微生物发酵法生产透明质酸的研究
透明质酸的微生物发酵及下游提取工艺的研究
河北农业大学硕士学位论文透明质酸的微生物发酵及下游提取工艺的研究姓名：刘金龙申请学位级别：硕士专业：发酵工程指导教师：张伟20070609河北农业大学硕士学位（毕业）论文由图８可以看出，从０时刻起发酵液中溶氧开始下降，从第８小时ＤＯＴ开始急速下降，直至降为０，此时由于菌体生长进入对数期，耗氧量增加，使得发酵液中溶氧急剧下降，从第１０小时一直到第１６小时，ＤＯＴ值一直维持在０水平上，推测此时的通氧和搅拌水平已无法满足菌体急剧生长所需的供氧量，而ＤＯＴ值在第１６小时后逐渐回升，推测可能是由于发酵液黏度过高导致发酵液不能有效混匀，部分气泡滞留其中（见图９），这时的溶氧电极读数已不能代表发酵液中的真实的溶氧情况了．田９拍摄于发酵１６ｈＦｉｇ．９Ｓａｔｅｎａｔｔｈｅｌ６ｔｈｈｏａｒｄｕｒｉｎｇｔｈｅ∞ｕｍｏｆｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ本试验采取以下４种不同策略对搅拌和通氧的调控进行了尝试，其他条件均一致，４种策略如下，Ｉ整个发酵过程采取３００ｒ／ｍｉｎ的搅拌速度，５Ｌ／ｍｉｎ的通气速率。
ＩＩ整个发酵过程采取６００ｒ／ｍｉｎ的搅拌速度，５Ｌ／ｍｉｎ的通气速率。
Ⅲ整个发酵过程保持５Ｌ／ｍｉｎ的通气速率；采取３００ｒ／ｍｉｎ的搅拌速度，当ＤＯＴ值降至０时采取６００ｒ／ｒａｉｎ的搅拌速度一直到发酵结束．Ⅳ整个发酵过程保持１０Ｌ／ｒａｉｎ的通气速率：发酵起始阶段采取３００ｒ／ｍｉｎ的搅拌速度，当ＤＯＴ值降至０时采取６００ｒ／ｍｉｎ的搅拌速度一直到发酵结束。
整个发酵过程中，定期取样检测ＨＡ的含量，结果如下图１０和表１１所示：河北农业大学硕士学位（毕业）论文具体操作为将上一步中得到的沉淀离心后，抽走上清，向沉淀物中加入高浓度的氯化钠溶液，开动搅拌，使沉淀溶解。
这一步骤的关键点是氯化钠浓度的确定，本试验选择不同浓度的氯化钠进行了尝试，结果如下表所示（ａ、ｂ、Ｃ、ｄ、ｅ代表一组呈逐级递增的等差数列的一组数据）。
当氯化钠的浓度达到Ｃｍｏｌ／Ｌ时，ＨＡ的收率为８８．１％，在此基础上再增加氯化钠的浓度，收率提高并不明显，因此选择ｃｍｏｉ／Ｌ为适宜氯化钠浓度。
透明质酸的微生物发酵法生产与应用概况
透明质酸的微生物发酵法生产与应用概况作者：李萌季永甜等来源：《湖北农业科学》2013年第13期摘要：透明质酸是由葡萄糖醛酸和N-乙酰葡萄糖胺的二糖组成的高分子黏多糖，广泛地存在于动物组织中，具有独特的生理特性，在许多领域得到广泛的应用。
目前，透明质酸的生产方法主要有提取法、微生物发酵法和人工合成法。
对微生物发酵法进行了概述，对透明质酸在化妆品、保健品和医学医疗领域的应用进行了简要介绍，并对透明质酸的生产和应用前景进行了展望。
关键词：透明质酸；微生物发酵法；育种中图分类号：Q538；TQ920 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）13-2980-04透明质酸（Hyaluronic acid，HA）是1934年Meyer等从牛眼玻璃体中提取分离得到的一种大分子多糖，故又名玻璃酸[1]。
透明质酸是由2 000～25 000个通过β-1，3糖苷键和β-1，4糖苷键交替地结合在一起的葡萄糖醛酸和N-乙酰葡萄糖胺的二糖组成的均匀重复的线性葡糖胺聚糖[2]。
透明质酸是胞外基质（Extracellular matrix， ECM）的重要组成部分[1]。
近来的研究表明，透明质酸不仅广泛存在于细胞间的胞外基质中，还存在于细胞内，主要集中分布在新生细胞的胞浆和细胞核中[2]。
除了在玻璃体中外，透明质酸在关节滑液和表皮细胞间隙中的含量也十分丰富，从数量上看，50%以上的透明质酸存在于皮肤的真皮和表皮中，约35%存在于肌肉和骨骼中。
目前认为透明质酸主要是存在于软结缔组织中的惰性空间填料中，在组建蛋白多糖复合物的过程中起着重要的作用[2]。
1 透明质酸的性质在电子显微镜下，观察到透明质酸分子呈线性单链结构，并在水溶液中扩展成随机的线圈状结构，线圈的直径约为500 nm。
透明质酸分子中每一双糖单位均含有一个羧基，在生理条件下均可解离，形成阴离子，等空间距离阴离子之间的相互排斥使其分子在水溶液中处于松散的扩展状态，占据了大量空间，故可结合多于本身1 000倍的水[3]。
微生物发酵法生产透明质酸
微生物发酵法生产透明质酸郭学平透明质酸（hyaluronic acid, HA）,又名玻璃酸，是一种酸性黏多糖，广泛存在于脊椎动物的各种组织细胞间质中，如皮肤、脐带、关节滑液、软骨、眼玻璃体、鸡冠、鸡胚、卵细胞、血管壁等，其中以人脐带、公鸡冠、关节滑液和眼玻璃体含量较高。
透明质酸价格昂贵，在日本有“白金”之称，目前的生产方法有发酵法和提取法两种。
1 透明质酸的发展1934年美国Meyer等首先从牛眼玻璃体中分离出该物质。
20世纪70年代，Balazs等从鸡冠和人脐带提取HA，并配制成眼科手术用黏弹性辅助剂—NIF-HA,开创了HA医学应用的先河。
由于HA优良的保湿和润滑性能，20世纪80年代初开始用于高档护肤化妆品，其需求量大幅度增加。
受原料限制，从人脐带和鸡冠提取的HA产量低、成本高，不能满足市场需求。
为了寻找HA的新来源，降低生产成本，研究了发酵法生产HA。
工业化发酵生产HA是日本资生堂最早开始研究的，他们借鉴前人对某些链球菌产生HA这一重要发现，利用现代发酵技术和设备，以提高HA产率为目的，对发酵生产HA进行了较全面地研究。
80年代中期，日本已有发酵生产的HA上市，价格大大低于从动物原料提取的产品。
