关键词：茉莉花；流式细胞术；基因组大小；染色体倍性；实生选种 中图分类号：S961.6 文献标识码：AGenome Size Estimation and Ploidy Identification of Jasminum sambac by Flow CytometryLI Chunniu 1, LI Xianmin 1, HUANG Zhanwen 1, LU Jiashi 1, LI Qin 2, HUANG Changyan 1, BU Zhaoyang 1*1. Flowers Research Institute, Guangxi Academy of Agricultural Sciences, Nanning, Guangxi 530007, China;2. Agricultural Resources and Environmental Research Institute, Guangxi Academy of Agricultural Sciences, Nanning, Guangxi 530007, ChinaAbstract: Using Zea may s ‘B73’ as the internal reference, the genome size of 66 Jasminum sambac germplasm (16 col-lected germplasms and 50 seedings) were estimated by the flow cytometry, and the ploidy was calculated using diploid as the control. Using Zea may s ‘B73’ as the internal parameter could effectively estimate the genome size of J. sambac , the peaks of the samples under test could be separated completely, and no overlapping peaks and peaks could be clearly concentrated. 56 germplasms were diploid with genome size between 0.54 Gb and 0.63 Gb, Seven germplasms were triploid with genome size between 0.79 Gb and 0.96 Gb, Three germplasms were tetraploid with genome size range from 1.04 Gb to 1.12 Gb. Three tetraploid and two triploid were found in the seedings, which showing that seed selec-tion is an effective way of germplasm innovation for J. sambac. All the tetraploid and triploid blossomed were simple flower. The results of the study wouldl provide important reference basis for the ploidy breeding and seed selection of J. sambac .Keywords: Jasminum sambac ; flow cytometry; genome size; ploidy; seedling selection DOI: 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.05.005茉莉花Jasminum sambac (L.) Ait.系木犀科（Oleaceae ）素馨属（Jasminum ）植物，原产于印度，现在我国南方和世界各地均有广泛栽培，可用于花茶加工、香精提取、观赏及药用等[1]。
