猪脾中DNA的提取及含量测定

１、二苯胺试剂：使用前称取0.8g二苯胺（需在70%乙醇 试剂中重结晶2次)，溶于180ml冰乙酸中，再加入8ml过氯酸 （60%以上），混匀待用，临用前加入0.8ml 1.6%乙醛溶液，所 配试剂应为无色。 每组需56ml 共需2800ml ２、DNA标准溶液：（须经定磷法确定其浓度）取标准DNA 以0.01N NAOH配成200微克/毫升的标准液。 每组需12ml 共需600ml ３、1.6%乙醛：取47%乙醛3.4ml，加重蒸水定容至100ml （放于冰箱中，一周之内可以使用）。 共需70ml ４、待测样品液：准确称取猪脾DNA 5mg,用0.01mol/L的 氢氧化钠溶液配成100微克/毫升的溶液。 每组需4ml 共需200ml
②化学试剂法：用SDS处理细胞；
③酶解法：加入溶菌酶或蜗牛酶，都可使细胞壁 破碎。
高等动物的DNA 主要存在于细胞核与线粒体中， 所以提取时有两个困难（高等植物与此类似）：
1）破碎细胞难，从处死动物分离组织器官到 破碎细胞费时长。在长时间内DNA可能会被DNase 降解； 2）因分子量大，在使用组织匀浆器破碎组织 时易造成DNA 断裂； 对不同生物材料，要根据具体情况选择适当 的分离提取方法。
强酸、加热条件下，可以使DNA中的嘌呤碱基与 脱氧核糖间的糖苷键断裂，而产生嘌呤碱基，脱氧核 糖与嘧啶核苷酸。 其中2ˊ脱氧核糖在酸性环境中成为ω―羟基 ―γ―酮基戊醛，此物与二苯胺反应生成蓝色化合物， 在595nm处有最大吸收。DNA在40-400μg范围内光密 度与DNA浓度成正比。 在反应液中加入少量乙醛可提高灵敏度，而且其 他化合物的干扰也显著降低。 当样品含少量RNA时不影响测定，而蛋白质、多 种糖及其衍生物芳香，羟基醛都能与二苯胺形成各种 有色物质，干扰测定。
二、DNA提取技术
技术1：基因组总DNA的大量提取
本方法通过液氮研磨粉碎动植物组织、裂 解液裂解细胞、有机溶剂抽提，使进入水相的 核酸与蛋白成分分开，在RNA酶作用下，降解 RNA，得纯度较高的DNA样品。
仪器： 高速冷冻离心机、台式离心机、恒温水浴、 低温冰箱或冰柜、冷冻真空干燥器、取液器、 电泳仪、水平电泳槽、紫外分光光度计。
（2）阴离子去污剂法: 用SDS或二甲苯酸钠等去污剂使蛋白质变性,可 以直接从生物材料中提取DNA。 由于细胞中DNA与蛋白质之间常借静电引力或 配位键结合,而阴离子去污剂能够破坏这种价键,所 以常用阴离子去污剂提取DNA。
（3）苯酚抽提法: 苯酚作为蛋白变性剂,同时抑制了DNase的 降解作用。 用苯酚处理匀浆液时,由于蛋白与DNA 连 接键已断,蛋白分子表面又含有很多极性基团 与苯酚相似相溶。 蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。离 心分层后取出水层，多次重复操作，再合并含 DNA 的水相。 利用核酸不溶于醇的性质，用乙醇沉淀 DNA 。此法的特点是使提取的DNA保持天然状 态 。
操作步骤
1、 鲜猪脾
去脂、血
5g
预冷的1×SSC洗2次 匀浆液
冰盐浴
剪碎, 1×SSC=1:5(W/V）
捣碎 (8×5s，间隔30s)
冷却10min
4℃,8000rpm,5min
弃上清(重复2次)
沉淀物
2V 1×SSC,搅匀
4℃,8000rpm,5min
沉淀
搅拌, 滴加
2、沉淀
固体NaCL
5V Na2EDTA
猪脾中提取DNA
1. 实验材料，仪器和试剂： （1） 实验材料：新鲜猪脾： （2）仪器： 量筒：10ml 、100ml 3个； 烧杯：100ml 2个、250ml 2个； 磨口锥形瓶： 250ml 1个、500ml 1个； 移液管：1ml 1支、10ml 1支； 滴管、玻棒、离心机、电动搅拌器、台秤、 剪刀、镊子。
外，还有质粒DNA 等。