提取法和发酵法生产HA的比较见表1。
表1 提取法和发酵法生产HA的比较项目提取法发酵法存在状态在原料中与蛋白质和其它多糖形成复合体，分离精制复杂在发酵液中游离存在，分离精制容易分子量与保湿性小于1.0×106,保湿性差大于1.5×106，保湿性强品质与产量取决于动物原料的品质与数量品质稳定，产量大价格（化妆品用） 2.2万元/kg 1.6万元/kg应用价格昂贵，化妆品中的添加量受到制约能增加化妆品中的添加量发酵法生产HA方面的研究主要集中在日本、英国和美国也有少量报道。
国内从1980年开始研究从鸡冠和人脐带提取纯化HA，在1990年前后化妆品用HA和医药用HA先后研制成功并生产。
透明质酸生产工艺
透明质酸生产工艺透明质酸（hyaluronic acid, HA）是一种在生物体内广泛存在的高分子聚糖，也是一种天然保湿因子。
透明质酸具有良好的保湿性能和生物相容性，因此被广泛应用于医药、化妆品和食品等领域。
下面将对透明质酸的生产工艺进行简要介绍。
透明质酸的生产可以通过两种途径进行：微生物发酵法和从鸡冠骨中提取法。
微生物发酵法是目前应用较广泛的生产透明质酸的方法。
此法首先需要选择适合发酵生产的微生物菌种，常用的包括链球菌属、肺炎球菌属、乳酸菌属等。
接种菌种后，培养基中添加适量的碳源、氮源和一些辅助物质，促进菌种的生长和透明质酸的合成。
发酵周期通常为3-7天，菌体生长后通过离心分离，获得含有透明质酸的菌体。
得到含有透明质酸的菌体后，需要将菌体溶解或微生物发酵粉未经溶解经部分酶解液化后进行提取。
提取透明质酸时，常用的方法包括水解提取法和碱液提取法。
水解提取法是先将菌体经过水解反应，使透明质酸脱落出来，然后通过离心或过滤等方式分离出透明质酸。
碱液提取法则是将菌体溶解于碱液中，然后经过沉淀、洗涤和离心等步骤获得透明质酸。
从鸡冠骨中提取透明质酸是另一种获得透明质酸的方法。
鸡冠骨中富含透明质酸，通过一系列的化学处理，可以将透明质酸从鸡冠骨中提取出来。
主要步骤包括去脂处理、酸解、碱化、沉淀和精制等过程。
无论是微生物发酵法还是从鸡冠骨中提取法，获得的透明质酸都需要经过后续的精制和纯化处理。
这些处理包括沉淀、过滤、离心、洗涤、浓缩和干燥等步骤，以获得高纯度的透明质酸产品。
总结起来，透明质酸的生产工艺包括微生物发酵法和从鸡冠骨中提取法。
微生物发酵法通过选择适合的菌种进行发酵，然后进行提取和纯化，得到透明质酸。
从鸡冠骨中提取法则是通过一系列化学处理步骤将透明质酸从鸡冠骨中提取出来，然后经过精制和纯化处理，得到高纯度的透明质酸产品。
以上是透明质酸生产的主要工艺简介。
发酵法生产透明质酸工艺研究
１ ． 菌株 兽疫链球菌 ： ．１ １ 江南大学提供菌种 ， 经诱变得到高产菌株 ， ：Ｈ ３ １ ． 编号 Ｌ ０ ０８ １１ 培养基 葡萄糖、 ．． ２ 酵母粉 、 硫酸镁 、 磷酸二氢钠、 维生素 Ｂ ， ｌ优化方案配成培养基。
微生物发酵法生产透明质酸
HA发酵过程中,添加表面活性剂可以增加细胞膜的 通透性,减少氧及营养物质进入细胞的传递阻力; 使产生的荚膜HA易分泌至胞外,降低HA在细胞表面 的积累,从而有利于HA的合成。
在菌体的指数生长期和稳定期分别添加溶菌酶和 阳离子型表面活性剂CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）。
可能的工艺流程
菌种 诱变处理 培养液 发酵罐
微生物发酵法生产透 明质酸
课程：发酵工艺学
透明质酸简介
透明质酸（hyaluronic acid, HA）,又名玻璃酸， 是一种酸性黏多糖，广泛存在于脊椎动物的各种 组织细胞间质中，如皮肤（真皮层）、脐带、关 节滑液、软骨等。 透明质酸是一种由D-N-乙酰氨基葡萄糖和D-葡萄 糖醛酸为结构单元的高分子粘多糖，商品透明质 酸一般为其钠盐形式。
化妆品
美容保健食品
HA 是国际公认的理想的天然保湿因子（NMF），是目前高档 护肤品、发用制品用量最大品种。
在日本，HA 从20 世纪90 年代开始用作具有美容作用的保 健食品，服用后可增加人体内HA 的合成，提高皮肤中HA 的 含量，使皮肤保水量增加，光滑细嫩而富有弹性。
目前生产HA的方法
目前的生产方法有提取法和微生物发酵法两种。
发酵法生产透明质酸与传统的动物组织提取法相 比 , 具有：生产规模不受动物原料限制； 发酵液中透明质酸以游离状态存在,易于分离纯化； 成本低, 易于形成规模化工业生产；④ 无动物 来源的致病病毒污染的危险等优点。 发酵法是目前工业生产透明质酸的主流，但其发 酵工艺还在继续完善中。
pH值：6.8～7.5 发酵终点：24 h
发酵方式
一步发酵法 由于链球菌的生长和透明质酸的生产受传代次数 影响比较大。 所以采用直接上发酵罐(5 m3)不用种子罐，即一 步发酵生产透明质酸，这样减少了传代次数有利 于菌种生长和生成透明质酸的产量。而且采用一 步发酵,不仅减轻了分析和发酵的劳动强度,而且 节省了种子罐的生产环节,减轻了染菌机率。
兽疫链球菌发酵法生产透明质酸
吉林大学
硕士学位论文
兽疫链球菌发酵法生产透明质酸
姓名：***
申请学位级别：硕士
专业：微生物与生化药学
指导教师：滕利荣;刘兰英
20031201
吉林大学硕士学位论文兽疫链球菌发酵法生产透明质酸于酶解过程中，仍有部分细胞壁残留，而裸露的质膜部分则相互粘连。
Ｆｉｇ．４ｍｗｉｌｄｂａｔｅｒｉａｓｂｅｆｏｒｅ
ＦｉｇｓＴｈｅｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓａｆｔｅｒｅｎｚｙｍｅｈｙｄｒｏｌｙｚｉｎｇｅｎｚｙｍｅｈｙｄｒｏｌｙｚｉｎｇ