流式细胞术精品PPT课件
四、 流式细胞术的应用
1 细胞DNA含量检测：
细胞固定后用PI染色，因为PI特 异性结合于细胞DNA，荧光强度与PI 的结合量呈良好的线性关系，根据这 个原理，并通过专用的DNA分析软件， 可测出细胞的DNA含量。用于细胞周 期、细胞倍体以及凋亡的检测。
5
• 肿瘤诊断：
•
DNA异倍体的出现是癌变的一个重
• 一、 流式细胞术的概念 流式细胞术（FCM）就是对在的鞘
液包括下的细胞、粒子进行分析和分选 的技术，这种细胞或粒子是经过特异荧 光标记的。其特点是测量速度快，每秒 钟能测数千个乃至上万个细胞，且可进 行多参数测量，另一特点是在分析的同 时可把具有指定特征的细胞分离出来， 这就是分选技术。
1
二、流式细胞仪的工作原理
产生及发展，现在CD系统已有247种之多。
细胞用带有荧光的单克隆抗体标记后，用
流式细胞仪可对其进行检测分析，可分析
出荧光细胞的含量，也可分析出这种阳性
细胞的CD分子的相对含量。标记的方法一
般用直标法，也可用间标法。荧光探针多
为FITC、PE、PE-CY5、PerCP、CY5、
APC等。
9
淋巴细胞分类：
•
红细胞表面CD59缺失
18
5 细胞内蛋白的分析：
•
细胞破膜后将细胞内某一蛋白成分进行荧
光标记，用流式细胞仪进行测量分析，同表型
分析一样，可以测量出这种阳性细胞的数量和
这种蛋白的相对含量。并且，结合细胞表型分
析，进行多标记和多参数分析，可以检测出含
这种蛋白的细胞是属于哪一种表型的细胞。多
用间标法，荧光探针多为FITC。也可以与周期
27
•
流式细胞仪对一个样品提供的结果是否可
基于本草基因组学应用流式细胞术和高通量测序技术检测人参基因组大小
吐温一 ２ ０ （ Ｓ ｉ ｇ ｍ ａ — Ａ Ｍｒ ｉ ｅ ｈ ， ｃ ａ ｔ ． Ｎ ｏ ． Ｓ Ｚ Ｂ Ｄ ２ １ ９ ０ Ｖ） ； 碘
高， 同时进行 多参数检测等优点 。新一代测序技 术的 迅 速发 展使其 成为测 定基 凶组大 小 的重要方法 ， 具
倍 性 以 及 细胞 核 Ｄ Ｎ Ａ含 量… ・ Ｉ ， 具 有特 异 性 好 ， 灵敏度
人 参（ Ｐ ａ ｎ ａ Ｎ ｇ ｉ ｎ ｓ ｅ ｎ ｇ Ｃ ． Ａ ． Ｍｅ ｙ ） （ 实验 基地 栽 培 株
系Ｉ Ｒ ８ ２ ６ ） ； 大 豆（ Ｇ ｌ ｙ ｃ ｉ ｎ ｅ １ １ ｌ ｒ 』 （ Ｌ ． ） Ｍ ｅ ｒ ｒ ｉ ｌ １ ） ； 粳 稻（ Ｏ ｒ ） ｚ ａ
２ ０ Ｉ ７ 第十九卷
第十期
★Ｖ ｏ １ ． １ ９ Ｎ 【 Ｊ ． １ ０
基 于本 草基 因组学应 用流式量 测序
技 术检பைடு நூலகம்测人 参 基 因组 大 小 六
张小燕 １ ， ２ ， 刘志香 ， 廖保生 ， 肖水明 ， 徐 江 ， 盛 玮
（ １ ． 淮北师范大学生命科学学院 淮北 ２ ３ ５ ０ ０ ０ ； ２ ． 巾围中医科学院 中药研究所 北京 １ ０ ０ ７ ０ ０ ）
１ 实 验材 料
体（ ２ ｎ ＝ ４ ｘ ＝ ４ ８ ） ’ ， Ｆ ｝ １ 于基 【 大 Ｊ 组 数据 的缺乏 严重制约 了
人 参 基础研 究 和 产业 的开 展 。评 价 人参基 因组 的大小 及 复 杂 程度 ， 将 有 助 于确 定 适 合 人参 全基 因组 测 序 的 研 究 策 略 。 目前 多 种 方 法 可用 于 测 定 基 组 大 小 ， 如 物 理 图谱 法 ｌ 、 流 式 细胞 术 。 和高 通量 测 序技 术 － 一 。流 式 细 胞 术是 基 【 大 １ 组预估常川的方法… ” ， 可 检 测单 细胞
流式细胞术的原理及应用ppt课件
➢适用于高速分选和 多色分析
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在整堂课的教学中，刘教师总是让学 生带着 问题来 学习， 而问题 的设置 具有一 定的梯 度，由 浅入深 ，所提 出的问 题也很 明确
流式细胞仪检测范围
细胞大小
细胞粒度
细 细胞表面面积
胞 结
核浆比例
构 DNA含量与细胞周期
