革兰氏染色液配制
常用染色液配方
实验室常用染色液配方1、吕氏(Loeffler)美蓝染色液A液：美蓝(Methylene blue) 0.3 克95%酒精毫升B液：氢氧化钾(KOH) 0.01 克蒸馏水100 毫升分别配制A液和B液，然后混合即成。
2、齐氏(Ziehl)石炭酸复红染色液A液：碱性复红(Basic fuchsin) 0.3 克95%酒精10.O 毫升B液：石炭酸(苯酚) 5.0 克蒸馏水95 毫升将碱性复红溶于95%酒精中，配成A液。
将石炭酸溶于蒸馏水中，配成B液。
将两者混合即成。
3、结晶紫染色液(Huclker改订)A液：结晶紫(Crystai violet) 2.5 克95%酒精25.0 毫升B液：草酸铵(NH4)2C2O4H2O 1.0 克蒸馏水100 毫升将结晶紫研细后，加入95%酒精，使之溶解，配成A液。
将草酸铵溶于蒸馏水，配成B液。
两液混合即成。
4、路戈氏(LugoI)碘液(革氏鉴别染色用)碘1.0克碘化钾2.0克蒸馏水300毫升先将碘化钾溶于少量蒸馏水中，再将碘溶于碘化钾溶液中，溶时可稍加热，最后加足蒸馏水量。
5、番红染色液(革氏鉴别染色用)番红O(Safranin O) 2.0克蒸馏水100毫升6、孔雀绿染色液(芽孢染色用)孔雀绿(Malachite green) 5.0克蒸馏水100毫升先将孔雀绿研细，加少许95%酒精溶解，再加蒸馏水。
7、Dorner黑素液(英膜染色用)黑素(Nigrosin) 10.0克蒸馏水100毫升福尔马林(40%甲醛) 0.5毫升将黑素在蒸馏水中煮沸5分钟，加入福尔马林作为防腐剂，用玻璃棉过滤。
8、刚果红染色液刚果红(Congo red) 2.0克蒸馏水100毫升9、稀释结晶紫染液(放线菌染色用)结晶紫染色液(同3) 5.0毫升蒸馏水95.010、乳酸石碳酸棉蓝染色液（真菌制片，短期保存）石炭酸10.0克甘油20.0毫升乳酸(比重l.21) 10.0毫升棉蓝0.02克蒸馏水10.0毫升将碳酸加在蒸溜水中加热溶化，加入乳酸和甘油，最后加入棉蓝，溶解即成。
染色液的配制
染色液的配制一、吕氏(Loeffler)碱性美蓝染液A液：美蓝(methylene blue) 0．6g95%酒精 30mlB液：KOH 0．01g蒸馏水 100ml分别配制A液和B液，配好后混合即可。
二、齐氏(Ziehl)石炭酸复红染色液A液：碱性复红(basic fuchsin) 0．3g95%酒精 10mlB液：石炭酸 5．0g蒸馏水 95ml将碱性复红在研钵中研磨后，逐渐加入95%酒精，继续研磨使其溶解，配成A 液。
将石炭酸溶解于水中，配成B液。
混合A液及B液即成。
通常可将此混合液稀释5—10倍使用，稀释液易变质失效，一次不宜多配。
三、革兰氏(Gram)染色液1．草酸铵结晶紫染液A液：结晶紫(crystal violet) 2g95%酒精 20mlB液：草酸铵(ammonium oxalate) 0．8g蒸馏水 80ml混合A、B二液，静置48小时后使用。
2．卢戈氏(Lugol)碘液碘片 1．0g碘化钾 2．0g蒸馏水 300ml先将碘化钾溶解在少量水中，再将碘片溶解在碘化钾溶液中，待碘全溶后，加足水分即成。
3．95%的酒精溶液。
4．番红复染液番红(safranine O) 2．5g95%酒精 100ml取上述配好的番红酒精溶液10ml与80ml蒸馏水混匀即成。