３．２激光诱变
激光可产生光、热、压力、电磁场等效应，作用于微生物细胞时，生物分子吸收光子或在激光的电磁场作用下分子内发生能级跃迁，达到一定的振动能并产生自由基，引起生物分子的分解、断裂，导致分子激活或损伤，在修复过程中有可能发生变异。
原生质体对激光敏感性较强，可在较小剂量下产生突变，得到较高正突变率。
由图６可见，随激光照射时间的延长，每一种功率密度下致死率均上升。
当照射时问为３００ｓ，功率密度为４０ｍＷ／ｃｍ２时，致死率为９９．８８％。
将存活的菌株经发酵培养，筛选透明质酸高产菌株。
发酵液中透明质酸含量快速检测方法研究
发酵液中透明质酸含量快速检测方法研究陈永浩1,2,王强1,21(中国农业科学院农产品加工研究所,农业部农产品加工与质量控制重点开放实验室,北京,100193)2(江南大学食品学院,江苏无锡,214122)摘 要 对十六烷基三甲基溴化铵(CT A B)溶液与透明质酸(H A )溶液反应体系进行了全波长扫描,绘制了不同波长下的标准曲线,并对反应时间和温度对反应体系的影响分别进行了比较。
研究表明,随着反应时间延长,反应体系的吸光度逐渐升高,但当反应时间固定后,在可见光区反应体系能较好的遵循朗伯-彼尔定律,并且不受温度的影响。
依据此原理,建立了发酵液中H A 含量的快速测定方法,即CT A B 比浊法,并与Bitter -M uir 法进行了比较。
结果表明,CT AB 比浊法的准确度、精确度、灵敏度均优于Bitter -M uir 法,并且具有快速、安全等特点。
反应体系中除了蛋白质以外,葡萄糖、KH 2PO 4、M g SO 4对CT A B 比浊法测定的影响很小,因此,应尽量减少反应液中蛋白质的含量,以提高测定准确度,而上述杂质对Bitter -M uir 法测定H A 含量均有较大影响。
关键词 透明质酸,发酵液,快速检测,十六烷基三甲基溴化铵第一作者:博士研究生(王强研究员为通讯作者)。
收稿日期:2008-10-24,改回日期:2008-11-26透明质酸(hyaluronic acid,H A )是一种线性、无支链多糖,由N -乙酰氨基葡萄糖和D -葡萄糖醛酸反复交替组成,是一种价值很高的医药、化妆品原料[1]。
近年来,微生物发酵法生产H A 逐步取代了从动物组织中提取H A 的传统方法,如何快速检测发酵液中H A 含量在筛选H A 高产菌株及菌株应用于实际生产后,对发酵工艺进行控制方面显得至关重要[2,3]。
目前H A 含量测定普遍采用Bitter -M uir 法[3~6]。
该方法前处理时间较长,且对样品的纯度要求较高[7,8]。
微生物发酵透明质酸的制备及测定_吕磊
16 4
药物生物技术
第 16 卷第 2 期
3.1.2 CPC 加入 量选 择 不 同 CPC 加入 量对 H A 粗品溶 液中糖醛酸 和蛋白质 含量的影 响 , 见 图 1。
3.5 相对分子质量的测定 根据比浓黏度 ηsp 与 HA 浓度的关系作图 , 该
回归曲线 与纵轴 的截距 为特 性粘度[ η] , 结果 见 图 3 , 根据公式 [ η] =3.6 ×10-4 Mr 0.78 , 平均相对分 子质量 M r 为 1.86 ×106 。
出了一种简单有效生产 HA 的分离纯化方法 , 即 采用过滤吸附法联用氯代十六烷基吡啶(CPC)分
2 实验方法
离纯化发酵液中的 H A , 其纯度 、蛋白质含量 、热原 值等符合医用标准[ 8] 。
2.1 分离纯化方法 兽疫链球菌发酵液[ 9] 离心去菌体 , 上清醇沉 ,
1 材料与仪器
沉淀溶解得粗品溶液 , 加入一定量的硅藻土 、活性 炭搅 拌均匀 吸附 , 过滤 , 加入 CP C , 离心 , 沉淀 溶
Fig 1 T he effect of CP C on co ntents o f g lucuronic acid and protein
3.1.3 乙醇加入量的选择 不同乙醇加入量对 H A 粗品溶液中糖醛酸含的影响 , 见图 2 。
Fig 3 T he relationship betw een ηsp/ c and c of H A
性黏度[
η]
, 并根据公式[
η]
=3.6
×10-4
M 0.78 r
计算
出平均相对分子质量 。 2.4.4 CPC 残留测定[ 13] 取样品溶液 1 m l , 按照 标准曲线的测定方法测定 590 nm 处的吸光度 , 从
发酵法生产透明质酸的工艺研究
１ 材料 与 方 法
１ １ 材 料 ． １ １ １ 供 试 菌株 ．． ＮＣ Ａ Ｆ一０ ６ 株 由本 实验室 保存 。 ３菌
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蕈 编 号 ：∞ ２０２ ３ ）１ ０３—０ ｉ 一５６ （０２ ０ —０３ ４
发酵 法生产透明 的 质酸 工艺研 究
罗瑞 明
（ 宁夏农学院食品科学 系， 宁夏永宁 ， ００ ） ７ １５ ５
摘 要 本 文 主要 研 究 兽 疫链 率 茵 （ Ａ Ｆ一０６ 产 透 明质 酸 的条 件 及 其 特 性 。正 交 实验 表 ＮＣ ３）
明， 产透明质酸的最合适培养基是 ： 淀粉 ３ ， ２ 酵母膏 １ 蛋 白胨 ２ 轻质碳酸钙 ０ １ ％ 蔗糖 ％， ％， ％， 、％， 磷酸氢二钾 ０２ 硫 酸镁 ０ １ ．％， ．％。在 ３ ，７ｒ 发 酵 ４ ７ １ ｐ ０ ￣， ０小时， 酵液 中透 明质 酸的含 量达 发
１ １３ 权 器 与 设 备 、、
显 微镜