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散射光
它反应细胞的物理特性,根据前侧向散射光，可以把不同 类型的细胞群加以区分
FSC（小角散射光)它反 应细胞的相对大小和截 面积的大小
SSC (90度角散射光)代 表细胞的颗粒度和精细 结构的变化
1.液流系统： 细胞悬液被吸入检测室后，在鞘液
(sheath)的约束下，通过喷嘴，使其形成单细 胞悬液。
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2.光学系统： 激光是较常用的光源, 稳定性好、单色性好。 散射光和荧光信号被收集、处理转化为数字信号。
FACS Vantage DiVa
科研型（大型机）
特点： ➢多数字化 ➢适用于各类细胞分选 ➢4路分选
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在整堂课的教学中，刘教师总是让学 生带着 问题来 学习， 而问题 的设置 具有一 定的梯 度，由 浅入深 ，所提 出的问 题也很 明确
FACSAria
科研型
特点： ➢分辨率高
➢选配多种波长和类 型激光器
成,将产生的光信号引导至检测器
流式细胞仪检测高等植物细胞核DNA含量的方法
流式细胞仪检测高等植物细胞核DNA含量的方法汪艳;肖媛;刘伟;李婷婷;胡锐;乔志仙【摘要】相对于动物和微生物而言,流式细胞术在植物科学上的应用会因植物组织与细胞(如细胞壁、中央液泡、特殊细胞器等)的特殊结构以及次生代谢产物等特殊成分,造成样品在前期处理、染色及测试等方面的困难,甚至导致检测失败或结果不准确.笔者在长期运用流式细胞仪测试工作中,积累了大量的植物样本检测经验,并参考国内外相关文献,总结出从植物取材、样品制备到植物细胞核DNA流式检测的方法和技巧,可为植物科学研究者及从事流式细胞检测的技术人员提供实验参考.【期刊名称】《植物科学学报》【年(卷),期】2015(033)001【总页数】6页(P126-131)【关键词】流式细胞术;高等植物;细胞核DNA含量;DNA解离液【作者】汪艳;肖媛;刘伟;李婷婷;胡锐;乔志仙【作者单位】中国科学院水生生物研究所分析测试中心,武汉430070;中国科学院水生生物研究所分析测试中心,武汉430070;中国科学院水生生物研究所分析测试中心,武汉430070;中国科学院水生生物研究所分析测试中心,武汉430070;中国科学院水生生物研究所分析测试中心,武汉430070;中国科学院水生生物研究所分析测试中心,武汉430070【正文语种】中文【中图分类】Q343;O65流式细胞仪(flow cytometer)的诞生标志着在单细胞水平上定性、定量分析及分选检测技能的快速发展，并在血液学、免疫学、肿瘤学、分子生物学和细胞生物学等学科的基础研究及临床检验中得到了广泛应用。
但在植物学研究领域中，由于植物组织与细胞结构复杂，使流式细胞仪在植物科学中的应用滞后于其它学科。
近30年来，随着流式细胞仪多功能开发、多参数流式分析与分选技术建立、流式样品制备技术的不断更新，流式细胞术在植物科学领域如植物遗传育种、植物染色体分析与文库构建、逆境植物学、植物分类学、植物病理学等各个学科中显示出广阔的应用前景[1]。
毛竹基因组大小测定
植物学通报Chinese Bulletin of Botany 2008, 25 (5): 574−578, w w 收稿日期: 2008-04-15; 接受日期: 2008-09-12基金项目: 林业公益性行业科研专项(No. 200704001)和国家林业局948项目(No. 2004-4-60)* 通讯作者。
E-mail: lilubin@.实验简报.毛竹基因组大小测定李潞滨1, 武静宇1, 2, 胡陶1, 杨学文3, 彭镇华1*1中国林业科学研究院林业研究所, 国家林业局林木培育重点实验室, 北京 1000912河北大学生命科学学院, 保定 071002; 3国际竹藤网络中心, 国家林业局竹藤科学与技术重点开放实验室, 北京 100102摘要 毛竹(Phyllostachys edulis )属禾本科(Poaceae)竹亚科(Bambusoideae)刚竹属(Phyllostachys ), 是我国分布和栽培面积最大的经济竹种, 有着广泛的开发前景。