四、芽孢染色液1．孔雀绿染液孔雀绿(malachite green) 5g蒸馏水 100ml2．番红水溶液番红 0．5g蒸馏水 100ml3．苯酚品红溶液碱性品红 11g无水酒精 100ml制法取上述溶液10ml与100ml5%的苯酚溶液混合，过滤备用。
4．黑色素(nigrosin)溶液水溶性黑色素 10g蒸馏水 100ml称取10g黑色素溶于100ml蒸馏水中，置沸水浴中30分钟后，滤纸过滤二次，补加水到100ml，加0．5ml甲醛，备用。
五、荚膜染色液1．黑色素水溶液黑色素 5g蒸馏水 100ml福尔马林(40%甲醛) 0．5ml将黑色素在蒸馏水中煮沸5分钟，然后加入福尔马林作防腐剂。
常用染色液的配制
常用染色液的配制1.吕氏（Loefflev）美蓝染色液A液：2%美蓝（Methylene blue）95%酒精溶液B液：10%KOH溶液取A液30ml、B液0.1ml与100ml蒸馏水混合。
2.石炭酸复红染色液A液：4%碱性复红（basic fuchsin）95%酒精溶液将碱性复红在研钵中研磨后，逐渐加入95%酒精，继续研磨使其溶解、配成A液。
B液：5%石炭酸溶液取A液10ml、B液90ml混合即可。
一般可将此溶液稀释5-10倍使用。
但稀释液易变质失效，一次不宜多配。
3.革兰氏（gram）染色液（1）草酸铵结晶紫染液：A液：1%结晶紫（Crystal violet）95%酒精溶液B液：1%草酸铵（Ammonium oxalate）溶液取A液20mlB液80ml，静置48/小时后使用。
（2）路哥氏（Lugol）碘液：碘片1.0g、碘化钾2.0g、蒸馏水300ml先将碘化钾溶解在少量水中，再将碘片溶解在碘化钾溶液另，待碘全部溶解后，加够水即成。
（3）95%酒精溶液（4）蕃红（沙黄）复染液：2.5%蕃红（Safranlne O）95%酒精溶液。
取此液10ml与90ml蒸馏水混匀即成。
4.芽孢染色液（1）5%孔雀绿(Malachite green)溶液。
（2）0.5%蕃红溶液。
（3）苯酚品红溶液称取11g碱性品红溶于100ml无水酒精中。
再取上述溶液10ml与100ml 5%的苯酚溶液混合，过滤备用。
（4）黑色素(nigrosin)溶液10%黑色素溶液，置沸水浴中30min后，滤纸过滤二次，补加水到100ml，然后加入40%甲醛0.5%(v/v)作防腐剂。
5.荚膜染色液（1）黑色素水溶液将黑色素在蒸馏水中煮沸5min，配成5%溶液，然后加入40%甲醛0.5%(v/v)作防腐剂。
（2）蕃红染色液与革兰氏染色液中的蕃红复染液相同。
6.鞭毛染色液A液：单宁酸5.0g、FeC131.5g、蒸馏水100ml，福尔马林（15%）2.0ml、NaOH(1%)1.0ml。
微生物实验中常用药品试剂配2
微生物实验中常用药品试剂配制1、细菌染色剂甲液取5克美蓝，溶于100毫升95%酒精中，制成美蓝-酒精饱和液。
乙液取氢氧化钾0.01克（或1%氢氧化钾溶液1毫升），溶液也可用于放线菌染色，0.1%浓度可用于酵母菌染色。
用此液染色因先用甲液染色，再加乙液固定，用丙液处理，最后用丁液复染。
四种液体的配方如下：甲液（结晶紫液）（1）结晶紫2克95%酒精20毫升（2）草酸铵0.8克蒸馏水80毫升使用前（1）、（2）液相混，静置48小时后使用。
乙液(碘液)碘1克碘化钾2克蒸馏水300毫升将碘化钾溶于少量蒸馏水中，然后加入碘，待碘全部溶解后，加水稀释至300毫升。
丙液95%酒精溶液丁液（番红花红液）2.5%番红花红酒精溶液10毫升蒸馏水100毫升2、细菌特殊染色剂甲液取结晶紫0.1克，溶于少量蒸馏水后，加水稀释到100毫升，再加入0.25毫升冰醋酸一结晶紫染液。