可控 硅控温 水种 ， 已报 道 的有 溶 血性 链球 菌 ， 如骧 脓 链 球 菌 （ Ａ群 ） 兽疫 链 球 菌 （ 、 ｃ群 ） 、 马链 球菌 （ ｃ群 ）类 马 链球 菌 （ 、 ｃ群 ）缺乳 链球 菌 （ 、 ｃ 群 ）鸡霍烂 杆 菌等 。Ａ群 链球 菌 系人 体 致 病 菌 ． 、 不 宜 作 为生产 菌种 ， ｃ群链 球 菌为非 人体 致 病 菌 ， 比较 适 合 于工 业 生 产 。 国 际 近年 来 利 用 ｃ群 链 球 菌 生
透明质酸的研究
透明质酸的生物研究及其应用王丹丹学号：D1*******摘要：粘多糖是广泛存在于动物体内的一类多糖,动物体内的多糖除了作为能量代谢的糖元外,基本上都属于粘多糖。
透明质酸是粘多糖中最具代表性的一种,因为透明质酸被认为是唯一几乎存在于从细菌到人类所有动物体之中的粘多糖。
透明质酸具有多样的生理功能和优良的物化性质,同时也是我国卫生部公布的第一批新资源食品之一,已被广泛应用于医药、食品、化妆品等领域。
随着对透明质酸研究的深入,透明质酸在组织工程、纳米材料等领域也显示出了巨大的应用潜力。
关键词：透明质酸；化妆品工业；医药；物理凝胶；纳米材料；研究进展ABSTRACT:Mucopolysaccharide is a kind of polysaccharides that widely exists in the animal’s body. Except the glycogen that is metabolized as the energy, all the polysaccharides in the animal’s body belong to the mucopolysaccharide. Among then hyaluronan(HA) is the most representative mucopolysaccharide, because the HA was supposed to the only polysaccharides that exists in all animal species, from bacteria to human being. HA has the multiple physiological functions and excellent physicochemical properties.Moreover, HA has been permitted to be used in food by China’s Ministry of Health.Nowadays, HA is widely used in medicine, food and cosmetic industry. With the deepening of the research on HA, it also shows a great application potential of HA in the areas of tissue engineering, naomaterials, etc.Keywords:hyaluronan; cosmetic industry; medicine；physical cross-linking gelatin gel; naomaterials ; research progress1.透明质酸的化学结构以及性质透明质酸,又名玻璃酸或玻尿酸,是一种非常重要的直链聚阴离子粘多糖,由（1→4）β葡萄糖醛酸（1→3）β乙酰氨基葡萄糖双糖重复单元组[1]。
透明质酸的研究进展
透明质酸的质量评价主要包括纯度、分子量、粘度等指标。其中，纯度是评 估透明质酸质量的重要指标，可通过色谱技术、光谱技术等方法进行检测。分子 量则影响透明质酸的保水能力和生物活性，一般通过凝胶渗透色谱法进行测定。 粘度与透明质酸的溶液性质相关，可采用粘度计进行测量。
创新点
1、纳米技术在透明质酸制备中 的应用
研究现状
1、透明质酸的分类与制备
透明质酸根据不同的制备方法，可分为天然提取和化学合成两种。天然提取 的透明质酸主要从鸡冠、脐带等组织中提取，而化学合成则通过微生物发酵或化 学合成的方法获得。目前，透明质酸的制备主要依赖于微生物发酵法，其产率高、 成本低，适合大规模生产。
2、透明质酸的质量评价
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
3、基因技术在透明质酸制备中 的应用
基因技术为透明质酸的制备提供了更为精确的控制手段。通过基因修饰，可 以改变透明质酸的分子量、支链结构等关键参数，从而优化其生物活性和功能。 此外，基因技术还可以为透明质酸的生产提供新的原料来源，如利用工程菌发酵 生产透明质酸。
应用前景
1、医学领域
在医学领域，透明质酸凭借其出色的生物相容性和功能活性，被广泛应用于 创伤愈合、药物输送、组织工程等方面。未来，随着纳米技术、生物技术和基因 技术的发展，透明质酸在医学领域的应用将得到进一步拓展。例如，利用纳米级 的透明质酸作为药物载体，可将抗肿瘤药物精准输送至肿瘤组织内部，提高疗效 并降低副作用。
2、美容领域
在美容领域，透明质酸具有出色的保水能力，可用于护肤品的添加剂，提高 产品的保湿效果。此外，透明质酸还可以用于注射美容，如填充面部皱纹、丰唇 等。随着消费者对美容产品安全性和效果的需求不断提高，采用生物技术和基因 技术生产的透明质酸将更受欢迎。
发酵液中分离提纯透明质酸
发酵液中分离提纯透明质酸摘要:透明质酸微生物发酵液中往往都含有蛋白质、核酸等杂质,因此需要分离纯化。
只有高纯度的透明质酸才能更好的发挥其工业效用,但是分离纯化的方法却多种多样。
目前主要方法有过滤法、凝胶层析法、离子交换层析法等,而不同的方法又将导致操作、成本、和纯度的不同。