本实验以水稻(Oryza sativa )为内标, 用流式细胞仪对水稻和竹子样品的PI 发射荧光强度进行测定, 通过比较水稻与毛竹样品峰值的倍数关系, 计算出毛竹的基因组大小。
对24组样品进行重复测试, 测得毛竹基因组大小为2 075.025±13.08 Mb, 即2 C DNA 含量为4.24 pg(以1 pg DNA = 0.978×109 bp 计算)。
毛竹基因组大小测定为毛竹基因组文库的建立及其基因组学研究奠定了重要基础。
关键词 流式细胞仪, 基因组大小, 水稻, 毛竹李潞滨, 武静宇, 胡陶, 杨学文, 彭镇华 (2008). 毛竹基因组大小测定. 植物学通报 25, 574−578.毛竹(Phyllostachys edulis ) 隶属禾本科(Poaceae)竹亚科(Bambusoideae)刚竹属(Phyllostachys ), 是我国分布最广、面积最大和经济价值最高的竹种之一, 具有生长快、周期短、产量高、用途广和效益大等诸多优点, 有着广泛的开发前景(江泽慧, 2002; 李潞滨等,2008)。
基因组大小和物种形态演化的关系
基因组大小和物种形态演化的关系随着科技的进步和逐渐完善的基因测序技术，人们对于生物基因组大小与形态演化的关系越来越感兴趣。
在进化过程中，物种的形态演化是与其基因组大小密切相关的一个方面。
本文将从基因组大小和物种形态演化的关系、基因组大小的测量方法、基因组大小与物种形态演化的案例研究等三个方面进行探讨和分析。
一、基因组大小和物种形态演化的关系基因组大小是指一个生物体内包含的全部DNA分子的总数。
不同物种的基因组大小差别很大。
通过对基因组大小的测量，可以更好的了解和理解生物的进化过程。
基因组大小对生物的形态演化、伦理和生态行为等方面均有关联。
大部分研究表明，基因组大小与物种的形态演化之间存在一定的关系。
很多研究都表明，基因组越大的物种，其身体形态越趋向于复杂化和多样化。
部分学者认为，这种关系可以解释为基因组大小的变化导致了基因数量和多样性的变化，从而导致了形态演化的差异。
庞大的基因组还与生物体的适应性和生存竞争力有关。
例如，一些寄生虫几乎完全失去了肌肉和消化系统，主要是因为它们需要保持极小的基因组才能生存。
另外，在不同物种间，基因组大小与寿命和代谢率等生理特征也存在一定的相关性。
二、基因组大小的测量方法测量一个物种的基因组大小并不容易。
传统的方法是采用凝胶电泳技术，并且该方法不仅操作麻烦，而且准确度较低。
现如今，随着高通量比对测序的发展，也有了其他更便捷的测量方法。
其中，流式细胞术是一种常见的基因组大小测量方法。
它是利用计量DNA的荧光强度来估计物种的基因组大小。
然而，这种方法也存在着一些缺点。
例如，由于不同分子量的DNA分子容易被损坏或去除，因此测定的DNA分子大小会存在一定误差。
近年来，随着第三代测序技术的研究和发展，单分子测序技术是一种新的基因组测量方法。
这种技术可以直接读取DNA分子的序列，不需要对DNA进行PCR 扩增，因此具有高效、高精度和高准确性的优点。
三、基因组大小与物种形态演化的案例研究近年来，随着基因组数据的不断累积和技术的不断发展，研究各种生物特征与基因组大小的关系也变得越来越有意义。
基于流式细胞术和基因组Survey的绣球基因组大小及特征分析
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江苏农业科学 ２０２１年第 ４９卷第 １２期
测序是估测基因组大小的常用方法，前者用于评估基 因组大小和倍性水平，操作简单，分辨率高，准确性 高，后者 具 有 高 通 量 测 序、速 度 快 和 数 据 量 大 等 优 点［２０－２１］。本研究采用流式细胞术和基于 Ｋ－ｍｅｒ分 析的 基 因 组 Ｓｕｒｖｅｙ测 序 对 大 花 绣 球 主 栽 品 种 “Ｂａｉｌｅｒ”基因组大小进行估测和相互验证，并对测序 质量、杂合度、序列重复率等进行评估测定，旨在为绣 球全基因组测序提供重要依据，为绣球进化分析、基 因挖掘、遗传改良以及结构基因组研究奠定基础。
