双歧杆菌实验操作
双歧杆菌实验操作
双歧杆菌实验操作双歧杆菌（Lactobacillus）是一种常见的革兰氏阳性菌，广泛存在于人体的肠道、口腔、阴道等部位，对人体具有重要的生理功能和健康益处。
在实验室中，通过培养双歧杆菌，我们可以进一步研究它的特性、代谢途径、功能以及应用价值。
以下是一个关于双歧杆菌实验操作的示例，包括菌株的分离、培养、保存和鉴定等步骤。
1.菌株的分离和纯化从人体标本或商业产品中获得含有双歧杆菌的样品，例如：粪便、口腔漱口水、乳制品等。
将样品悬浮于无菌PBS（磷酸盐缓冲溶液）中，并进行10倍序列稀释。
将适量的悬浮液均匀涂布在含有适宜培养温度和营养成分的琼脂平板上。
经过孵育后，从单个菌落中刺取分离得到的单菌株。
2.菌株的培养将分离得到的单菌株接种到含有适宜培养基（如MRS培养基）的液体培养物中。
培养条件包括适宜的温度（通常在30-37℃之间）、PH值和氧气供应等。
静态培养通常在试管中进行，而摇床培养则需提供常规的摇床条件。
3.菌株的保存为了长期保存双歧杆菌菌株，常常采用冷冻保存和干燥保存。
其中，冷冻保存利用甘油或液氮冷冻对菌株进行保藏。
干燥保存是将菌株培养物在适当的保护剂（如蔗糖、蛋白质）的作用下，通过真空或喷雾冻干处理。
冷冻保存要求贮存于低温（-70℃至-80℃）环境中，而干燥保存则可在室温下进行。
4.菌株的鉴定确定菌株是双歧杆菌的一种，需要通过鉴定方法进行确认。
传统的鉴定方法包括菌落形态观察、革兰氏染色、形态学特征、生理和生化试验等。
另外，分子生物学技术也可以用于鉴定双歧杆菌，如PCR扩增特定的双歧杆菌基因片段或测序分析菌株的16SrRNA基因序列。
5.功能研究在鉴定菌株后，可以进一步研究双歧杆菌的功能特性和代谢途径。
例如，可以采用培养基成分和环境参数的调整来研究双歧杆菌的生长条件。
也可以评估双歧杆菌在产生保健益生素、抑制致病菌、增强免疫等方面的功能。
总结：通过以上的实验操作，可以实现对双歧杆菌菌株的分离、培养、保存和鉴定。
食品微生物学检验 双歧杆菌检验
食品安全国家标准食品微生物学检验双歧杆菌检验1 范围本标准规定了食品用双歧杆菌（Bifidobacterium）的鉴定及计数方法。
本标准适用于食品用双歧杆菌纯菌菌种的鉴定及计数。
本标准适用于食品中仅含有单一的双歧杆菌菌种的鉴定；以及食品中仅含有双歧杆菌属的计数，双歧杆菌属可包含一种或多种不同的双歧杆菌菌种。
2 设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：2.1 恒温培养箱：36 ℃±1 ℃。
2.2 冰箱：2 ℃～5 ℃。
2.3 天平：感量0.1 g。
2.4 无菌试管：18 mm×180 mm、15 mm×100 mm。
2.5 无菌吸管：1 mL（具0.01 mL刻度）、10 mL（具0.1 mL刻度）或微量移液器及配套吸头。
2.6 无菌培养皿：直径90 mm。
3 培养基和试剂3.1 双歧杆菌培养基：见附录A.1。
3.2 PYG培养基：见附录A.2。
3.3 甲醇：分析纯。
3.4 三氯甲烷：分析纯。
3.5 冰乙酸：分析纯。
3.6 乳酸：分析纯。
3.7 乙酸标准溶液：吸取分析纯冰乙酸5.7 mL，移入100 mL容量瓶中，加水至刻度，标定方法见附录B.1，此溶液浓度约为1 mol/L。
3.8 乳酸标准溶液：吸取分析纯乳酸8.4 mL，移入100 mL容量瓶中，加水至刻度，标定方法见附录B.1，此溶液浓度约为1 mol/L。
4 检验程序双歧杆菌的检验程序见图1。
图1 双歧杆菌的检验程序5 操作步骤5.1无菌要求：全部操作均应遵循无菌操作程序。
5.2 食品用双歧杆菌纯菌菌种的鉴定及计数5.2.1 鉴定5.2.1.1 接种：半固体或液体菌种直接接种在双歧杆菌琼脂平板。
真空冷冻干燥菌种，先加适量灭菌生理盐水，溶解菌粉，然后接种在双歧杆菌琼脂平板。
平板在36 ℃±1 ℃厌氧培养48 h±2 h。
5.2.1.2 涂片镜检：双歧杆菌为革兰氏染色阳性，不抗酸、无芽孢、无动力，菌体形态多样，呈短杆状、纤细杆状或球形，可形成各种分支或分叉形态。
乳与乳制品微生物检验方法双歧杆菌的检验
乳与乳制品微生物检验方法双歧杆菌的检验YLNB 3.7 1、引用依据：GB/T4789.34-20032、术语和定义双歧杆菌：一群能分解葡萄糖，产生大量乙酸和乳酸，厌氧，不耐酸，不形成芽孢，不运动，细胞呈现多样形态的革兰氏阳性杆菌。
3、仪器及器材3.1培养箱：36±1℃；3.2 恒温水浴：46±1℃；3.3显微镜；3.4厌氧培养箱；3.5离心机；3.6 天平；3.7电炉；3.8吸管；3.9 广口瓶或三角瓶：容量为500ml；3.10 平皿：直径约90mm；3.11 试管；3.12 酒精灯；3.13 灭菌刀或剪子；3.14 灭菌镊子。
4、培养基和试剂4.1 生理盐水；4.2 75%乙醇溶液；4.3 TPY 琼脂培养基；4.4 BL 琼脂培养基；4.5 BBL 琼脂培养基；4.6双歧杆菌生化用基础培养基 ；4.7 PYG 液体培养基；4.8革兰氏染色液；4.9灭菌液体石蜡。
5. 检验程序36±1℃ 72h ±3h37℃ 72 h测定乙酸、乳酸 生化培养观察10天接受PYG 厌氧培养 分纯 厌氧培养 选择2—3个适当稀释度，各取0.1mL 分别涂布于BL,BBL,TPY 培养基 25g （mL ）检样加225mL 灭菌生理盐水，做成几个适当倍数的稀释液 菌中鉴定报菌落计数报告 革兰氏染色，过氧化氢酶试验6、方法6.1以无菌操作将充分混匀的检样25g（ml）放入含有225ml 灭菌生理盐水的灭菌锥形瓶内做成1：10的均匀稀释液。
6.2 用1 ml灭菌吸管吸取1：10稀释液1 ml，沿管壁徐徐注入含有9 ml灭菌生理盐水的试管内，振摇混匀，作成1：100的稀释液。
6.3 另取1 ml灭菌吸管，按上述操作顺序，作10倍递增稀释液，如此每递增一次，即换用1支1ml灭菌吸管。
6.4选取2个～3个以上适宜稀释度，分别在作10倍递增稀释的同时，各取0.1ml分别加入计数培养基平皿，均匀涂布，每个稀释度作两个平皿。