乙液取硫酸铜31.3克，溶于少量蒸馏水后，加水稀释到100毫升，即成20%硫酸铜脱色剂。
3.细胞质染色剂伊红染液一般配用水溶液和酒精溶液两种。
（1）取1克伊红，溶于99毫升蒸馏水中，即成1%伊红水溶液（市售红墨水内含伊红成分，可以用红墨水稀释液来代替本溶液）。
（2）取1克伊红，溶于99毫升70%酒精中，即成1%伊红-酒精溶液。
取1克甲基蓝，溶于29毫升70%酒精中，加入70毫升蒸馏水，即成1%甲基蓝染液。
4.细胞核染色剂取1克龙胆紫，溶于少量2%醋酸溶液中，加2%醋酸溶液，直到溶液不呈深紫色止。
取0.5克美蓝，溶于30毫升95%酒精中，加100毫升0.01%氢氧化钾溶液，保存在棕色瓶内。
此溶液能染细胞核，还用来染细菌、血和神经组织等。
5、活体染色剂取0.1克亚甲蓝，溶解于1000毫升蒸馏水中，即成亚甲蓝染液。
这种染液用于原生动物的活体染色。
6.物质鉴定1、斐林试剂配制：1）甲液质量浓度为0.1g/ml，取10gNaOH溶于蒸馏水，稀释至100ml2）乙液质量浓度为0.05g/ml，取5gCuSO4溶于蒸馏水，稀释至100ml临用时将甲、乙液等量混合作用：鉴定还原性糖：C6H12O6、果糖、麦芽糖、乳糖等。
革兰氏染色方法
实验方法步骤革兰氏染色法一般包括初染、媒染、脱色、复染等四个步骤，具体操作方法是：1）涂片固定。
2）草酸铵结晶紫染1分钟。
3）自来水冲洗。
4）加碘液覆盖涂面染约1分钟。
5）水洗，用吸水纸吸去水分。
6）加95%酒精数滴，并轻轻摇动进行脱色，20秒后水洗，吸去水分。
7）蕃红染色液（稀）染2分钟后，自来水冲洗。
干燥，镜检。
G＋菌：细胞壁厚，肽聚糖网状分子形成一种透性障，当乙醇脱色时，肽聚糖脱水而孔障缩小，故保留结晶紫-碘复合物在细胞膜上。
呈紫色。
Gˉ菌：肽聚糖层薄，交联松散，乙醇脱色不能使其结构收缩，其脂含量高,乙醇将脂溶解，缝隙加大，结晶紫-碘复合物溶出细胞壁，沙黄复染后呈红色。
革兰氏染色法的主要步骤是先用结晶紫进行初染，再加媒染剂—碘液，以增加染料与细胞间的亲和力，使结晶紫与碘形成分子量较大的复合物，然后用脱色剂（乙醇或丙酮）脱色，最后用番红复染。
凡细胞不被脱色而保留初染剂的颜色（紫色）者为革兰氏阳性菌，如被脱色后有染上复染剂的颜色（红色）者为革兰氏阴性菌。
一般乙醇脱色的时间为30s,如果脱色过度，革兰氏阳性菌也可能被脱去颜色而被误认为是革兰氏阴性菌；相反，如果时间不够，革兰氏阴性菌未被完全脱色而被认为是革兰氏阳性菌。
染色时间一般控制在1min。
革兰氏染色液的配制：第1液：结晶紫溶液结晶紫乙醇饱和溶液100 mlA液：结晶紫 2.5 g95%乙醇25.0 mlB液：1%草酸铵溶液将结晶紫研细后，加入95%酒精，使之溶解，配成液；将草酸铵溶于蒸馏水，配成B液。
两液混合即成。
第2液：路（卢）戈碘液碘化钾 2 g碘 1 g蒸馏水300 ml先将碘化钾溶于少量蒸馏水中，再将碘溶于碘化钾溶液中，溶解时可稍加热，最后补充蒸馏水量。
第3液：脱色剂（1）95%乙醇或丙酮乙醇溶液100 ml95%乙醇70 ml丙酮30 ml第4液：番红花红染色液2.5%番红0 （Safranin 0）95%酒精溶液10 ml蒸馏水90 ml。
革兰氏染色操作规程
1 目的
建立微生物实验室细菌形态和主要构造检验方法，以鉴定菌种。
2 范围
本规程适用于我司革兰氏染色测试实验。
3 职责
质量部微生物实验员负责按此规程进行革兰氏染色测试。
4 染液的配制
4.1 0.5%结晶紫染色液