对于低等生物。如从病毒中提取DNA 比较容易， 多数病毒DNA 分子量较小，提取时易保持其结 构完整性。
核酸提取的主要步骤：
1）破碎细胞； 2）去除与核酸结合的蛋白质以及多糖、脂 类等生物大分子； 3）去除其它不需要的核酸分子； 4）沉淀核酸，去除盐类，有机溶剂等杂质。
核酸提取的方案，应根据具体生物 材料和待提取的核酸分子的特点而定。 对于某特定细胞器中富集的核酸分 子，事先提取该细胞器，然后提取目的 核酸分子的方案，可获得完整性和纯度 两方面质量均高的核酸分子。

2.细胞的破碎
有坚硬的细胞壁的细胞，首先要破碎细胞。方法 有三种：
①机械方法：超声波处理法、研磨法、匀浆法；
所得混合液倒入磨口塞的锥形瓶中，加入同体 积氯仿—异戊醇，激烈振荡10分钟，8000r离 心10分钟，上层水相取出后倒入烧杯，以同 积氯仿—异戊醇重复去蛋白2次。

取出水相于烧杯中，逐渐加入2倍 体积95%乙醇，玻棒搅动，DNA纤维绕 于璃玻棒上后挤干，用70%乙醇洗DNA 纤维2次，用95%乙醇洗一次，再用乙 醚洗一次，取出并挤干。
沉淀物中再加2倍体积的1×SSC搅匀，离心，弃上清，
取↓，重复2次。

将所得沉淀悬于5倍体积的 PH8.0、0.15M NaCL-0.1Na2EDTA 溶液中。边搅拌边慢慢滴加 5%SDS最终浓度达1%为止。然后 加入固体氯化钠使其最终浓度达 1mol/L，继续搅拌，以确保氯化 钠全溶。

（3）试剂： ① 20×SSC：175.2gNaCL，88.2g柠檬酸 钠•2H2O，PH=7.0加水至1000ml； ② 1×SSC，0.1×SSC由①作相应的稀释 得来； ③ NaCL-Na2EDTA 液 ： 8 . 7 7 gNaCL，3.72g Na2EDTA溶于800ml蒸馏水中，用固体NaOH调 PH=8后定容至1000； ④ 5%SDS（W/V）：6gSDS溶于100ml45%乙 醇中； ⑤ 氯仿-异戊醇=24：1（体积比） ⑥ 其他:95%乙醇，盐，冰.
3.DNA提取的几种方法 (1)浓盐法
利用RNP和DNP在电解溶液中溶解度不同，将二者 分离。
1）用1M 氯化钠提取,得到的DNP粘液; 2) 与含有少量辛醇的氯仿一起摇荡,使乳化; 3) 离心除去蛋白质,此时蛋白质凝胶停留在水相 及氯仿相中间，而DNA位于上层水相中; 4) 用2倍体积95%乙醇可将DNA 钠盐沉淀出来.
核酸提取的原理
核酸包括DNA、RNA两种分子，在细胞中都是以与 蛋白质结合的状态存在，用DNP和RNP 表示； DNP和RNP在盐溶液中的溶解度受盐浓度的影 响而不同。 DNP在低浓度盐溶液中，几乎不溶解，如在0.14 mol/L的氯化钠溶解度最低，仅为在水中溶解度 的1%，随着盐浓度的增加溶解度也增加，至 1mol/L氯化钠中的溶解度很大，比纯水高2倍。
DNA产率: 测得的DNA的微克数 DNA%= X 100 原料的微克数
1.为什么在低温下进行？
2.加柠檬酸钠和EDTA的作用 ?
3.加SDS的作用？
4.加NaCL的作用，为什么要加到1mol/L? 5.加入异戊醇有什么作用？
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9.
生物学基础实验教程. 滕利荣主编. 长春:吉林科学技术出版社, 1999.8, 573~578. 现代分子生物学实验手册. 张维铭主编. 北京: 科学出版社, 2003.6, 80~106. 精编分子生物学实验指南. 颜子颖、王海林译. 北京: 科学出版 社, 1998.6, 30~40. 生物化学与分子生物学实验技术. 厉朝龙主编. 杭州: 浙江大学 出版社, 2000.6, 107~116 分子克隆实验指南(第三版). 黄培堂等译.北京: 科学出版社, 2002.8,26~52. 生物化学与分子生物学实验教程. 梁宋平主编. 北京:高等教育出 版社,2003.3,16~19. 生物化学实验(第三版). 陈钧辉, 陶力等编. 北京: 科学出版社, 2003.4,128~130. 生物化学实验指导. 余冰宾 主编. 北京:清华大学出版社, 2004.1, 158~160. 生物化学实验方法和技术. 陈毓荃 主编.北京: 科学出版社, 2002.8, 127~132

核酸的分布：
95%的真核生物DNA主要存在于细胞核内，
其它5%为细胞器DNA，如线粒体、叶绿体等。 RNA分子则主要存在于细胞质中，约占75%， 另有10%在细胞核内，15%在细胞器中。
1、核酸的理化性质