乳与乳制品微生物检验方法双歧杆菌的检验
乳与乳制品微生物检验方法双歧杆菌的检验YLNB 3.7 1、引用依据：GB/T4789.34-20032、术语和定义双歧杆菌：一群能分解葡萄糖，产生大量乙酸和乳酸，厌氧，不耐酸，不形成芽孢，不运动，细胞呈现多样形态的革兰氏阳性杆菌。
3、仪器及器材3.1培养箱：36±1℃；3.2 恒温水浴：46±1℃；3.3显微镜；3.4厌氧培养箱；3.5离心机；3.6 天平；3.7电炉；3.8吸管；3.9 广口瓶或三角瓶：容量为500ml；3.10 平皿：直径约90mm；3.11 试管；3.12 酒精灯；3.13 灭菌刀或剪子；3.14 灭菌镊子。
4、培养基和试剂4.1 生理盐水；4.2 75%乙醇溶液；4.3 TPY 琼脂培养基；4.4 BL 琼脂培养基；4.5 BBL 琼脂培养基；4.6双歧杆菌生化用基础培养基；4.7 PYG 液体培养基；4.8革兰氏染色液；4.9灭菌液体石蜡。
5. 检验程序36±1℃ 72h±3h37℃ 72 h测定乙酸、乳酸生化培养观察10天接受PYG 厌氧培养分纯厌氧培养选择2—3个适当稀释度，各取0.1mL 分别涂布于BL,BBL,TPY 培养基25g （mL ）检样加225mL 灭菌生理盐水，做成几个适当倍数的稀释液菌中鉴定报菌落计数报告革兰氏染色，过氧化氢酶试验6、方法6.1以无菌操作将充分混匀的检样25g（ml）放入含有225ml 灭菌生理盐水的灭菌锥形瓶内做成1：10的均匀稀释液。
6.2 用1 ml灭菌吸管吸取1：10稀释液 1 ml，沿管壁徐徐注入含有9 ml灭菌生理盐水的试管内，振摇混匀，作成1：100的稀释液。
6.3 另取1 ml灭菌吸管，按上述操作顺序，作10倍递增稀释液，如此每递增一次，即换用1支1ml灭菌吸管。
6.4选取2个～3个以上适宜稀释度，分别在作10倍递增稀释的同时，各取0.1ml分别加入计数培养基平皿，均匀涂布，每个稀释度作两个平皿。
双歧杆菌实验操作
双歧杆菌的分离与鉴定一、实验背景双歧杆菌( Bifidobacterium) 系1899 年巴斯德研究院的Tissier首先在以母乳喂养的婴儿粪便中发现并分离出来[1]。
双歧杆菌是人体肠道内重要的益生菌之一，还具有抗肿瘤、抗衰老、营养等作用。
双歧杆菌为专性厌氧菌，对营养条件要求苛刻，活性保持相对比较困难。
因此，研究一种适宜的分离方法具有现实的意义。
为了丰富双歧杆菌菌种资源及开发双杆菌产品，本实验主要是了进行双歧杆菌分离、纯化、生化鉴定以及PCR检测，进行对双歧杆菌的分离与鉴定。
二、实验步骤（一）材料1、分离源母乳喂养的健康婴儿粪便2、培养基和试剂TPY培养基、生理盐水、革兰染料（结晶紫染色液、卢戈氏碘液、95%乙醇、石碳酸复红液）、厌氧袋（硼氢化钾、柠檬酸、碳酸氢钠）、生化鉴定试剂管（F6PPK 试验、乳糖、葡萄糖、硫化氢、纤维二糖、棉籽糖、山梨醇、淀粉、葡萄糖酸盐、木糖、甘露糖、蔗糖、麦芽糖、海藻糖、蜜二糖、甘露醇、吲哚、硝酸盐还原、明胶液化、阿拉伯糖、过氧化氢、联苯胺）、双蒸水、TaKaRa Taq、10×PCR Buffer(Mg2+Plus)、dNTP Mixture(各2.5mM)、16sRNA 90916 F、16sRNA 90916 R、3、设备PCR仪、紫外分光光度仪、凝胶电泳仪、凝胶成像分析系统、恒温培养箱、厌氧罐、无菌操作台、冰箱、显微镜、接种环等微生物实验室所需的常规设备。
（二）实验内容1、样品的采集与处理（1）用灭菌棉签取母乳喂养的健康婴儿的粪便约l g，放入装有9ml生理盐水的无菌试管中，充分振荡摇匀，做成1∶10 的均匀稀释液。
另取1 mL 灭菌的移液管吸取1∶10 的稀释液注入到灭过菌的含有9 mL生理盐水的试管中，充分振荡摇匀，做成1∶100 的均匀稀释液。
按上述操作顺序，依次做成1×10- 3～1×10- 7 梯度的均匀稀释液。
（2）分别取1×10- 1~1×10- 7 梯度的均匀稀释液在TPY培养基平板上进行划线分离（预实验），37℃厌氧培养24~48h观察哪几个梯度的双歧杆菌分离的比较好，然后进行试验。
实验方案(双歧杆菌的分离)
1双歧杆菌的分离1.1样品取出生后20天母乳喂养健康婴儿粪便。
1.2培养基根据目前的双歧杆菌选择性培养基，以及X-Gal在这方面的应用。
选择使用NPNL培养基，在其基础上添加X-Gal。
1.2.1缓冲蛋白胨水溶液（BP）成份：蛋白胨10gA磷酸氢二钠2g葡萄糖5g 磷酸二氢钾2g氯化钠5g 蒸馏水1000ml制法：精确称取各种试剂，加人到1000ml的蒸馏水中，加热溶化后分装于250ml的三角瓶中，每瓶90ml，121°C，杀菌15min后置4°C的冰箱中备用。
1.2.2选择性改良NPNL培养基（苏世彦）成份：酵母膏5g淀粉0.5g蛋白胨10g L-半胱氨酸0.5g胰蛋白胨5g溶液A10ml大豆蛋白胨5g溶液B5ml葡萄糖10g溶液C50ml乳糖3g琼脂A15g吐温801g pH7.2牛肝提取液150ml制法：将各成分准确量取后，分别加热溶化，混合摇匀后分装，121C杀菌10min，备用。
溶液A：K2HPO4 10g、KH2PO4 10g 溶于蒸馏水100ml。
溶液B：FeSO ・7H O 0.2g、MgSO ・7H O 4g、MnSO ・4H O4 2 8^42$ 4 20.135g、NaCl 0.2g 溶于蒸馏水100ml。
溶液C：丙酸钠30g、硫酸巴龙霉素400mg、硫酸新霉素200mg、NaCl 6g溶于蒸馏水1000ml。
1.2.3 NPNL培养基（孙雪）培养基成分及用量：牛肉浸汁粉（oxoid）3g，蛋白胨10g，胰蛋白酶5g，植胨3g,酵母浸出汁5g,肝浸出汁150ml，葡萄糖10g，可溶性淀粉0.5g，溶液A 10ml,溶液B 5ml,吐温80 1g,盐酸半胱氨酸0.5g, 琼脂15g，蒸馏水815ml, X-Gal（5-漠-4-氯-3』引噪-。
-D-半乳糖苷）60mg。
pH 7.2, 121 °C, 15min 高压灭菌。