称取1g结晶紫，放入250ml试剂瓶中，加95%乙醇2ml,溶解后加入200ml蒸馏水摇匀即可。
4.2 革兰氏碘液
分别称取碘 1g和碘化钾2g放入蒸馏水300ml中，溶解摇匀即可。
4.3 脱色剂
95%乙醇
4.4 复染液（番红染液）
称取番红0.25g，加入10ml 95%乙醇内，然后用90ml蒸馏水稀释，摇匀即可。
5 革兰氏染色程序
5.1 涂片
用纱布擦净载玻片，以无菌接种环取一小滴无菌生理盐水，然后用无菌接种环挑取少数菌苔（菌落）或液体培养物（不必加生理盐水），在玻璃片中央涂成一薄膜。
5.2 干燥
涂片后放室温中自然干燥。
5.3 固定
将载玻片迅速通过火焰三次（其目的是杀死细菌），使菌体与载玻片粘附牢固，以及改变对染料的通透性。
5.4 初染
滴加结晶紫染液于已固定的载玻片上，染1min，水洗。
细菌的革兰氏染色及染色液的配制
革兰氏染色的一般步骤革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法，1884 年由丹麦医师Gram 创立。
未经染色之细菌，由于其与周围环境折光率差别甚小，故在显微镜下极难观察。
染色后细菌与环境形成鲜明对比，可以清楚地观察到细菌的形态、排列及某些结构特征，而用以分类鉴定。
革兰氏染色属复染法，即将标本固定后，先用结晶紫染色1 分钟后水洗，然后加革兰碘液媒染一分钟后用酒精脱色，再用稀释石炭酸复红复染。
染色后除可以看到细菌形态外，还可将细菌分为两大类，即不被酒精脱色而保留紫色者为革兰氏阳性菌（G＋）。
被酒精脱色复染成红色者为革兰氏阴性菌（Gˉ）。
革兰氏染色原理尚不肯定，可能与细菌所带核糖核酸、细菌壁结构通透性、等电点等因素有关。
致病菌如金黄色葡萄球菌、绿色溶血性链球菌、肺炎球菌、白喉杆菌、炭疽杆菌等属革兰氏染色阳性菌。
百日咳杆菌、大肠杆菌（大肠埃希菌）、铜绿假单胞菌、伤寒杆菌、痢疾杆菌、霍乱弧菌、沙门菌、流行性脑膜炎双球菌、淋病双球菌等均属革兰氏阴性菌。
所以根据细菌的革兰氏染色性质，可以缩小鉴定范围，有利于进一步分离鉴定，以对疾病做出诊断。
又由于各种抗生素的抗菌谱不同，革兰氏染色尚可做为选用抗生素的参考。
革兰氏染色法一般包括初染、媒染、脱色、复染等四个步骤，具体操作方法是：1）涂片固定。
2）草酸铵结晶紫染 1 分钟。
3）纯化水冲洗。
4）加碘液覆盖涂面染 1 分钟。
5）水洗，用吸水纸吸去水分。
6）加 95% 酒精数滴，并轻轻摇动进行脱色，30 秒后水洗，吸去水分。
7）番红染色液（稀）染10 秒钟后，纯化水冲洗。
干燥，镜检。
染色的结果，革兰氏正反应菌体都呈紫色，负反应菌体都呈红色。
实验三细菌的革兰氏染色法一、目的要求了解革兰氏染色的原理，学习并掌握革兰氏染色的方法。
二、基本原理革兰氏染色反应是细菌分类和鉴定的重要性状。
它是 1884 年由丹麦医师Gram 创立的。
革兰氏染色法（ Gram stain ）不仅能观察到细菌的形态而且还可将所有细菌区分为两大类：染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用G+ 表示；染色反应呈红色（复染颜色）的称为革兰氏阴性细菌，用G- 表示。
微生物染色液配制及染色法
微生物染色液配制及染色法2.1 美蓝染色法2.1.1 吕氏碱性美蓝染色液美蓝0.3g95%乙醇30mL0.01%氢氧化钾溶液100mL 将美蓝溶解于乙醇中，然后与氢氧化钾溶液混合。
2.1.2 染色法将涂片在火焰上固定，待冷。
滴加染液，染1～3min，水洗，待干，镜检。