因此本文将从多方面多角度综合分析各种透明质酸分离纯化方法。
关键词:透明质酸多糖发酵分离提纯过滤凝胶层析离子交换透明质酸(Hyaluronic acid,简称HA)又名玻璃酸,是一种由D-N-乙酰氨基葡萄糖和D-葡萄糖醛酸为结构单元的酸性高分子粘多糖。
HA 具有许多天然多糖共有的性质:呈白色,为无定形固体,无臭无味,有强吸湿性,溶于水,不溶于有机溶剂。
它是一种国际上公认的生物大分子保湿剂,用于眼科显微手术、关节炎治疗、高档化妆品、食品添加剂等领域[1]。
1 分离提纯透明质酸发酵法生产的HA具有分离精制容易,保湿性强,品质稳定,产量大等优点,目前已得到广泛使用,并已成为研究HA生产的主要方向。
由于微生物发酵液中提取的透明质酸粗品都含有菌体,杂蛋白、核酸等杂质,需要进一步分离纯化。
以下简单介绍几种工业上常用的发酵液中透明质酸的分离提纯的方法。
1.1 过滤法过滤法分离纯化发酵液中的HA是一种简单有效并可以规模化生产HA的分离纯化方法,可以有效地除去菌体和杂蛋白,对分子量的影响相对较小。
邓禹等[2]采用25g/L三氯乙酸灭活菌体并使蛋白质变性沉淀,以发酵液质量 1.2%的混合硅藻土为过滤助剂,过滤温度为60℃,pH为7.0的透明质酸发酵液预处理工艺,完全去除了透明质酸发酵液中的菌体和蛋白质等杂质。
采用这一工艺得到的成品透明质酸中葡萄糖醛酸含量达46.39%,蛋白质含量仅为0.047%,分子量为190万,提取收率为91.3%。
这种方法利用三氯乙酸灭活菌体并使蛋白质变性沉淀,然后以硅藻土作为过滤助剂吸附、截留蛋白质和菌体的透明质酸发酵液预处理方法。
透明质酸实验方法
透明质酸HA ( Hyaluronic Acid ) 是由(1 - β- 4) D - 葡糖醛酸和(1 - β- 3) N - 乙酰基- D -氨基葡糖组成的双糖单位重复连接构成的大分子糖胺聚糖[1 ] 。
由于其具有特殊的生理作用、独特的流变学特性和极强的持水保湿能力,在化妆品工业、医学研究、临床治疗等领域得到了广泛的应用[2 ,3 ] 。
微生物发酵法是利用某些种属的链球菌在生长繁殖过程中向胞外分泌以HA 为主要成分的荚膜来生产HA。
与组织提取法相比,具有成本低、生产规模不受动物原料限制、发酵液HA以游离态存在、易于分离纯化和形成规模化生产、无动物来源的致病病毒污染的危险等优点[ 4 ] 。
利用链球菌发酵法生产HA 的研究主要集中在日第2 期邓开野,等:透明质酸产生菌的筛选及诱变本,英美等国也有少量报道,大多见于专利。
作者对牛鼻黏膜进行了透明质酸产生菌野生型的分离,同时利用复合诱变育种方法处理HA产生菌,以期得到既不产生乙型溶血素、HA 产量又有提高的发酵HA 所适用的菌种。
1 实验材料采集的样品为长春皓月肉牛公司和海南省三亚市防疫站的牛鼻黏膜140 份。
培养基有以下几种: ①斜面培养基。
牛脑沁液800 mL ,牛心沁液200 mL ,牛肉膏的质量分数为0. 3 % ,蛋白胨为1 % ,NaCl 为0. 5 % ,琼脂为1. 8 % ,灭菌前p H = 7. 0 ,121 ℃灭菌20 min 。
②血琼脂平板培养基。
葡萄糖的质量分数为2 %,蛋白胨为1 %,牛肉膏为1 % ,MgSO4 ·7H2O 为0. 1 % , KH2 PO4 为0. 2 % ,琼脂为1. 6 %,灭菌前p H = 7. 0 ,121 ℃灭菌20 min. ,冷却至50 ℃以下,无菌条件下加入无菌脱纤维兔血。
③摇瓶培养基。
葡萄糖的质量分数为4 % ,蛋白胨为1 % ,牛肉膏为1 %,MgSO4 ·7H2O 为0. 1 % , KH2 PO4为0. 2 % ,灭菌前p H = 7.0 ,121 ℃灭菌20 min ,冷却至50 ℃以下,无菌条件下加入体积分数为10 %的小牛血清。
透明质酸的制备、功能特性及其调节肠道健康的研究进展
透明质酸的制备、功能特性及其调节肠道健康的研究进展1. 透明质酸的制备方法研究进展透明质酸（Hyaluronic Acid，简称HA）是一种在人体中自然存在的天然高分子多糖，具有良好的保湿性能及多种生理功能。
随着生物科技的发展，透明质酸的制备方法也在不断进步，其研究主要集中在化学合成、微生物发酵以及生物提取等方面。
化学合成法：化学合成法是早期制备透明质酸的主要方法，通过特定的化学反应合成透明质酸。
但这种方法存在副反应多、纯化困难、成本较高以及可能引入有毒杂质等问题，因此逐渐被其他方法所替代。
微生物发酵法：近年来，微生物发酵法成为制备透明质酸的主流方法。
该方法通过培养特定的微生物菌种，利用微生物在发酵过程中自然产生透明质酸。
此方法具有产量高、易于纯化、生产成本相对较低等优点。
通过优化发酵条件，还可以实现对透明质酸产量的调控。
生物提取法：生物提取法主要是从动物组织（如鸡冠、动物眼球等）中提取透明质酸。
虽然提取法得到的透明质酸天然、纯净，但由于原料来源有限，大规模生产存在困难，因此该方法主要用于实验室研究和小规模生产。
随着科技的发展，研究者们也在不断尝试新的方法，如基因工程法、重组DNA技术等来制备透明质酸，以期获得更高纯度、更低成本的产品。
对于不同制备方法的比较研究也是当前研究的热点之一，旨在找到最适合工业化生产的透明质酸制备方法。
透明质酸的制备工艺不仅影响其产量和纯度，也对其后续的应用性能产生影响。
开发高效、安全、可持续的透明质酸制备方法具有重要的实际意义和价值。
随着研究的深入，我们期待在未来看到更多创新的技术和方法在透明质酸制备领域的应用。
1.1 天然透明质酸的提取与纯化方法天然透明质酸（Hyaluronic Acid，简称HA）是一种线性的多糖，由D葡萄糖醛酸和N乙酰氨基葡萄糖胺通过1,3键和1,4键交替连接而成，具有高度的生物相容性和生物活性。