溶液A：K2HPO4 25g, KH2PO4 25g，蒸馏水250ml。
双歧杆菌实验操作
双歧杆菌实验操作双歧杆菌是一种对人体有益的细菌，它能帮助消化、增强免疫系统以及维持身体健康。
为了了解双歧杆菌的生长和培养条件，进行了以下实验操作。
实验名称：双歧杆菌的培养和生长条件研究实验目的：探究双歧杆菌的最佳生长和培养条件，为后续研究提供基础。
实验材料：1.LB琼脂平板和培养基2.双歧杆菌培养液3.双歧杆菌菌株4.灭菌剂5.培养皿6.培养瓶7.石棉网8.无菌吸管9.无菌培养箱实验步骤：1.准备工作a.所有实验器材要进行高温高压灭菌处理，确保无菌条件。
b.双歧杆菌菌株从冻存物中取出，置于LB琼脂平板上，37℃恒温培养箱中培养过夜。
c.同时准备LB琼脂平板，在培养箱中恒温保持。
2.建立原始菌种a.从培养过夜的LB琼脂平板上选取一个单独的菌落，用无菌吸管轻轻吸取，均匀涂布于另一个LB琼脂平板表面。
b.将新的LB琼脂平板颠倒放置于培养箱中，37℃恒温培养24小时。
c.检查平板上是否有单独的菌落，若有则进行后续实验。
3.建立培养液a.准备LB培养基，加入适量的琼脂，煮沸溶解后静置至37℃。
b.预测双歧杆菌菌株的生长曲线，选择合适的培养液和培养时间。
c.将适量的培养液倒入无菌培养瓶中，盖上无菌瓶盖，并用石棉网覆盖。
4.培养和生长a.在培养液中加入适量的双歧杆菌菌株，以达到适合培养的细菌浓度。
b.将培养瓶置于37℃恒温培养箱中。
c.每天监测双歧杆菌的生长情况，记录菌株的数量和培养液的浑浊度。
5.结果分析a.观察双歧杆菌的生长情况，包括生长速度、最适生长温度和最适培养液pH值。
b.对实验数据进行统计分析，绘制生长曲线和生长速率图。
c.比较不同因素对双歧杆菌生长的影响，并得出结论。
实验注意事项：1.所有实验用具和培养基要进行高温高压灭菌处理。
2.在操作过程中要保持无菌环境，避免外界细菌的污染。
3.严格遵守实验室安全规范，避免接触到有害物质。
4.在实验过程中要定期检查和记录双歧杆菌的生长情况，以便后续分析和对比。
双歧杆菌的培养
双歧杆菌的培养和分离双歧杆菌是专性厌氧菌，对氧气非常敏感，因此，双歧杆菌的分离、培养及活菌计数的关键是提供无氧和低氧化还原电势的培养环境。
双歧杆菌的最适生长温度37℃~41℃，最低生长温度25℃~28℃，最高43℃~45℃。
初始最适pH 6.5~7.0，在pH4.5~5.0或pH 8.0~8.5不生长。
其细胞呈现多样形态，有短杆较规则形、纤细杆状具有尖细末端形、球形、长杆弯曲形、分枝或分叉形、棍棒状或匙形。
单个或链状、V形、栅栏状排列，或聚集成星状。
革兰氏阳性，不抗酸，不形成芽孢，不运动。
双歧杆菌的菌落光滑、凸圆、边缘完整、乳脂至白色、闪光并具有柔软的质地。
双歧杆菌是人体内的正常生理性细菌，定殖于肠道内，是肠道的优势菌群，占婴儿消化道菌丛的92%。
该菌与人体终生相伴，其数量的多少与人体健康密切相关，是目前公认的一类对机体健康有促进作用的代表性有益菌。
该菌可以在肠粘膜表面形成一个生理性屏障，从而抵御伤寒沙门氏菌、致泻性大肠杆菌，痢疾致贺氏菌等病原菌的侵袭，保持机体肠道内正常的微生态平衡；能激活巨噬细胞的活性，增强机体细胞的免疫力；能合成B族维生素、烟酸和叶酸等多种维生素；能控制内毒素血症和防治便秘，预防贫血和佝偻病；可降低亚硝胺等致癌物前体的形成，有防癌和抗癌作用；能拮抗自由基、羟自由基及脂质过氧化，具有抗衰老功能。
双歧杆菌的培养方法很多，如厌氧箱法、厌氧袋法、厌氧罐法。
本实验介绍的是一种简便的试管培养法——亨盖特厌氧滚管技术该技术的优点是：预还原培养基制好后，可随时取用进行试验；任何时间观察或检查试管内的菌都不会干扰厌氧条件。
近年来兴起的一种新的RAPD等分子生物学技术对双歧杆菌进行基因指纹图谱的构建，分析不同双歧杆菌种间存在的同源性和多态性；RAPD技术也可用于双歧杆菌菌种鉴定及分型。
一般来讲，我们都应用适合鉴定所有厌氧菌的方法，主要包括双歧杆菌特定酶的检测、乙酸、乳酸等有机酸的测定、糖发酵试验和其他相关指标等。
双歧杆菌检验(食品微生物学检验)
食品安全国家标准食品微生物学检验双歧杆菌检验1范围本标准规定了双歧杆菌(B i f i d o b a c t e r i u m)的鉴定及计数方法㊂本标准适用于双歧杆菌纯菌菌种的鉴定及计数㊂本标准适用于食品中仅含有单一双歧杆菌的菌种鉴定㊂本标准适用于食品中仅含有双歧杆菌属的计数,即食品中可包含一个或多个不同的双歧杆菌菌种㊂2设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下:2.1恒温培养箱:36ħʃ1ħ㊂2.2冰箱:2ħ~5ħ㊂2.3天平:感量0.01g㊂2.4无菌试管:18mmˑ180mm㊁15mmˑ100mm㊂2.5无菌吸管:1m L(具0.01m L刻度)㊁10m L(具0.1m L刻度)或微量移液器(200μL~1000μL)及配套吸头㊂2.6无菌培养皿:直径90mm㊂3培养基和试剂3.1双歧杆菌培养基:见A.1㊂3.2 P Y G培养基:见A.2㊂3.3 M R S培养基:见A.3㊂3.4甲醇:分析纯㊂3.5三氯甲烷:分析纯㊂3.6硫酸:分析纯㊂3.7冰乙酸:分析纯㊂3.8乳酸:分析纯㊂4检验程序双歧杆菌的检验程序见图1㊂图1双歧杆菌的检验程序5操作步骤5.1无菌要求全部操作过程均应遵循无菌操作程序㊂5.2双歧杆菌的鉴定5.2.1纯菌菌种5.2.1.1样品处理:半固体或液体菌种直接接种在双歧杆菌琼脂平板或M R S琼脂平板㊂固体菌种或真空冷冻干燥菌种,可先加适量灭菌生理盐水或其他适宜稀释液,溶解菌粉㊂5.2.1.2接种:接种于双歧杆菌琼脂平板或M R S琼脂平板㊂36ħʃ1ħ厌氧培养48hʃ2h,可延长至72hʃ2h㊂5.2.2食品样品5.2.2.1样品处理:取样25.0g(m L),置于装有225.0m L生理盐水的灭菌锥形瓶或均质袋内,于8000r/m i n~10000r/m i n均质1m i n~2m i n,或用拍击式均质器拍打1m i n~2m i