第10章 真核生物的遗传分析

2.SNP的检测方法

直接测序法：直接测序对不同个体进行的PCR扩增，然后对
扩增片段测序比较是发现SNP的最常用方法。 DNA芯片法：检测SNP的最佳方法是新近发展起来的DNA芯 片技术。SNPs的大规模发现和识别与DNA芯片技术的发展 和应用关系密切。 基于生物信息学的SNP候选位点搜索：公共数据库中公布有 大量的序列信息，其中包括表达序列标签(ESTsRAPD标记

RAPD标记是用随机排列的寡聚脱氧核苷酸 单链引物(通常长度为10个核苷酸)通过
PCR扩增染色体组中的DNA所获得的长度
不同的多态性DNA片段
RAPD与经典PCR区别
经典PCR
引物个数 1对 20bp
RAPD
1个 10bp 36℃ 随机扩增
引物长度 复性温度
扩增产物
55～60℃

InDel标记是指通过比较基因组学发现不同基因
polymorphisms，简称RFLP标记)、可变数目串联重复序
列标记(Variable number of tandem repeats，简称VNTR 标记)、原位杂交(in situ hybridization)等 另一类是以聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction， 简称PCR反应)为基础的各种DNA指纹技术 第三类是一些新型的分子标记，如单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism，简称SNP)，表达序列标签 (Expressed sequence stags，简称EST)和反转录转座子
3’-G
连接上接头的片段 5’-NN…NNAATTC 3’-NN…NNTTAAG
ligase连接接头 AATTNN…NN-3’ TTATNN…NN-5’
选择性引物PCR扩增限制片段 增加引物选择性碱基 正向引物系列 反向引物系列 扩增片段数目
正向0，反向0 5’-NN…NNAATTC-3’ 3’-TTATNN…NN-5’ 所有 正向+1，反向+1 5’-NN…NNTATTCT-3’ 3’-ATTATNN…NN-5’ 1/4 正向+2，反向+1 5’-NN…NNTATTCTC-3’ 3’-AGTTATNN…NN-5’ 1/16 正向+1，反向+2 5’-NN…NNTATTCT-3’ 3’-AGTTATNN…NN-5’ 1/4×1/16=1/64
剔除 EcoRI MseI 选择
基因组DNA 双酶切选择(frequent cutter+rare cutter) 合成接头、连接 合成引物 (接头＋(1-3)选择碱基) 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳
选择性扩增
连接(ligase)
电泳
分离扩增产物
EcoR I 双酶切
EcoR I
Mse I
Mse I
EcoR I酶切位点

C→A(G→T) C→G(G→C) T→A(A→T)
1.SNP的分类

在基因组DNA中，任何碱基都有可能发生变异，因 此SNP既有可能在基因序列内，也有可能在基因序 列外。基因组内的SNP分为两种形式：

一是遍布于基因组非编码区中的大量单碱基核苷酸变异 另一是主要分布于基因编码区内（Coding region）的突变， 故又称其为cSNP。从对生物遗传性状的影响上来看， cSNP又可分为两种：
要求亦不苛刻
12
明恢63与珍汕97杂交，回交BC1F1，wx基因SSR图谱 1.珍汕97 2.明恢63
利用卫星DNA进行亲 子鉴定的基本原理
CAPS标记

利用PCR产物专门检测内切酶位点变异间的差异

如PCR产物无多态性，通过测序，可能发现它们之一 的酶切位点（如EcoR I）具有突变
EcoR I 电泳
： SSR分子标记的特点
数量几乎无限，检测出多态性的频率极高 SSR一般检测的是一个单一的多等位基因位点 SSR标记为共显性标记，可鉴别出杂合子和纯合子
结果重复性高，稳定可靠。为了提高分辨力，通常使用可检
测出单拷贝差异的聚丙烯酰胺凝胶电泳
兼具PCR反应的优点，即所需DNA样品量少，对DNA质量
(2)RFLP标记的特点

无表型效应 RFLP标记具有共显性的特点 RFLP具有种族特异性 RFLP标记范围遍及全基因组
RFLP标记不足之处

DNA量大(5～15ug) 检测步骤繁琐，需要的仪器、设备较多，周期长 检测中要利用放射性同位素(通常为32P)，易造成环境污 染
用作探针的DNA克隆其制备与存放较麻烦