2.1.3 结果菌体呈蓝色。
2.2 革兰氏染色法2.2.1 结晶紫染色液结晶紫1g95%乙醇20mL1%草酸铵水溶液80mL将结晶紫溶解于乙醇中，然后与草酸铵溶液混合。
2.2.2 革兰氏碘液碘1g碘化钾2g蒸馏水300mL将碘与碘化钾先进行混合，加入蒸馏水少许，充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馏水至300mL。
2.2.3 沙黄复染液沙黄0.25g95%乙醇10mL蒸馏水90mL将沙黄溶解于乙醇中，然后用蒸馏水稀释。
2.2.4 染色法2.2.4.1 将涂片在火焰上固定，滴加结晶紫染色液，染1min，水洗。
2.2.4.2 滴加革兰氏碘液，作用1min，水洗。
2.2.4.3 滴加95%乙醇脱色，约30s；或将乙醇滴满整个涂片，立即倾去，再用乙醇滴满整个涂片，脱色10s。
2.2.4.4 水洗，滴加复染液，复染1min。
水洗，待干，镜检。
2.2.5 结果革兰氏阳性菌呈紫色。
革兰氏阴性菌呈红色。
注：亦可用1：10稀释石炭酸复红染色液作复染液，复染时间仅需10s。
2.3 耐酸性染色法(萎－倪二氏法)2.3.1 石炭酸品红染色液碱性品红0.3g95%乙醇10mL5%酚水溶液90mL将品红溶解于乙醇中，然后与酚溶液混合。
2.3.2 3%盐酸－乙醇浓盐酸3mL95%乙醇97mL2.3.3 复染液吕氏碱性美蓝染色液。
2.3.4 染色法2.3.4.1 将涂片在火焰上加热固定，滴加石炭酸品红染色液，徐徐加热至有蒸气出现，但切不可使沸腾。
染液如因蒸发减少时，应随时添加。
染5min，倾去染液，水洗。
2.3.4.2 滴加盐酸－乙醇脱色，直至无红色脱落为止(所需时间视涂片厚薄而定，一般为1～3min)，水洗。
微生物染色液的配制
微生物染色液的配制一、吕氏(Loeffler)碱性美蓝染液 (实验6，53)A液：美蓝(methylene blue) 0．6g95%酒精 30mlB液：KOH 0．01g蒸馏水 100ml分别配制A液和B液，配好后混合即可。
二、齐氏(Ziehl)石炭酸复红染色液 (实验6)A液：碱性复红(basic fuchsin) 0．3g95%酒精 10mlB液：石炭酸 5．0g蒸馏水 95ml将碱性复红在研钵中研磨后，逐渐加入95%酒精，继续研磨使其溶解，配成A液。
将石炭酸溶解于水中，配成B液。
混合A液及B液即成。
通常可将此混合液稀释5—10倍使用，稀释液易变质失效，一次不宜多配。
三、革兰氏(Gram)染色液 (实验7)1．草酸铵结晶紫染液A液：结晶紫(crystal violet) 2g95%酒精 20mlB液：草酸铵(ammonium oxalate) 0．8g蒸馏水 80ml混合A、B二液，静置48小时后使用。
2．卢戈氏(Lugol)碘液碘片 1．0g碘化钾 2．0g蒸馏水 300ml先将碘化钾溶解在少量水中，再将碘片溶解在碘化钾溶液中，待碘全溶后，加足水分即成。
3．95%的酒精溶液。
4．番红复染液番红(safranine O) 2．5g95%酒精 100ml取上述配好的番红酒精溶液10ml与80ml蒸馏水混匀即成。
四、芽孢染色液 (实验8)1．孔雀绿染液孔雀绿(malachite green) 5g蒸馏水 100ml2．番红水溶液番红 0．5g蒸馏水 100ml3．苯酚品红溶液碱性品红 11g无水酒精 100ml制法取上述溶液10ml与100ml5%的苯酚溶液混合，过滤备用。