n,制成1ʒ10的样品匀液㊂冷冻样品可先使其在2ħ~5ħ条件下解冻,时间不超过18h;也可在温度不超过45ħ的条件解冻,时间不超过15m i n㊂5.2.2.2接种或涂布:将上述样品匀液接种在双歧杆菌琼脂平板或M R S琼脂平板,或取0.1m L适当稀释度的样品匀液均匀涂布在双歧杆菌琼脂平板或M R S琼脂平板㊂36ħʃ1ħ厌氧培养48hʃ2h,可延长至72hʃ2h㊂5.2.2.3纯培养:挑取3个或以上的单个菌落接种于双歧杆菌琼脂平板或M R S琼脂平板㊂36ħʃ1ħ厌氧培养48hʃ2h,可延长至72hʃ2h㊂5.2.3菌种鉴定5.2.3.1涂片镜检:挑取双歧杆菌平板或M R S平板上生长的双歧杆菌单个菌落进行染色㊂双歧杆菌为革兰氏染色阳性,呈短杆状㊁纤细杆状或球形,可形成各种分支或分叉等多形态,不抗酸,无芽孢,无动力㊂5.2.3.2生化鉴定:挑取双歧杆菌平板或M R S平板上生长的双歧杆菌单个菌落,进行生化反应检测㊂过氧化氢酶试验为阴性㊂双歧杆菌的主要生化反应见表1㊂可选择生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统㊂表1双歧杆菌菌种主要生化反应编号项目两歧双歧杆菌(B.b i f i d u m)婴儿双歧杆菌(B.i n f a n t i s)长双歧杆菌(B.l o n g u m)青春双歧杆菌(B.a d o l e s c e n t i s)动物双歧杆菌(B.a n i m a l i s)短双歧杆菌(B.b r e v e)1L-阿拉伯糖--+++-2D-核糖-+++++ 3D-木糖-++d++ 4L-木糖------5阿东醇------6D-半乳糖d+++d+ 7D-葡萄糖++++++ 8D-果糖d++d d+ 9D-甘露糖-++---10L-山梨糖------表1(续)编号项目两歧双歧杆菌(B.b i f i d u m)婴儿双歧杆菌(B.i n f a n t i s)长双歧杆菌(B.l o n g u m)青春双歧杆菌(B.a d o l e s c e n t i s)动物双歧杆菌(B.a n i m a l i s)短双歧杆菌(B.b r e v e)11L-鼠李糖------12卫矛醇------13肌醇-----+ 14甘露醇----a--a 15山梨醇----a--a 16α-甲基-D-葡萄糖甙--+---17N-乙酰-葡萄糖胺-----+ 18苦杏仁甙(扁桃甙)---++-19七叶灵--+++-20水杨甙(柳醇)-+-++-21D-纤维二糖-+-d--22D-麦芽糖-+++++ 23D-乳糖++++++ 24D-蜜二糖-+++++ 25D-蔗糖-+++++ 26D-海藻糖(覃糖)------27菊糖(菊根粉)--a--a--a 28D-松三糖--++--29D-棉籽糖-+++++ 30淀粉---+--31肝糖(糖原)------32龙胆二糖-+-+++ 33葡萄糖酸钠---+--注:+表示90%以上菌株阳性;-表示90%以上菌株阴性;d表示11%~89%以上菌株阳性;a表示某些菌株阳性㊂5.2.3.3有机酸测定:测定双歧杆菌的有机酸代谢产物(可选项),见附录B㊂5.3双歧杆菌的计数5.3.1纯菌菌种5.3.1.1固体和半固体样品的制备:以无菌操作称取2.0g样品,置于盛有198.0m L稀释液的无菌均质杯内,8000r/m i n~10000r/m i n均质1m i n~2m i n,或置于盛有198.0m L稀释液的无菌均质袋中,用拍击式均质器拍打1m i n~2m i n,制成1ʒ100的样品匀液㊂5.3.1.2液体样品的制备:以无菌操作量取1.0m L样品,置于9.0m L稀释液中,混匀,制成1ʒ10的样品匀液㊂5.3.2食品样品5.3.2.1样品处理:取样25.0g(m L),置于装有225.0m L生理盐水的灭菌锥形瓶或均质袋内,于8000r/m i n~10000r/m i n均质1m i n~2m i n,或用拍击式均质器拍打1m i n~2m i n,制成1ʒ10的样品匀液㊂冷冻样品可先使其在2ħ~5ħ条件下解冻,时间不超过18h;也可在温度不超过45ħ的条件解冻,时间不超过15m i n㊂5.3.3系列稀释及培养用1m L无菌吸管或微量移液器,制备10倍系列稀释样品匀液,于8000r/m i n~10000r/m i n均质1m i n~2m i n,或用拍击式均质器拍打1m i n~2m i n㊂每递增稀释一次,即换用1次1m L灭菌吸管或吸头㊂根据对样品浓度的估计,选择2个~3个适宜稀释度的样品匀液,在进行10倍递增稀释时,吸取1.0m L样品匀液于无菌平皿内,每个稀释度做两个平皿㊂同时,分别吸取1.0m L空白稀释液加入两个无菌平皿内作空白对照㊂及时将15m L~20m L冷却至46ħ的双歧杆菌琼脂培养基或MR S琼脂培养基(可放置于46ħʃ1ħ恒温水浴箱中保温)倾注平皿,并转动平皿使其混合均匀㊂从样品稀释到平板倾注要求在15m i n内完成㊂待琼脂凝固后,将平板翻转,36ħʃ1ħ厌氧培养48hʃ2h,可延长至72hʃ2h㊂培养后计数平板上的所有菌落数㊂5.3.4菌落计数5.3.4.1可用肉眼观察,必要时用放大镜或菌落计数器,记录稀释倍数和相应的菌落数量㊂菌落计数以菌落形成单位(c o l o n y-f o r m i n g u n i t s,C F U)表示㊂5.3.4.2选取菌落数在30C F U~300C F U之间㊁无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数㊂低于30C F U 的平板记录具体菌落数,大于300C F