在自然界中，透明质酸主要存在于动物的结缔组织、皮肤、关节软骨、眼球玻璃体等部位。
透明质酸的制备与应用
透明质酸的制备与应用透明质酸是一种常见的生物高分子，具有优异的生物相容性、生物降解性、生物标记性等优点。
在医学、美容等领域有着广泛的应用。
本文将从透明质酸的制备到其应用等方面进行探讨。
1. 透明质酸的制备透明质酸的制备方法有多种，其中最常用的是微生物发酵法和化学法。
微生物发酵法是目前最主流的透明质酸制备方法，主要使用的微生物是链球菌、乳酸菌等。
它们通过代谢过程产生的代谢产物转化为透明质酸。
化学法则是利用琥珀酰衍生物和 N-乙酰氨基葡萄糖等化合物通过酯键连接形成透明质酸。
这种化学法制备的透明质酸相对较少应用，主要用于科学研究或者是商业生产初期的透明质酸固体原料。
2. 透明质酸的应用2.1 医药领域透明质酸最早应用于医疗领域，主要是用于治疗骨关节炎、软骨病变等疾病。
透明质酸可以减轻关节疼痛和改善关节活动度，同时还可促进软骨修复。
目前，透明质酸已成为一种较为成熟的治疗软骨病变的方法。
2.2 美容领域透明质酸在美容领域应用也非常广泛，主要是通过注射透明质酸来改善皮肤的质感和形态。
皮肤年龄越大，透明质酸含量就会越低，导致皮肤出现干燥、松弛等问题。
通过注射透明质酸，可以达到丰脂、美白、去皱等效果。
2.3 生物医学工程透明质酸还可以用于生物医学工程领域。
近年来，随着三维打印技术的不断发展，透明质酸逐渐成为一种常用的支架材料。
透明质酸支架可以与生物体在组织相容性和生物可降解性方面良好匹配，能够促进组织的修复和再生。
3. 透明质酸的发展趋势随着科技的不断进步，透明质酸的应用越来越广泛，越来越深入人们的生活。
未来，透明质酸的发展趋势将会更加多样化，应用范围也会有所扩展。
比如，在医疗领域，透明质酸可通过基因技术等手段纳入生物医药的研究与开发；在美容领域，透明质酸注射技术也将会进一步的开发与完善；在生物工程领域，透明质酸的材料结构和性质优化、应用材料的多样化等方面都将会开拓更广阔的发展空间。
总之，透明质酸是一种广泛应用于医疗、美容和生物工程等领域的生物高分子材料。
一种微生物发酵法生产透明质酸的方法
一种微生物发酵法生产透明质酸的方法透明质酸（Hyaluronic Acid，简称HA）是一种天然的高分子化合物，广泛应用于医药、化妆品和食品工业中。
传统的生产透明质酸的方法通常基于动物组织或细胞培养，但这些方法存在一些缺点，比如成本高、操作复杂以及存在感染风险等。
在过去几年中，微生物发酵法生产透明质酸逐渐成为了一种新的替代方法。
本文将详细介绍一种基于微生物发酵法生产透明质酸的方法及其工艺流程。
一种常用的微生物发酵法生产透明质酸的方法是利用亚洲林木病毒（Streptococcus zooepidemicus）这种革兰阳性细菌。
这种菌株在透明质酸的生物合成途径中扮演着重要角色，是目前工业生产透明质酸的主要菌株之一首先，选取适宜的亚洲林木病毒菌株，并进行培养基优化。
培养基中的碳源、氮源和其他微量元素的含量和比例对菌株的生长和透明质酸的产量有着重要影响。
通过调整培养基中这些成分的浓度，可以提高透明质酸的产量。
随后，将选定的亚洲林木病毒菌株接种到合适的培养基中，并进行发酵过程。
发酵条件包括温度、pH值和培养时间等。
一般来说，适宜的温度为30-37摄氏度，pH值为6.0-7.0，培养时间为24-48小时。
这些条件下，亚洲林木病毒菌株可以将碳源和氮源转化为透明质酸。
发酵完成后，通过离心和过滤等步骤将发酵液中的细胞和杂质去除。
接下来，通过酸碱调节和醇沉淀等操作，将透明质酸从发酵液中提取出来。
最后，通过进一步的精炼和干燥，得到纯度较高的透明质酸产品。
除了亚洲林木病毒，其他一些细菌和真菌也可以用于透明质酸的生产，比如乳酸杆菌（Lactobacillus）和微球藻（Chlorella）等。
这些微生物的生长和透明质酸的产量也受到培养基和发酵条件的影响。
因此，在实际生产中，需要根据具体情况选择最适合的微生物菌株和优化的发酵条件。
总之，微生物发酵法生产透明质酸是一种具有潜力的新方法。
相比于传统的动物组织或细胞培养法，它具有成本低、操作简单、风险小等优点。
透明质酸研究进展及应用
透明质酸研究进展及应用透明质酸（Hyaluronic Acid，简称HA）是一种存在于人体组织中的天然多糖，广泛分布于皮肤、软骨、关节液等处。
近年来，随着科学技术的进步和研究的深入，透明质酸在医学、美容等领域的研究和应用也逐渐展开。
本文将从透明质酸的研究进展和应用两方面进行阐述。
一、透明质酸的研究进展1. 透明质酸的来源：透明质酸可以从多种来源获得，如动物组织提取、微生物发酵等方式。
目前，大多数商业化的透明质酸产品是通过发酵得到的，具有较高的纯度和稳定性。
2. 透明质酸的结构与性质：透明质酸是一种由重复的N-乙酰-D-葡糖胺和D-葡糖醛酸链接而成的高分子物质，具有极强的保水能力和黏弹性。
其分子量的大小决定了其物理和生物学性质的不同，如大分子量透明质酸具有较强的保湿效果，小分子量透明质酸则有更好的渗透性。
3. 透明质酸的降解与代谢：透明质酸在人体内会被降解为较小的分子，再由体内酶类或细胞摄取，并参与生理功能的调节。
其降解产物对皮肤的保湿和修复具有一定作用。
4. 透明质酸与皮肤健康：透明质酸通过保湿、促进胶原蛋白的合成等作用，具有滋润皮肤、提升皮肤弹性、改善皱纹等功效。
研究表明，透明质酸可以有效保湿皮肤，减少水分流失，提高皮肤屏障功能，从而改善干燥、脱屑等皮肤问题。