4．黑色素(nigrosin)溶液水溶性黑色素 10g蒸馏水 100ml称取10g黑色素溶于100ml蒸馏水中，置沸水浴中30分钟后，滤纸过滤二次，补加水到100ml，加0．5ml甲醛，备用。
五、荚膜染色液 (实验9)1．黑色素水溶液黑色素 5g蒸馏水 100ml福尔马林(40%甲醛) 0．5ml将黑色素在蒸馏水中煮沸5分钟，然后加入福尔马林作防腐剂。
实验用染色液的配制
实验用染色液的配制1．黑色素液水溶性黑素10g，蒸馏水100mL, 甲醛（福尔马林）0.5mL。
可用作荚膜的背景染色。
2．墨汁染色液国产绘图墨汁40mL，甘油2mL，液体石炭酸2mL。
先将墨汁用多层纱布过滤，加甘油混匀后，水浴加热，再加石炭酸搅匀，冷却后备用。
用作荚膜的背景染色。
3．吕氏(Loeffier)美蓝染色液A液：美蓝(methylene blue, 又名甲烯蓝)0.3g, 95%乙醇30mL;B液：0.0l% KOH l00mL。
混合A液和B液即成，用于细菌单染色，可长期保存。
根据需要可配制成稀释美蓝液，按1：10或1：100稀释均可。
4．革兰氏染色液(1)结晶紫(crystal violet)液：结晶紫乙醇饱和液(结晶紫2g溶于20mL95%乙醇中)20mL，1%草酸铵水溶液80mL 将两液混匀置24h后过滤即成。
此液不易保存，如有沉淀出现，需重新配制。
(2)卢戈(Lugol)氏碘液：碘1g，碘化钾2g，蒸馏水300mL。
先将碘化钾溶于少量蒸馏水中，然后加入碘使之完全溶解，再加蒸馏水至300mL即成。
配成后贮于棕色瓶内备用，如变为浅黄色即不能使用。
(3)95%乙醇：用于脱色，脱色后可选用以下(4)或(5)的其中一项复染即可。
(4)稀释石炭酸复红溶液：碱性复红乙醇饱和液(碱性复红1g, 95%乙醇l0mL, 5%石炭酸90mL混合溶解即成碱性复红乙醇饱和液)，取石炭酸复红饱和液l0mL加蒸馏水90mL即成。
(5)番红溶液：番红O(safranine，又称沙黄O)2.5g, 95%乙醇100mL，溶解后可贮存于密闭的棕色瓶中，用时取20mL与80mL蒸馏水混匀即可。
以上染液配合使用，可区分出革兰氏染色阳性(G+)或阴性(G-)细菌，G-被染成蓝紫色，G+被染成淡红色5. 鞭毛染色液A液：丹宁酸5.0g, FeCl3 1.5g，15%甲醛(福尔马林)2.0mL，l%NaOH 1.0mL，蒸馏水l00mL;B液：AgNO3 2.0g, 蒸馏水100mL。
革兰氏染色液的配制
革兰氏染色液的配制第1液：结晶紫溶液结晶紫乙醇饱和溶液100mlA液：结晶紫 2.5g95%乙醇25.0mlB液：1%草酸铵溶液将结晶紫研细后，加入95%酒精，使之溶解，配成A液；将草酸铵溶于蒸馏水，配成B液。
两液混合即成，。
第2液：（路）卢戈碘液碘化钾2g碘1g蒸馏水300ml先将碘化钾溶于少量蒸馏水中，再将碘溶于碘化钾溶液中，溶解时可稍加热，最后补足蒸馏水量。
第3液：脱色剂（1）95%乙醇或（2）丙酮乙醇溶液100ml95%乙醇70ml丙酮30ml第4液：番红花红染色液2.5%番红O（Safranin O）95%酒精溶液10ml蒸馏水90ml革兰染色液的操作方法1.涂片：取一洁净载玻片，滴一小滴生理盐水于玻片中央，按无菌操作要求，先用接种环，挑取少量某菌培养物于玻片中央水滴中，涂布均匀。
要求涂片薄而无均匀。
使其自然干燥。
2.干燥、固定：涂片干燥后，快速通过火焰2-3次，进行固定。
固定时不可过热。
以载玻片不烫手为宜。
3.染色：a) 初染：滴加结晶紫染色液覆盖玻片涂布区，染色1分钟，用水冲洗。