U的可记录为多不可计㊂每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数㊂5.3.4.3其中一个平板有较大片状菌落生长时,则不宜采用,而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数;若片状菌落不到平板的一半,而其余一半中菌落分布又很均匀,即可计算半个平板后乘以2,代表一个平板菌落数㊂5.3.4.4当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时,则将每条单链作为一个菌落计数㊂5.3.5结果的表述5.3.5.1若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内,计算两个平板菌落数的平均值,再将平均值乘以相应稀释倍数,作为每克或每毫升中菌落总数结果㊂5.3.5.2若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时,按式(1)计算:N= C(n1+0.1n2)d (1)式中:N 样品中菌落数;C 平板(含适宜范围菌落数的平板)菌落数之和;n1 第一稀释度(低稀释倍数)平板个数;n2 第二稀释度(高稀释倍数)平板个数;d 稀释因子(第一稀释度)㊂5.3.5.3若所有稀释度的平板上菌落数均大于300C F U,则对稀释度最高的平板进行计数,其他平板可记录为多不可计,结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算㊂5.3.5.4若所有稀释度的平板菌落数均小于30C F U,则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算㊂5.3.5.5若所有稀释度(包括液体样品原液)平板均无菌落生长,则以小于1乘以最低稀释倍数计算㊂5.3.5.6若所有稀释度的平板菌落数均不在30C F U~300C F U之间,其中一部分小于30C F U或大于300C F U时,则以最接近30C F U或300C F U的平均菌落数乘以稀释倍数计算㊂5.3.6菌落数的报告5.3.6.1菌落数小于100C F U时,按 四舍五入 原则修约,以整数报告㊂5.3.6.2菌落数大于或等于100C F U时,第3位数字采用 四舍五入 原则修约后,取前2位数字,后面用0代替位数;也可用10的指数形式来表示,按 四舍五入 原则修约后,采用两位有效数字㊂5.3.6.3称重取样以C F U/g为单位报告,体积取样以C F U/m L为单位报告㊂5.4结果与报告根据5.2.3.1㊁5.2.3.2,5.2.3.3结果,报告双歧杆菌属的种名㊂根据5.3.6菌落计数结果出具报告,报告单位以C F U/g(m L)表示㊂附录A培养基和试剂A.1双歧杆菌琼脂培养基A.1.1成分蛋白胨15.0g酵母浸膏2.0g葡萄糖20.0g可溶性淀粉0.5g氯化钠5.0g西红柿浸出液400.0m L吐温801.0m L肝粉0.3g琼脂粉20.0g加蒸馏水至1000.0m LA.1.2制法A.1.2.1半胱氨酸盐溶液的配制:称取半胱氨酸0.5g,加入1.0m L盐酸,使半胱氨酸全部溶解,配制成半胱氨酸盐溶液㊂A.1.2.2西红柿浸出液的制备:将新鲜的西红柿洗净后称重切碎,加等量的蒸馏水在100ħ水浴中加热,搅拌90m i n,然后用纱布过滤,校正p H7.0ʃ0.1,将浸出液分装后,121ħ高压灭菌15m i n~ 20m i n㊂A.1.2.3制法:将A.1.1所有成分加入蒸馏水中,加热溶解,然后加入半胱氨酸盐溶液,校正p H至6.8ʃ0.1㊂分装后121ħ高压灭菌15m i n~20m i n㊂A.2P Y G液体培养基A.2.1成分蛋白胨10.0g葡萄糖2.5g酵母粉5.0g半胱氨酸-H C l 0.25g盐溶液20.0m L维生素K1溶液0.5m L氯化血红素溶液5m g/m L2.5m L加蒸馏水至500.0m LA.2.2制法A.2.2.1盐溶液的配制:称取无水氯化钙0.2g,硫酸镁0.2g,磷酸氢二钾1.0g,磷酸二氢钾1.0g,碳酸。
双歧杆菌
大肠菌群的测定
(平板计数法)
1. 应用范围
生产过程样品和成品的大肠菌群测定。
2.大肠菌群培养基(MERCK 1.02894 DESOXYCHOLATE LACTOSE AGAR)
∙称培养基10克于洁净的锥形瓶中，加蒸馏水稀释至250毫升 (pH: 7.1±0.1 在25°C)。
∙沸水浴上蒸至完全溶解。
∙在沸水浴上持续消毒1~1个半小时。
∙冷却至46±1°C，即可浇平皿（培养基必须当天用完）。
3.大肠菌群的检测方法
1）样品表面用75%酒精棉消毒，吸管用火焰灼烧无菌。
2）准确吸取样品液1毫升于平皿中（酸奶和酸奶饮品样品还要加1毫升0.1N 的NaOH中和液），并在平皿表面清晰标明样品信息。
3）在平皿中倾注13~15毫升大肠菌群培养基，倾注培养基时，切勿将平皿全部开启，以免空气中尘埃及细菌落入。
4）轻转平皿底，使样液均匀分散于培养基中。
5）打开紫外灯及净化台，使平皿培养基完全凝结后，翻转平皿，放入30°C + 1°C培养箱进行培养。
6）24小时 + 2小时后读数，记录，单位：cfu/ml。
双歧杆菌分离培养鉴定
双歧杆菌分离培养鉴定1 设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：2.1 恒温培养箱：36 ℃±1 ℃。
2.2 气相色谱仪配FID检测器。
2.3 冰箱：2 ℃～5 ℃。
2.4 天平：感量0.1 g。
2.5 无菌试管：18 mm×180 mm、15 mm×100 mm。
2.6 无菌吸管：1 mL（具0.01 mL 刻度）、10 mL（具0.1 mL刻度）或微量移液器（200μL～1000μL）及配套吸头。
2.7 无菌锥形瓶：500 mL、250 mL。
2.8 显微镜2 培养基和试剂3.1 BS培养基3.2 PYG培养基3.3 TPY培养基3.4 NPNL 培养基3.5 X-GAL 培养基3.6 氟化钠：化学纯。
3.7 碘乙酸钠或碘乙酸钾：化学纯。
3.8 果糖-6-磷酸盐：化学纯。
3.9 盐酸羟胺(Hydroxy Lamine-HCl)：化学纯。
3.10 三氯乙酸(TCA)：化学纯。
3.11 三氯化铁（FeCl3·6H2O）：化学纯。
3.12 甲醇:分析纯。