绣球（Ｈｙｄｒａｎｇｅａｍａｃｒｏｐｈｙｌｌａ）别称八仙花，属于 虎耳草科绣球属，因其花序色彩艳丽、开花期长、适 应性广和 抗 逆 性 强 而 被 广 泛 种 植［１］。 绣 球 是 观 赏 植物中的强耐铝（Ａｌ）植物，其成熟叶片和萼片可以 积累高于 ３０００μｇ／ｇＡｌ而不呈现任何毒性症状［２］。 部分绣球 品 种 花 色 易 变，调 节 栽 培 土 壤 ｐＨ 值 及 Ａｌ３＋含量 能 使 其 呈 现 红 色、紫 色 或 蓝 色 等 不 同 颜 色［３］。大量研究表明，萼片中飞燕草素 －３－Ｏ－葡 萄糖苷与 Ａｌ３＋的络合物调控萼片颜色，而颜色的变 化取决于萼片中 Ａｌ３＋含量［３－４］。因此，绣球不仅是 非常值得开发的观赏植物资源，而且是研究观赏植 物蓝色花形成机制的特色材料，在花卉育种领域具 有较大的应用价值。
插 入 片 段 为 ３５０ ｂｐ的 ＤＮＡ 文 库 （ＤＥＳ０１９８４、 ＤＥＳ０２２３９和 ＤＥＳ０２２３８）进行双末端测序，经过滤和 修正后，获得 ２１２．４１Ｇｂ的测序数据。测序质量评 估 显 示，这 ３个 文 库 Ｑ２０值 分 别 为 ９６．０４％、 ９６６４％、９６．９９％，Ｑ３０值分别为 ９０．８％、９２．１２％、 ９２．８３％（表 ２），测序错误率均小于 ０．苷 酸 数 据 库 （ＮＴ）进 行 比 对，在 ＤＥＳ０１９８桐（Ｄａｖｉｄｉａｉｎｖｏｌｕｃｒａｔａ
盐节木基因组大小的测定
盐节木基因组大小的测定王霞;陈慧泽;李永峰;韩榕;陈惠【摘要】目的是基于流式细胞术来测定盐生植物盐节木的基因组大小.首先,以盐节木同化枝为材料,采用改良的Otto两步法提取细胞核悬浮液,用碘化丙啶进行细胞核染色,用已知基因组大小的甜菜作为参考植物,在观察两者细胞大小的基础上,确定了两者一致的取材量和流式上样量,并将处理好的样品上流式细胞仪进行DNA含量的测定.其次,通过比较内参样品与待测样品的G0/G1期峰值,计算出盐节木基因组的大小.结果以甜菜为内参测定的盐节木的基因组大小为663.25 Mbp,即0.678 pg.【期刊名称】《生物学杂志》【年(卷),期】2018(035)004【总页数】3页(P100-102)【关键词】盐节木;甜菜;流式细胞仪;基因组大小【作者】王霞;陈慧泽;李永峰;韩榕;陈惠【作者单位】山西师范大学生命科学学院,临汾041004;山西师范大学生命科学学院,临汾041004;山西师范大学生命科学学院,临汾041004;山西师范大学生命科学学院,临汾041004;山西师范大学生命科学学院,临汾041004【正文语种】中文【中图分类】Q943.2盐节木(Halocnemum strobilaceum)是藜科(Chenopodiaceae)盐节木属(Halocnemum)的一种耐盐半灌木植物，植株较小且肉质化,多分布于盐碱地区[1]。
盐节木主要生长在我国新疆和甘肃等北部地区，为耐盐耐旱的植物类群[1-2]。
目前，关于盐节木的研究多集中在种子的萌发与幼苗生长的影响[1,3]、群落特征、提取和开发植物次生代谢产物类物质[4-5]等方面。
近年来，还进行了盐节木耐盐基因的克隆和表达[6]、组织培养快速繁殖[7]及盐促进根伸长的机制等的研究[8],但其基因组大小的研究还未见报道。
甜菜(Beta vulgaris)同盐节木一样，也属藜科(Chenopodiaceae)，二年生草本植物，物种为二倍体，体内含18条染色体[9]。
流式细胞术分析和分拣植物染色体
流式细胞术分析和分拣植物染色体
李立家;宋运淳
【期刊名称】《遗传》
【年(卷),期】2005(27)3
【摘要】流式细胞术是当染色体、细胞核和细胞等颗粒随着流动的液体(水或缓冲液)通过一个测量点时,被探测器探测到,这样根据颗粒的物理和化学特征而将不同的颗粒分开并计数分拣的技术.流式细胞分析在人类基因组计划中发挥了重要作用,流式细胞技术的应用也适用于植物,目前这个技术应用范围包括流式核型分析,分拣纯化染色体,定位基因,构建文库等.文章综述了流式细胞术在植物基因组分析方面的研究进展.