b) 媒染：滴加革兰氏碘液冲去残水，并覆盖1分钟，水洗。
c) 脱色：甩净载玻片上水分，倾斜玻片，并衬以白纸，用95%乙醇滴洗至无紫色褪下时为止，时间20-30S。
立即用水缓缓冲洗，注意脱色时间不可过长，以免呈现假阴性。
d) 复染：滴加番红染色液，染色3-5分钟，水洗。
待其自然干燥，镜检。
革兰氏阳性菌呈紫色，革兰氏阴性菌呈红色。
秋雨工作室朱玺瑜2011年10月28日。
革兰氏染色液配制记录表
SYS/BD-ZY-J-035-1-A
配制日期
配制过程
配制量
配制人
保质期
①结晶紫配制液：称取g结晶紫溶于ml 95%酒精中形成A液。称取g草酸铵溶于ml蒸馏水中形成B液。混合AB液，静置48h，储存于棕色试剂瓶中。
②碘液配制：称取g碘化钾溶于少量蒸馏水中，加入g碘，待碘全部溶解后，加蒸馏水பைடு நூலகம்释至ml。
③番红染液配制：称取番红g溶解于ml95%酒精中，完全溶解后加蒸馏水稀释至ml。
④95%酒精ml。
③番红染液配制：称取番红g溶解于ml95%酒精中，完全溶解后加蒸馏水稀释至ml。
④95%酒精ml。
①结晶紫配制液：称取g结晶紫溶于ml 95%酒精中形成A液。称取g草酸铵溶于ml蒸馏水中形成B液。混合AB液，静置48h，储存于棕色试剂瓶中。
②碘液配制：称取g碘化钾溶于少量蒸馏水中，加入g碘，待碘全部溶解后，加蒸馏水稀释至ml。
革兰氏染色液的配制,超详细
革兰氏染色液的配制一、实验试剂：（结晶紫、草酸铵、碘、碘化钾、番红）1. 结晶紫溶液：A液：结晶紫：2g，95%乙醇：20ml。
B液：草酸铵：0.8g，蒸馏水：80ml。
需在用前24小时将A液. B液混合，过滤后装入试剂瓶内备用.2. 碘液：碘：1g，碘化钾：2g蒸馏水：300ml。
出碘与碘化钾混合并研磨，加入几毫升水，使其逐渐溶解，然后研磨，继续加入少量蒸馏水至完全溶解，最后补足水量。
也可用少量蒸馏水，先将碘化钾完全溶解，再加入碘片，待完全溶解后，加水至300ml。
3. 脱色液：95%乙醇。
4. 复染液：A.贮存液：番红：2.5g，95％乙醇：100ml。
B.应用比例：A液：10ml，蒸馏水：90ml。
菌片制备：染色的第一步是制作涂片。
菌液涂片时，用接种环蘸取菌液点在载玻片上，标本可直接在玻片上涂布，菌落涂片时，先取生理盐水1滴，置玻片上，用接种针挑去菌落，在盐水中涂布。
涂片时必须注意应轻轻操作。
猛烈的动作会改变菌细胞原有的排列形式，或造成细菌鞭毛脱落，影响结果的准确性。
制备的涂片应自然干燥，并经火焰固定，固定温度不易过高，以玻片背面接触手背不烫为准，否则可能使细胞形态改变。
将固定后的涂片进行染色。
操作步骤：1 ．涂片将培养的不同菌分别作涂片（注意涂片切不可过于浓厚），干燥、固定。
固定时通过火焰1一2 次即可，不可过热，以载玻片不烫手为宜。
2 ．染色( 1 ）初染加草酸铰结晶紫一滴，约一分钟，水洗。
( 2 ）媒染滴加碘液冲去残水，并覆盖约一分钟，水洗。
( 3 ）脱色将载玻片上面的水甩净，并衬以白背景，用95 ％酒精滴洗至流出酒精刚刚不出现紫色时为止，约20 一30 秒钟，立即用水冲净酒精。
( 4 ）复染用番红液染1 一2 分钟，水洗。
( 5 ）镜检干燥后，置油镜观察．革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色。
以分散开的细菌的革兰氏染色反应为准，过于密集的细菌，常常呈假阳性。
( 6 ) 同法在一载玻片上以大肠杆菌与枯草芽孢杆菌混合制片，作革兰氏染色对比。