3.13 三氯甲烷：分析纯。
3.14 硫酸：分析纯。
3.15 冰乙酸：分析纯。
3.16 乳酸：分析纯。
3.17 乙酸标准溶液: 吸取分析纯冰乙酸5.7mL,移入100mL容量瓶中,加水至刻度,标定,标定方法见附录B.1,此溶液浓度约为1mol/L。
3.18 乙酸标准使用液:将经标定的乙酸标准溶液用水稀释至0.01mol/L。
3.19 乳酸标准溶液: 吸取分析纯乳酸8.4mL,移入100mL容量瓶中,加水至刻度,标定,标定方法见附录B.2，此溶液浓度约为1mol/L。
3.20 乳酸标准使用液: 将经标定的乳酸标准溶液用水稀释至0.01mol/L。
3 双歧杆菌的分离和培养在无菌室内无菌称取1g双歧杆菌制剂，根据标示的活菌数量，用灭菌稀释液进行10倍梯度稀释至104-107，然后吸取0.2mL涂布于BS和NPNL琼脂平板上，放于厌氧培养箱内培养48到72小时.然后挑选菌落特征为光华、凸圆、边缘整齐、白色或乳脂色、质地柔软的中小菌落，接种于TPY琼脂平板上厌氧培养。
酶学鉴定-双歧杆菌
ⅱ6糖-6-磷酸盐80 mg/mL水溶液。
⑤加试剂ⅳ0.750mL,室温10 min。
ⅳ现用现配。盐酸羟胺139 mg/mL。酸性极强，用氢氧化钠中和至pH6.5。
⑥加试剂ⅴ和ⅵ各500 µL,室温5 min。
ⅴ三氯乙酸（TCA）水溶液15 g/100 mL。
缓冲液ⅰ：现用现配。取0.05 M Na2HPO4 31.5 mL和0.05 M NaH2PO468.5 mL,再加500 mg/L半胱氨酸-盐酸盐。
③用超声波粉碎仪，400 W条件下；每处理5 s、间隔5 s,超声粉碎8 min，至菌体溶液呈半透明。
④破碎后，取0.5 mL于离心管中，加试剂ⅱ和ⅲ各125 µL,37℃保温30 min。
②配制展开剂——正丁醇:甲酸:水=80:15:5
③配制标准液——配制1.5%的乳酸、1.5%的乙酸溶液
④制备待测样品——将菌种37℃培养24h后离心，收集上清液
⑤点样——用毛细管分别吸取发酵液，多次点样于滤纸条上，样点直径不宜超过2mm，平衡2h
⑥层析——将点好样的层析纸放入，使点有样品的一端浸在展开剂中，但不可浸及样点。观察展开情况，待展开剂前沿到达离层析纸另一端约1.5cm处，取出层析纸。
⑦ 显色——以3%溴甲酚蓝酒精溶液为显色剂，待层析液挥发之后，向层析滤纸喷洒并计算Rf值。
注释：物质被分离后在纸层析图谱上的位置是用Rf值(比移值Rfvalue又称Rf值)来表示：
Rf=原点到层析中心的距离/原点到溶剂前沿的距离
在一定的条件下某种物质的Rf值是常数。Rf值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量和层析温度等因素有关，是一个定性分析的重要参数。
双歧杆菌的培养方法
双歧杆菌的培养方法双歧杆菌（Bifidobacterium）是一类存在于人体肠道中的重要益生菌，它对于人体的消化道健康具有重要的作用。
为了研究和应用双歧杆菌，科学家需要掌握双歧杆菌的培养方法，以获取足够的菌种进行实验和研究。
本文将介绍几种常用的双歧杆菌培养方法，包括固体培养、液体培养以及前处理方法。
一、固体培养方法固体培养是最常用的培养双歧杆菌的方法之一。
它可以提供双歧杆菌生长所需的营养和支持，并且有助于保持菌种的纯度。
1. 准备培养基：选择适合双歧杆菌生长的培养基，如MRS培养基或BHI培养基。
按照培养基说明书中的配方和比例准备固体培养基。
2. pH调节：将培养基溶解在适当的pH值的磷酸盐缓冲溶液中。
通常，双歧杆菌适宜的pH范围为6.0-7.0。
3. 加糖：在溶液中加入适量的葡萄糖或乳糖，以为双歧杆菌提供能量和碳源。
4. 加入琼脂：将适量的琼脂溶解在溶液中，搅拌均匀。
5. 烧瓶灭菌和注种：将制备好的培养基倒入装有铺过纱布的烧瓶中，用高压灭菌器进行高压灭菌。
待瓶内温度降至适宜温度后，将双歧杆菌菌种接种于培养基表面。
6. 孵育：将接种好的培养基置于恒温培养箱中，一般在37℃下孵育24-48小时，直到菌落形成。
二、液体培养方法液体培养适合需要大规模培养双歧杆菌菌种的情况，同时也可用于进行生长动力学和代谢产物研究。
1. 准备培养基：选择适合双歧杆菌生长的液体培养基，如MRS培养基或BHI培养基。
按照培养基说明书中的配方和比例准备液体培养基。
2. pH调节：将培养基调节至适当的pH值。
3. 加入糖和其他营养成分：在培养基中加入适量的葡萄糖或乳糖，以为双歧杆菌提供能量和碳源。
根据需要，可以添加其他必要的营养成分，如氨基酸、维生素等。
4. 灭菌和注种：用高压灭菌器进行高压灭菌，待培养基温度降至适宜菌种生长温度后，将双歧杆菌菌种接种于培养基中。
5. 摇床培养：将接种好的培养基装入适当容量的摇床，设置适当的摇床转速和温度，进行培养。
微生物学实验报告——双歧杆菌分离
微生物学实验报告乳酸菌分离纯化——双歧杆菌的分离纯化2012/6/5实验目的：从酸奶等富含乳酸菌的物质中分离到具有活性的双歧杆菌并进行初步鉴定。
实验原理：双歧杆菌是动物体肠道内的正常优势生理细菌，革兰氏阳性，无芽孢，没有运动能力，最适生长温度37℃~41℃，专性厌氧。
双歧杆菌的细胞呈现多样形态，有短杆较规则形、纤细杆状具有尖细末端形、球形、长杆弯曲形、分枝或分叉形、棍棒状或匙形。
单个或链状、V形、栅栏状排列，或聚集成星状。
双歧杆菌的菌落光滑、凸圆、边缘完整、乳脂至白色、闪光并具有柔软的质地(7)。
因为双歧杆菌是严格厌氧细菌，所以双歧杆菌的培养条件必须无氧，且培养基要具有低氧化还原电势。
培养双歧杆菌最常用的方法是亨盖特厌氧滚管法(1, 5, 7)，此外还有厌氧箱法，厌氧袋法和厌氧罐法等。
亨盖特厌氧滚管法是亨盖特（Hungate）于1950年发展起来的一套严格厌氧微生物的培养技术，主要原理是利用铜柱氧化除氧的滚管分离纯化法。
亨盖特厌氧滚管法的优点是可以实时检查培养物，无氧效果好且花费不高，但需要专门的仪器和技术性很强的操作。
本实验采用的简易厌氧罐法是一种操作简单且成本很低的方法，主要原理是利用焦性没食子酸除去厌氧罐内的氧气。