【总页数】5页(P461-465)
【作者】李立家;宋运淳
【作者单位】武汉大学生命科学学院植物发育生物学教育部重点实验室,武
汉,430072;武汉大学生命科学学院植物发育生物学教育部重点实验室,武汉,430072【正文语种】中文
【中图分类】Q942
【相关文献】
1.植物染色体标本的制备和染色体核型分析研究进展 [J], 丁鸿;邱东萍;陈少雄
2.植物染色体标本的制备和染色体核型分析研究进展 [J], 丁鸿;邱东萍;陈少雄;
3.流式细胞术在微型浮游植物研究中的应用Ⅰ、流式细胞术对微型浮游生物丰度测
量方法的探讨 [J], 张利华
4.植物减数分裂染色体配对与染色体组分析的研究进展 [J], 郭军洋;陈劲枫;钱春桃;曹清河
5.流式细胞术及染色体畸变分析在X射线职业照射者血细胞研究中的初步… [J], 周振英;余世俊
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DNA的倍体和DNA指数的关系
DI=1.0±0.01 DI=1.0±0.15 DI=2.0±0.1
DI>2.10
二倍体 近二倍体 四倍体 多倍体
例：
D N A 倍 体
正 二 倍 体 (2n,D iploid) 亚 二 倍 体 (H aploid) 四 倍 体 (T eraploid) 低 倍 体 (H ypoploid) 高 倍 体 (H yperploid)
➢主要表达方式
Pseudo 3D Plot
3D Plot
二 植物C值分析原理
利用特殊的荧光染料(PI、EB、AO等)与细胞内DNA碱 基结合，被荧光染料染色的细胞在激光照射下发射出荧光， 荧光强度与DNA含量成正比。流式细胞仪通过测定细胞的 荧光强度推算出细胞的DNA含量。
流式细胞仪计算测量DNA含量实际上是细胞周期的测 量，由于细胞核G1期的DNA含量反应一个细胞的倍性，因 此常用DNA含量来估计细胞倍性，包括DNA的绝对含量或相 对含量。
临床型(BD,FACSCalibur台式机)
特点：
➢光路调节系统固定
➢自动化程度高
➢操作简便
➢使用寿命长
➢配备1-2根激光
➢细胞分选速度慢， 主要用于细胞分析
大型机(BD,FACSAria科研型)
特点： ➢分辨率高
➢选配多种波长和 类型激光器
➢可把感兴趣细胞 分选到特定培养孔 或板上（4路和24 孔板）
流式细胞仪(Flow Cytometer)
集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、电子计算机技术、细 胞荧光化学技术、流体力学为一体的一种新型高科技仪器。
流式细胞术特点
单细胞悬液 或生物颗粒 分析速度高
多参数
精度高
高灵敏度
当代最先进的细 胞定量分析技术
无害分析 和分选
国际两大流式细胞仪生产商：
FACSCalibur 流式 细胞分析仪
光电转换 数据处理系统 • 细胞分选系统
液流系统：流动室、液流驱动系统
Injector Tip
Sheath fluid
Fluorescence signals
Focused laser beam
液流中心由单列 匀速运动颗粒组 成的液柱
分选系统
488 nm laser
Charged Plates
FALS Sensor Fluorescence detector
ImageStream成像流式细胞仪
分选微型模式生物
COPASTM 生物分选系统
模式动植物研究、大体积细 COPAS在线虫分选方面的应用，就在 胞研究及药物筛选等方面 Nature系列杂志上发表了7篇以上的文献
流式细胞仪的工作原理
• 光学系统 激光光源 光收集系统
• 液流系统 流动室
液流驱动系统 • 电子系统