DNA则为白色类似石棉样的纤维状物。
核酸和核苷酸 大都呈酸味（除肌苷酸、鸟苷酸具 有鲜味外）。


RNP在盐溶液中的溶解度受盐浓度的影响较 小，在0.14mol/L氯化钠中溶解度较大。因此， 在提取时，常用此法分离这两种核蛋白。
从不同材料中提取DNA的方法不同，分离
提取的难易程度也不同。
从高等动植物及细菌中提取DNA难度大一
些。由于其DNA 分子量较大。因此易被 机械张力剪断。
细菌DNA，除核DNA

DNA、RNA和核苷酸都微溶于水，不溶于乙醇、氯 仿等有机溶剂。

DNA钠盐在水中为10g/L，呈黏性胶体溶液。 RNA钠 盐在水中溶解度可达40g/L。

在酸性溶液中，DNA、RNA易水解，在中性 或弱碱性溶液中较稳定。

DNA溶液的粘度很大，而RNA溶液的粘度小 得多。核酸发生变性或降解后其粘度降低。 核酸受到强大离心力的作用时，可从溶液中 沉降下来，其沉降速度与核酸的大小和密度有 关。
1M
搅拌
5%SDS(终浓度达1%)
混合液
锥形瓶
NaCL全溶 激烈振荡10min
同体积氯仿-异戊醇
4℃,8000rpm,10min
上层水相 3、水相
70%乙醇 搅拌
同体积氯仿-异戊醇
重复去Pr,2次 DNA纤维
水相 挤干
95%乙醇
至溶液澄清
95%乙醇, 乙醚
洗DNAwenku.baidu.com维2次
取出并挤干DNA纤维
二苯胺显色法测定DNA含量
2. 操作步骤:
取鲜猪脾,去脂、血,称取5g,用预冷的1×SSC溶液 洗2次，剪碎； 按脾：1×SSC=1; 5W/V 加入25ml预冷的1×SSC， 用高速组织捣碎机破碎8次,每次5秒,中间间隔30秒； 将匀浆液放在烧杯中， 于冰盐浴中冷却10分钟。 4℃，8000rpm离心5分钟。去掉上清，取↓；
试剂 ： 细胞裂解液（100mM Tris-HCl 5mM EDTA 500mM NaCl 1% SDS pH 7.5）；饱和酚；氯仿 /异戊醇；异丙醇；70%及无水乙醇；3M NaAC （pH5.2）；RNA酶；TAE缓冲液；载样缓冲液
提取DNA的主要来源：
1、动物组织及器官 脾、肝、胸腺、鱼类精子等。 2、植物 种子的胚芽等 3、微生物 细菌、酵母菌等
核酸的存在形式：
核酸包括DNA、RNA两种分子，在细胞中都是以 与蛋白质结合的状态存在； 真核生物的染色体DNA为双链线性分子； 原核生物的“染色体”、质粒及真核细胞器 DNA为双链环状分子； 有些噬菌体DNA有时为单链环状分子； 病毒的DNA、RNA分子，其存在形式多种多样， 有双链环状、单链环状、双链线状及单链线状 等。
猪脾中DNA的提取
指导教师：滕利荣
Email:tenglirong@mail.jlu.edu.cn
2005.03
二十世纪是 物理、化学和电子科学 的世纪
二十一世纪是 生命科学 生命是 的世纪
？
生命 = 核酸 + 蛋白质
二十一世纪是核酸、蛋白质的世纪
DNA提取的意义：
1、用于研制核酸类药物及保健品 2、用于基因诱变 3、用于DNA克隆 4、用于DNA测序 5、用于PCR扩增
操作方法：
1. DNA标准曲线的制定： 取10支试管，分成2组，依次加入0.4、0.8、1.2、 1.6和2.0mlDNA标准溶液。添加蒸馏水，使之都成为 2ml。另取2只试管，各加2ml蒸馏水作为对照。然后 各加入4ml二苯胺试剂，混匀。于60度恒温水浴中保 温1h，冷却后于595nm处进行比色测定。取两管平均 值，以DNA浓度为横坐标，光吸收值为纵坐标，绘制 标准曲线。
2. 制品的测定：
取2支试管，各加2ml待测液（内含 DNA应在标准曲线的范围之内）和4ml二 苯胺试剂，摇匀。其于操作同标准曲线 的制作。 3. 根据测得的光吸收值，从标准曲线待测 上查出相应该光吸收值DNA的含量，计算 出制品中的百分含量。
数据: DNA纯度： 待测液中测得的核酸微克数 DNA%= X 100 待测液中制品的微克数