该方法的缺点是焦性没食子酸与NaOH反应过程中会产生一定量的NO，可能不利于细菌的生长；此外，过量的NaOH 会将厌氧罐中的CO2一起除掉，而CO2对多数厌氧菌的生长有促进作用。
另外，在同一个培养皿上接种好氧细菌（如大肠杆菌和枯草杆菌）能加强除氧的效果。
本实验所用的培养基参考了NPNL培养基(6)和BS培养基的配方，其中鱼粉、牛肉膏、酵母浸粉、胰蛋白胨的作用是提供氮源、维生素和生长因子，葡萄糖和乳糖为乳酸菌发酵提供糖类底物，磷酸氢二钾和磷酸二氢钾为酸碱缓冲剂，硫酸亚铁、硫酸锰为乳酸菌提供生长因子，氯化钠维持均衡的渗透压。
如果在培养基中加入一定浓度的抗生素，比如硫酸卡那霉素（75μg/ml）、硫酸新霉素（30-200μg/ml）、硫酸巴龙霉素（20-200μg/ml）、萘啶酮酸（15或80μg/ml）、氧化锂（3mg/ml）、丙酸钠（10或15g/L）、山梨酸（0.4g/L）等，培养基就成为双歧杆菌的选择性培养基(7)。
双歧杆菌的培养鉴定
双歧杆菌的培养鉴定双歧杆菌是一种重要的益生菌，具有改善肠道微生态、调节免疫、预防疾病等重要作用。
以下介绍双歧杆菌的培养鉴定过程，包括培养基选择、菌种活化、生长条件优化、菌落形态观察、生理生化特性分析、基因组DNA测序及分析、表面抗原检测、药敏试验、动物模型实验和临床试验等方面。
1.培养基选择双歧杆菌的培养需要特定的培养基。
常用的培养基为MRS培养基，它是一种高营养的培养基，含有多种氨基酸、维生素和无机盐等，能够满足双歧杆菌生长所需的营养。
此外，也可使用其他选择性培养基进行培养。
2.菌种活化在培养前，需要对双歧杆菌菌种进行活化。
将菌种接种到MRS培养基中，在适宜的温度和环境下培养一定时间，使菌种恢复活性。
一般培养时间为24-48小时。
3.生长条件优化双歧杆菌的生长受到多种因素的影响，如温度、pH值、氧气浓度等。
在培养过程中，需要优化生长条件，以提高双歧杆菌的生长速率和产量。
例如，在37℃、pH值为6.5的环境下培养，有利于双歧杆菌的生长。
4.菌落形态观察在MRS培养基上接种双歧杆菌后，需要在适宜的温度和环境下培养一定时间，观察菌落的形态和大小。
正常的双歧杆菌菌落为圆形、隆起、湿润、光滑，颜色为乳白色或略带黄色。
如果菌落形态和颜色出现异常，可能提示菌种发生变异或污染。
5.生理生化特性分析通过生理生化试验可以进一步鉴定双歧杆菌的种类和特性。
例如，通过糖发酵试验可以检测双歧杆菌对不同糖类的利用能力；通过耐酸试验可以检测双歧杆菌在胃部的存活能力；通过抗氧化试验可以检测双歧杆菌的抗氧化能力等。
这些试验结果有助于鉴定双歧杆菌的生理生化特性。
6.基因组DNA测序及分析通过基因组DNA测序技术可以获得双歧杆菌的基因组信息，进而分析其系统发育关系、遗传背景和进化历程等。
通过对基因组的比较和分析，可以发现双歧杆菌的不同亚种之间的差异和相似性，为益生菌的研究和应用提供科学依据。
7.表面抗原检测表面抗原是微生物表面的一类化学成分，具有抗原特异性。
食物中双歧杆菌查验方式
食物中双歧杆菌查验方式
环凯针对目前乳制品行业及质量监测单位查验双歧杆菌的需求及情形，对双歧杆菌查验相应的培育基进行了改良，使得双歧杆菌检出率较之前有专门大的改良。
扩充并完善了相关的微生物检测试剂，使得技术操作人员能更准确、快捷的检测出目标菌。
环凯依据GB 食物卫生微生物学查验双歧杆菌查验，推出成套的双歧杆菌查验解决方案，为生产企业及查验单位提供方便。
图1：GB 双歧杆菌查验流程图
表1：实验操作所用及生化试剂
功能阶段实
验
产品序
号
产品名称规格类别。
乳酸菌 双歧杆菌
1.2.3嗜热链球菌计数：选择2个～3个连续的适宜稀释度，每个稀释度吸取1mL样品匀液于灭菌培养皿内，每个平皿加入15mL MC琼脂培养基，36℃±1℃需氧培养72 h±2 h，培养后计数。
1.2乳酸菌计数：
1.2.1乳酸菌总数：依据样品中所包括乳酸菌菌属，按GB4789.35—2016中表1选择相应的培养条件。
1.2.2双歧杆菌计数：选择2个～3个连续的适宜稀释度，每个稀释度吸取1mL样品匀液于灭菌培养皿内，每个平皿加入15mL莫匹罗星锂盐和半胱氨酸盐酸盐改良MRS琼脂培养基，36℃±1℃厌氧培养72 h±2 h，培养后计数平板上的所有菌落数。
4.计算与结论：
10-3
10-4
10-5
10-6
10-7
10-8
10-9
空白
结果
双歧杆菌数（CFU/g.mL)
1#
2#
嗜热链球菌数（CFU/g.mL)
1#
2#
乳杆菌数（CFU/g.mL)
1#
2#
双歧+乳杆（CFU/g.mL)
1#
2#
乳酸菌总数（CFU/g.mL）=
限量：
□合格□不合格□实测
检验：复核：共页第页
1.2.4乳杆菌计数：选择2个～3个连续的适宜稀释度，每个稀释度吸取1mL样品匀液于灭菌培养皿内，每个平皿加入15mL MRS琼脂培养基，36℃±1℃厌氧培养72 h±2 h。
2.主要设备： SB2040电子天平 SB1670恒温培养箱
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双歧杆菌的分离与鉴定
一、实验背景
双歧杆菌( Bifidobacterium) 系1899 年巴斯德研究院的Tissier首先在以母乳喂养的婴儿粪便中发现并分离出来[1]。
双歧杆菌是人体肠道内重要的益生菌之一，还具有抗肿瘤、抗衰老、营养等作用。
双歧杆菌为专性厌氧菌，对营养条件要求苛刻，活性保持相对比较困难。
因此，研究一种适宜的分离方法具有现实的意义。
为了丰富双歧杆菌菌种资源及开发双杆菌产品，本实验主要是了进行双歧杆菌分离、纯化、生化鉴定以及PCR检测，进行对双歧杆菌的分离与鉴定。
二、实验步骤
（一）材料
1、分离源
母乳喂养的健康婴儿粪便
2、培养基和试剂