5. 透明质酸在医学领域的应用：透明质酸在医学领域有着广泛的应用，如关节液置换、眼科手术、软骨修复等。
透明质酸作为一种生物材料，具有良好的生物相容性和生物可降解性，对组织没有明显的毒副作用。
二、透明质酸的应用1. 美容领域：透明质酸作为一种保湿剂和填充剂，广泛应用于美容领域。
透明质酸可以通过注射或外用的方式，改善皮肤问题，如细纹、皱纹、皮肤松弛等。
2. 医学领域：透明质酸在医学领域的应用包括软骨修复、关节液置换、眼科手术等。
透明质酸可以用于软骨修复的支架材料，能够促进软骨细胞的生长和分化，加速软骨的再生。
在关节液置换中，透明质酸可以有效润滑关节，减少疼痛和炎症反应。
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燕山大学课程设计说明书微生物发酵法生产透明质酸的研究学院（系）：环境与化学工程学院年级专业：10生物化工学号：100110050050学生姓名：王伟伟指导教师：张晓宇教师职称：副教授燕山大学课程设计（论文）任务书院（系）：环境与化学工学院基层教学单位：生物工程系燕山大学课程设计成绩评定表2013 秋季学期生物工程专业课程设计结题论文微生物发酵法生产透明质酸的研究学院（系）：环境与化学工程年级专业：10 生物化工学号：100110050050学生姓名：王伟伟指导教师：张晓宇教师职称：副教授为提高微生物发酵生产透明质酸的质量，本设计选用经过突变后的高产兽疫链球菌株做为发酵用的菌种，并且在发酵前经过了严格的灭菌操作。
设计内容主要分为三部分：摇瓶培养基组成对透明质酸发酵的影响；培养条件对发酵结果的影响；通过发酵过程中各种参数的变化优化发酵条件。
第一部分设计拟采用正交设计法确定最合适的种子培养基；第二部分设计拟单因素分析法确定外界最适发酵条件；第三部分通过测定发酵过程的各种参数绘制参数变化曲线，为发酵条件的优化提供科学依据。
通过本次设计，制定出兽疫链球菌生产透明质酸的合适工艺流程。
关键词：透明质酸；兽疫链球菌；正交设计；单因素分析第一部分文献综述1 透明质酸 (1)1.1 概述 (1)1.2 结构 (1)1.3 HA理化性质 (2)1.4 HA的合成和代谢 (3)1.4.1 HA的合成 (3)1.4.2 HA的代谢 (4)1.5 HA的生理功能 (5)1.5.1 构成多种基质 (5)1.5.2 保水、润滑、渗透压调节及分子排阻效应 (6)1.5.3 对细胞的作用 (6)1.5.4 与蛋白质的结合及其作用 (6)1.6 HA的应用 (7)1.6.1 HA在化妆品领域的应用 (7)1.6.2 HA在医学领域的应用 (8)1.6.3 HA在食品领域的应用 (8)2 HA的制备 (9)2.1 从动物组织中提取 (9)2.2 微生物发酵法 (10)3 国内外发展概况及其市场发展前景 (11)第二部分课程设计1.材料 (14)1.1 试验用的仪器 (14)1.2 试验药品 (14)2. 方法 (15)2.1 细菌发酵法生产透明质酸的工艺路线 (15)2.2 兽疫链球菌发酵生产透明质酸的工艺流程 (15)2.2.1 摇瓶种子液的培养 (15)2.2.2 种子罐种子液的培养 (16)2.2.3 发酵 (16)2.2.4 下游分离纯化 (16)2.3 检测方法 (16)2.3.1 HA 含量的检测方法（Bitter-Muir 咔唑法） (16)2.3.2 还原糖的测定方法—DNS法 (17)3．设计 (18)3.1 摇瓶培养基组成对透明质酸发酵的影响 (18)3.2 培养条件对透明质酸发酵的影响 (20)3.2.1 摇床转速对摇瓶种子培养的影响 (20)3.2.2 温度对摇瓶种子培养的影响 (20)3.2.3 添加剂对摇瓶种子培养的影响 (21)4．分析与展望 (21)5．设计体会 (22)参考文献 (24)第一部分文献综述1 透明质酸1.1 概述透明质酸(HyaluronioAcid, 简称HA) 是一种由N-乙酰葡糖胺和D-葡萄糖醛酸双糖单元交替连接而成的酸性粘多糖。
1934 年Meyer 等自牛眼玻璃体内提取分离得到一种大分子多糖命名为HyafuronicAcid. 根据全国科学技术名词审定委员会公布的《生物化学名词》将其译为“透明质酸”，而《中国药典》国家药品标准则将其称为“玻璃酸”。
目前国内在多种领域中用透明质酸，而在与药品有关的领域则用玻璃酸。
经过半个多世纪的研究，人们对透明质酸的结构、理化性质和生理功能已有了明确的认识，在药品、化妆品、保健品以及临床眼科、骨科、皮肤科等领域有较多的研究和应用。
[1]例如，由于其具有良好的保湿功能，广泛用于化妆品及口服美容保健食品中；作为粘弹性保护剂用于眼科手术和关节腔内注射治疗类风湿性关节炎和骨性关节炎等关节疾病；作为媒介在滴眼液中广泛应用；交联的透明质酸在术后粘连的预防和软组织修复等应用中获得成功；透明质酸与其他药物反应形成的加合物对药物发挥控释作用，可达到定向和定时释放的目的。
近几年对透明质酸生理功能的认识有了重大突破，已形成了有透明质酸合成缺陷人的生命不可能存活的认识，可见其对肌体的重要性。
由于透明质酸具有如此独特的生理功能，决定了它在药品、化妆品等工业上具有广泛的应用价值。
因此对透明质酸的研究开发及其产业化的形成具有重要的意义和非常广阔的市场前景。
1.2 结构卡尔·迈耶实验室在1950年代阐明了透明质酸的化学结构。
透明质酸是一种高分子的聚合物。
是由单位D-葡萄糖醛酸及N-乙酰葡糖胺组成的高级多糖[2]。
D-葡萄糖醛酸及N-乙酰葡糖胺之间由β-1,3-配糖键相连，双糖单位之间由β-1,4-配糖键相连。
双糖单位可达25000 之多。
在体内透明质酸的分子量从5千到2千万道尔。