列之间必然存在大量的重叠区域，通过比较这些重叠区域，
就可获得大量的SNP，并且成本可以大大降低。
3.SNP作为遗传标记的优越性

位点丰富，数量多，分布广泛
具有较高的遗传稳定性


易于基因分型
SNP适于快速、高通量检出

因SNP的二态性，更有利于发展自动化的筛选 或检测技术。
（六）插入缺失（InDel）标记
RFLP AFLP RAPD SSR InDel SNP
限制性酶消化和分 子杂交技术为基础 以PCR技术为基础 以Sequence-PCR技 术为基础
分子标记
一、形态标记 形态标记即植物的外部形态特征，如矮秆、白化、 变态叶、雄性不育等，就是一种特定的肉眼可见的 外部特征
二、细胞学标记

染色体的变化常常会引起某些表型性状的异常，从 而可以将染色体的变化作为一种遗传标记，来分析 测定基因所在的染色体及相对位置，也可通过染色 体置换等进行基因的定位
30-35次循环可将某 一特定DNA序列扩 增105-107，从而可 以通过琼脂糖凝胶 分开，UV观察
PCR的特点
PCR检测DNA多态性的优点(与RFLP相比) ：
•模板DNA用量少 •对模板DNA纯度要求不高 •程序简单，分析周期大大缩短
2. PCR的扩展
A.

单引物PCR标记 随机扩增多态性DNA标记(Random amplification
C. 需要通过克隆、测序来构建特殊双引物的 PCR标记
★ 简单序列重复标记(Simple sequence repeats，简称
SSR标记)
SSR(Simple Sequence Repeat)
Nakamura(1987)发现生物基因组内有一种短的重 复次数不同的序列，统称可变数目串联重复序列
同工酶标记的特点：
可以通过两点或三点测验定位于染色体上
编码同工酶的等位基因是共显性的
同工酶标记的不足： 具有组织特异性 发现同工酶标记有限
四、分子标记

遗传标记多态性形成的分子基础均是基因
组DNA的变异，而分子标记所揭示的多态 性是直接反映基因组DNA间的差异
1. 分子标记的优越性：
Restriction enzyme
digestion
DNA小 片段
琼脂糖 电泳
按DNA分 子大小顺 序分开 转移
探针的限制 X光片 同源序 性酶切片段 列结合 放射自显影 多态性
杂交 尼龙膜
酶切位 点突变等造成DNA 片段长度大小的变化
P1 P2
电泳检测
(Variable number tandem repeat, 简称VNTR )。
VNTR标记包括小卫星(minisatellites)标记和微卫
星(microsatellites)标记
微卫星DNA又称SSR(simple sequence repeats), 它是一类由1～6个碱基组成的基序(motif)串联重复 而成的DNA序列，如(CA)n、 (AT)n、(GCT)n、 (GATA)n等重复，其中n代表重复次数


虽然也可以用非放射性物质(如Biotin系统，Dig系统及
Ecl系统)替代同位素，其杂交信号相对较弱，灵敏度较同 位素标记低得多且价格较高
(二) PCR标记

PCR是Mullis等(1985)首创的在模板DNA、引物和4种脱 氧核糖核苷酸存在的条件下，依赖于DNA聚合酶的体外 酶促反应，以合成特异DNA片段的一种方法 , 其特异性 取决于引物与模板DNA结合的特异性
Mse I酶切位点 AATT-3’ TTAA-5’
5’-GAATTC
3’-CTTAAG
选择EcoR I和Mse I的酶 切粘性末端的片段 特定引物接头 5’-NN…NN-3’ 3’-NN…NNTTAA-5’
5’-AATTC
A-3’ TTAA-5’ 限制性片段
5’-ATTNN…NN-3’ 3’-NN…NN-5’
染色体数目的变化(如单体、缺体、三体、四体) 染色体结构的变异(如缺失、易位、倒位、重复等) 染色体核型(染色体数目、大小、随体有无、着丝粒位置
等)和带型(C带、N带、G带等)
三、生化标记
同工酶(isozyme)：指同一种酶具有多种不同形式，它们催化 同样的生化反应，这类结构不同功能相似的酶称为同工酶
(Retro-transposon)等
RFLP标记

RFLP(restriction fragment length polymorphism)称为限制性片段长度多态 性，是指用限制性内切酶酶切不同个体的基 因组DNA后，含有与探针序列同源的酶切片 段在长度上的差异
RFLP标记的原理
基因组 DNA
1944 -
The Nobel Prize in Chemistry 1993
1、 PCR反应过程(3步)： •变性(denaturation) ：94-96℃， 1-5min，目的使样品DNA解链 •复性(annealling) ：36-60℃， 1-2min，使引物与模板DNA片 段结合
•延伸(extension) ：70-72℃， 1-2min，根据模板DNA，在 Taq酶作用下合成DNA