TPY培养基、生理盐水、革兰染料（结晶紫染色液、卢戈氏碘液、95%乙醇、石碳酸复红液）、厌氧袋（硼氢化钾、柠檬酸、碳酸氢钠）、生化鉴定试剂管（F6PPK 试验、乳糖、葡萄糖、硫化氢、纤维二糖、棉籽糖、山梨醇、淀粉、葡萄糖酸盐、木糖、甘露糖、蔗糖、麦芽糖、海藻糖、蜜二糖、甘露醇、吲哚、硝酸盐还原、明胶液化、阿拉伯糖、过氧化氢、联苯胺）、双蒸水、TaKaRa Taq、10×PCR Buffer(Mg2+Plus)、dNTP Mixture(各2.5mM)、16sRNA 90916 F、16sRNA 90916 R、3、设备
PCR仪、紫外分光光度仪、凝胶电泳仪、凝胶成像分析系统、恒温培养箱、厌氧罐、无菌操作台、冰箱、显微镜、接种环等微生物实验室所需的常规设备。
（二）实验内容
1、样品的采集与处理
（1）用灭菌棉签取母乳喂养的健康婴儿的粪便约l g，放入装有9ml生理盐水的无菌试管中，充分振荡摇匀，做成1∶10 的均匀稀释液。
另取1 mL 灭菌的移液管吸取1∶10 的稀释液注入到灭过菌的含有9 mL生理盐水的试管中，充分振荡摇匀，做成1∶100 的均匀稀释液。
按上述操作顺序，依次做成1×10- 3～1×10- 7 梯度的均匀稀释液。
（2）分别取1×10- 1~1×10- 7 梯度的均匀稀释液在TPY培养基平板上进行划线分离（预实验），37℃厌氧培养24~48h观察哪几个梯度的双歧杆菌分离的比较好，然后进行试验。
（例如1×10- 5~1×10- 7 )
3、分离培养
用接种环取a、b、c三种梯度的稀释液中的双歧杆菌进行TPY培养基平板划线分
离，每个梯度的稀释液划2块平皿，并做空白对照。
37℃厌氧培养24~48h。
4、革兰染色和镜检
双歧杆菌经24~48h 培养后多数形成直径为0.5 ~ 1mm、凸起、边缘整齐、乳白色或灰白色不透明的菌落，菌体宽约0.5μm，长度在1~6μm 之间，有弯曲和分叉现象，形成双歧杆菌特有的“V”或“Y”结构[1]。
挑选平板上菌落较小、光滑、凸圆、边缘整齐、白色或乳白色不透明、质地柔软的特征菌落[2]，取菌落的一半进行涂片，然后进行革兰氏染色，如果挑选的菌落是革兰氏阳性、显微镜下具有双歧杆菌形态特征，如菌体形状不太规则，呈弧形、两端大小不一、V 形或Y 形的菌落，那么取菌落的另一半进行划线平板分离培养，再革兰染色和镜检。
重复上述实验2~3次，直至出现分离出纯净的单个菌落。
5、生化鉴定
取分离纯化的双歧杆菌菌落，分别接种在以上几种生化鉴定试剂管内，并用液态石蜡油封口，观察其反应结果。
6、PCR法检测
从步骤4中分离出来的纯净单菌落进行大面积的一区划线，37℃厌氧培养24~48h。
取培养好的双歧杆菌接种到装有双蒸水的离心管中，摇匀，离心5 000 r/min,5 min, 弃上清, 用双蒸水重悬后同上离心, 双蒸水再次重悬, 煮沸15 min, 离心12 000 r/min, 5 min，取上清,即DNA。
配置PCR扩增体系：10×PCR Buffer(Mg2+Plus)15μl、TaKaRa Taq0.75μl、dNTP Mixture(各2.5mM)12μl、16sRNA 90916 F3μl、16sRNA 90916 R3μl、双蒸水111.75 μl，各成分依次加入到灭菌2 ml 离心管中（超净台内操作），离心10s.同时以装有49ul体系、1ul双蒸水无菌离心管作为阴性对照。
将配制好的PCR体系放置于PCR仪中进行扩增。
PCR 循环参数及扩增条件: 94 ℃预变性5 min, 30 个循环( 94℃ 30s, 53℃ 30s, 72 ℃ 90s) , 72℃延伸8 min。
将5 ul的6×Loading Buffer 和1ul的PCR产物充分混合均匀，注入到凝胶孔中，同时在注入4 ul 1 kb marker。
电泳30 min，置于全自动凝胶成像分析系统下，观察处理得到的条带。
三、实验结果
双歧杆菌特征
样品稀释
度菌
数
菌落特征个体特征颜色边缘大小透明度高度形状革兰染色
1×10- 5（a）1×10- 5（b）1×10- 6（a）1×10- 6（b）
双歧杆菌生化鉴定结果
菌种 项目 1×10- 5（a ） 1×10- 5（b ） 1×10- 6（a ） 1×10- 6（b ） 1×10- 7（a ） 1×10- 7（b ） 对照组
阿拉伯糖 乳糖 纤维二糖 棉籽糖 山梨醇 淀粉 葡萄糖酸盐 木糖 甘露糖 蔗糖 麦芽糖 海藻糖 蜜二糖 甘露醇 吲哚 硝酸盐还原 明胶液化 硫化氢 过氧化氢 联苯胺 F6PPK
文献：
[ 1] James A, et al. Bifido bo uteria [ J] . Bacter olo gical River s, 1973, 48: 136～142 [ 2] 王建业,王永坤,朱国强.猪源双歧杆菌筛选及生物特性参数测定[J].扬州大学学报(自然科学版),2000,3(3):23-27
1×10- 7（a ） 1×10- 7（b ） 对照组
[ 3]文钰，杨汝德，猪源双歧杆菌的分离纯化及初步鉴定[J].现代食品科技
[ 4]Wei G,Pan L,Du H, et al.ERIC-PCR fingerprinting-based community DNA hybridization to pinpoint genome-specific fragmenta as molecular markera to identify and track populations common to healthy human guts.J Microbiol,2004,59(1):91-108.
[5]Satokari R M.Vaughan E E,Akkermans A,et al.Bifidobacterial diversity in human feces detected by genus-specific PCR and denaturing gradient gel eletrophoresis.Appl Environ Microbiol,2001,67(2):504-513.
[6]胡晓红, 彭惠民, 刘昕, 黄正根, 袁科,PCR 及Real- time PCR 评价细菌DNA 提取方法[J].重庆医科大学学报2008年第33卷第2期。