分子式：（C14H20NNaO11）n结构式如图：1.3 HA理化性质HA 具有许多天然豁多糖共有的性质，外观为白色、无定型固体[3]，水溶液带负电，电泳时移向负极。
在高浓度1% 时，分子间会因氢键形成物理交联，呈网状形式存在，有很高的黏弹性和渗透压[4]。
其水溶液的比旋度为-70°~ -80°与阿利新蓝、亚甲基蓝反应呈蓝色。
在酸、碱、高温、X射线、γ射线、紫外线、超声波、铁、铜等金属离子、抗坏血酸或半胱氨酸等还原剂、氧自由基、透明质酸酶等因素下可发生降解，导致其黏性下降。
经注射进人皮肤和关节的HA 其半衰期一般不超过24 h[5]。
商品透明质酸钠(Sodium hyalurone, 简称SH) 为白色纤维状或粉末状固体，无臭无味，有强吸湿性，溶于水，不溶于有机溶剂。
HA 溶液呈现非牛顿流体流变性，即HA 溶液的粘度随剪切速率的增加而显著的降低[6]。
HA 溶液的这种特性可以理解为分子间的摩擦在较高的切变速率下，HA 分子被拉长或变形，此时溶液粘度的大小不在完全取决与分子量的大小，同时也取决于HA 分子的大小即浓度，同一浓度的HA 水溶液，即使分子量不同，当切变速率达到某一特定值时，其粘度可降至相同。
而对同一相同分子量的HA 溶液，在任何切变速率下，粘度总是与浓度呈正比关系。
1.4 HA的合成和代谢1.4.1 HA的合成很早就知道HA 是由尿苷二磷酸-N-乙酰氨基葡糖（UDP-GlcNAc）和尿苷二磷酸-葡糖醛酸（UDP-GlAc）合成而来[7]，但对其合成场所及合成过程不甚明了。
直到20 世纪80 年代，对HA 的合成机理才有了明确的认识。
Prehm 的研究发现，细胞浆膜的膜内壁是合成HA 的场所，在HA 合成酶的作用下，HA多糖链的还原末端所连UDP 释出，多糖链交替连接上UDP-GlcNAc 和UDP-GlAc，生成的HA 链伸出细胞外，使其不受限制地延伸。
HA 的合成与其他大分子多糖如硫酸软骨素、肝素等不同，后者的合成场所为细胞内的高尔基体，糖链的延伸发生在非还原端，合成后还需要进行硫酸化、差向异构化和脱乙酰化等改构[8]。
对一些原核细胞和真核细胞的HA 合成酶进行了结构和功能研究。
目前已知成纤维细胞的HA 合成酶的组成和结构，也明确了不同亚基在HA合成中所起的作用。
VandeRijn 等[9,10]发现，链球菌细胞膜内有三种蛋白质发挥与UDP-GlAc 结合作用。
在真核细胞内，也发现了一系列具HA合成活性的蛋白质。
这些浆膜蛋白质在HA的合成过程中发挥合成及转动功能。
O’Regan等[11]对HA 的合成机理和有关基因的研究进行了详述。
许多因素可调控HA 的合成，通过调节HA 合成酶分子中大、小亚基的磷酸化程度以调节HA 合成酶活性。
当存在合成HA 的前体物质UDP-GlcNAc 或UDP-GlAc 时，合成酶大亚基内的酪氨酸则发生自动磷酸化，这是引发HA合成的必经步骤。
小亚基丝氨酸也可磷酸化，当丝氨酸磷酸化程度增高时，酶的活性即降低。
激素、炎症因子、生长因子、细胞流行性物质、腺苷酸环化酶、肿瘤细胞等均可通过调整HA 合成酶的活性来调节HA 的合成。
1.4.2 HA的代谢通过对合成HA 的前体物质进行标记、对HA 标记以及直接测定未标记HA 注入不同时间后在注入部位的残留量等手段，对HA 在体内的代谢进行了研究，包括对临床用药途径如注入眼前房内、关节腔内等的HA 的清除进行了考察。
20世纪80 年代后，Dahl 等设计了新的方法，将HA 连接上[125I]-酪胺纤维二糖标记物，后者在HA 代谢时随HA 从细胞外转移至细胞内，在溶酶体发生降解时，可残留在代谢部位的细胞内长达数小时，据此可测定不同部位HA 的代谢比率和清除率，弥补了以前的方法只能确定HA 的代谢部位而不能准确测定其代谢量的不足。
在正常状况下，HA 在体内主要是通过酶降解而清除，但发生某些疾病时，体内产生的自由基也可对其产生降解作用，如发生RA 时，滑液中的氧自由基导致其中的HA 发生降解。
降解HA的酶主要为透明质酸酶（HAas）、β-D-葡糖苷酸酶和β-N-乙酰-D-氨基已糖苷酶。
HA 的代谢和清除主要发生在局部、淋巴系统和等组织，HA 首先与细胞受体结合，被摄入到细胞内，与溶酶体融合后，先经Haas降解，形成HA 寡糖，再β-D-葡糖苷酸酶和β-N-乙酰-D-氨基已糖苷酶的进一步作用降解成单糖。
生成的单糖转移至胞质内，进一步氧化分解成小分子物质排出体外，或作为前体物质重新用于合成HA。
迄今为止，除脑组织以外，对HA 在各组织中的代谢情况已基本了解。
研究发现，HA 除在其合成处部分发生代谢以外，大量的HA 转移至淋巴结和肝脏代谢。
在皮肤、软骨、骨及细胞间质（ICM）等组织中，HA与组织内的其他成分结合密切，主要以结合状态存在，有些主要以新、老替代方式发生局部代谢。
以皮肤为例，每天代谢量为局部所含HA 总量的20% 左右。
体内呈游离状态的HA 如关节滑液、细胞间液、外周淋巴液、血液中的HA以及注入的外源性HA 则主要在淋巴结和肝脏代谢。
淋巴结可从传达室入淋巴液中截留其所含HA 总量的50%～90%, 在此发生部分降解。
HA 在血液中的代谢速率很高，如对人和兔的研究结果表明，静脉注射进入血液的HA在血液中的半衰期很短，只有2.4～5 min, 清除比率常数为0.13～0.28 min-1, 相当于每1 min有25% HA 从血浆中清除掉。
血浆中的HA 主要在肝脏发生代谢而清除，研究发现，静脉搏注标记的HA 后，占注射总量90% 的放射性物质被发现集中在肝脏。
HA 被淋巴结和肝脏摄取进而清除是由受体介导而生的，淋巴窦的内衬细胞和肝脏窦间隙内皮细胞是摄入HA的主要细胞。