➢适用于高速分选 和多色分析
流式ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ胞仪检测范围
细胞大小
细 胞 结 构
细胞粒度
细胞表面面积
细
核浆比例
胞 功
DNA含量与细胞周期 能
特异性抗原 （细胞表面/胞浆/核） 细胞内细胞因子 细胞活性 酶活性
RNA含量 蛋白质含量
激素结合位点 细胞受体
流式细胞技术的最新突破
细胞信号转导/通路分析 细胞间相互作用 分子共定位与胞内分子转运 细胞形态学 荧光原位杂交 基因表达分析 细胞凋亡 细胞周期分析 白细胞亚群分析
数据显示类型
单参数直方图（Histogram）
X轴：代表荧光信号或 散射光信号的强度，用 “通道数”表示，可以 与光强度之间线性关系 或对数关系
Y轴：代表该通道内所 出现具有相同光信号特 征性细胞的频率
二维等高图和密度图
二维点图Dot Plot
➢便于数据统计
➢不同的细胞群 可以用不同的颜 色标记
G0G1
count
s G2M
0
200
400
600
800
1000
2N
4N
DNA content
DNA检测的常用术语
变异系数(Coefficient of Variation,CV)：通常以G0/G1峰的宽度来反映,该 指标反映了仪器的分辨率或精确度。影响CV的因素主要包括两方面： 仪器因素（如鞘液的流速、光路、机器调试等）和样本制备(如样品中 碎片含量、细胞团块、细胞活性和细胞浓度等)及染色过程对标本的人 为影响。优化DNA分析条件就是指最大程度地减少这两大因素带来的变 异。
测量DNA的绝对含量时，须设一个已知DNA含量的标准样 品作对照，来换算出DNA的绝对含量。
样品2C DNA含量=[(样品G0/G1峰均值)/ (标准G0/G1峰均值)] ×标准2C DNA含量(pg DNA)
测量DNA的相对含量时，须设一已知倍性的同类材料作照， 换算出待测样品的DNA相对含量，进行倍性分析。
+
Single cells sorted into test tubes
信号检测--散色光
它反应细胞的物理特性,根据前侧向散射 光，可以把不同类型的细胞群加以区分 FSC(前角散射光)它反应细胞的相对大小和截面积的大小
SSC (90度角散射光)代表细胞的颗粒度和精细结构的变化
Laser
FALS Sensor
BD(Becton Dickinson)公司：FACSCalibur、FACSAria、 FACS Vantage Diva等；
BC(Beckman Coulter)公司：EPICS XL/-MCL、 CytomicsTM FC500系列等。
目前流式细胞仪可分为两类：
台式机和大型机
EPICS XL 流式 细胞分析仪
DNA指数(DNA index,DI)：DI指的是样本G0/G1峰的平均道数与正常二
倍体G0/G1峰的平均道数之间的比值。DI为1 意味着二倍体(2c)。
DI=
样品G0/1细胞峰均道值
正常二倍体标准细胞G0/1期细胞均道值
倍体(Ploidy)：原指染色体数目，流式中用来描述总的DNA含量。二倍体 细胞有正常细胞的DNA含量但不除外染色体异常。DI为1.9-2.1 的细胞为 四倍体(CV<5%)。除二倍体和四倍体，其他均称异倍体。
流式细胞术测定植物基因组大小
一 流式细胞术的基本知识
概念
流式细胞术(Flow Cytometry,FCM)
流式细胞术，即利用流式细胞计对处在快速直线流动状态中的单细 胞活生物颗粒进行多参数、快速定量分析，同时对特定群体加以分 选的现代细胞分析技术，是20世纪70年代发展起来的一项技术，综 合了激光技术、计算机技术、半导体技术、流体力学、细胞化学等 各学科的知识，它是一种自动分析的技术。