细菌的革兰氏染色及染色液的配制
革兰氏染色的一般步骤革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法，1884年由丹麦医师Gram创立。
未经染色之细菌，由于其与周围环境折光率差别甚小，故在显微镜下极难观察。
染色后细菌与环境形成鲜明对比，可以清楚地观察到细菌的形态、排列及某些结构特征，而用以分类鉴定。
革兰氏染色属复染法，即将标本固定后，先用结晶紫染色1分钟后水洗，然后加革兰碘液媒染一分钟后用酒精脱色，再用稀释石炭酸复红复染。
染色后除可以看到细菌形态外，还可将细菌分为两大类，即不被酒精脱色而保留紫色者为革兰氏阳性菌（G＋）。
被酒精脱色复染成红色者为革兰氏阴性菌（Gˉ）。
革兰氏染色原理尚不肯定，可能与细菌所带核糖核酸、细菌壁结构通透性、等电点等因素有关。
致病菌如金黄色葡萄球菌、绿色溶血性链球菌、肺炎球菌、白喉杆菌、炭疽杆菌等属革兰氏染色阳性菌。
百日咳杆菌、大肠杆菌（大肠埃希菌）、铜绿假单胞菌、伤寒杆菌、痢疾杆菌、霍乱弧菌、沙门菌、流行性脑膜炎双球菌、淋病双球菌等均属革兰氏阴性菌。
所以根据细菌的革兰氏染色性质，可以缩小鉴定范围，有利于进一步分离鉴定，以对疾病做出诊断。
又由于各种抗生素的抗菌谱不同，革兰氏染色尚可做为选用抗生素的参考。
革兰氏染色法一般包括初染、媒染、脱色、复染等四个步骤，具体操作方法是：1）涂片固定。
2）草酸铵结晶紫染1分钟。
3）纯化水冲洗。
4）加碘液覆盖涂面染1分钟。
5）水洗，用吸水纸吸去水分。
6）加95%酒精数滴，并轻轻摇动进行脱色，30秒后水洗，吸去水分。
7）番红染色液（稀）染10秒钟后，纯化水冲洗。
干燥，镜检。
染色的结果，革兰氏正反应菌体都呈紫色，负反应菌体都呈红色。
实验三细菌的革兰氏染色法一、目的要求了解革兰氏染色的原理，学习并掌握革兰氏染色的方法。
二、基本原理革兰氏染色反应是细菌分类和鉴定的重要性状。
它是1884年由丹麦医师Gram创立的。
革兰氏染色法（Gram stain）不仅能观察到细菌的形态而且还可将所有细菌区分为两大类：染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用G+表示；染色反应呈红色（复染颜色）的称为革兰氏阴性细菌，用G-表示。
常用染色液的配制
常用染色液的配制一、骆氏美蓝染色液（碱性美蓝染色液）甲液：美蓝0.3克，95%酒精30ML乙液：0.01%氢氧化钾溶液100ML甲、乙混合即可，密闭保存，一年后可获多色性。
二、革兰氏染色液1、草酸铵结晶紫染液甲液：结晶紫2G，95%酒精20ML，或结晶紫饱和酒精溶液2ML加蒸馏水18ML。
乙液：草酸铵0.8克，蒸馏水80ML。
甲、乙混合，静置48小时，过滤后备用，可较久贮存。
2、革兰氏碘溶液碘片1G，碘化钾2G，蒸馏水300ML碘化钾+3－5ML蒸馏水，溶解后+碘片，摇匀后+蒸馏水至足量。
3、95%酒精，用作脱色剂4、碱性复红染色液碱性复红（一品红）0.1G，蒸馏水100ML可用沙黄水溶液或稀释石炭酸复红液代替此液。
沙黄水溶液：沙黄饱和酒精溶液+10倍蒸馏水，保存期小于4个月。
稀释石炭酸复红染色液：石炭酸复红液10ML+蒸馏水90ML三、抗酸染色液1、石炭酸复红染色液3%碱性复红酒精溶液10ML+5%石炭酸水溶液90ML，过滤即可。
2、盐酸酒精液浓盐酸3ML+95%酒精97ML四、克利特氏荚膜染色液1、美蓝溶液：美蓝1G+96%酒精10ML+100ML蒸馏水2、碱性红溶液：碱性复红0.03G+1ML96%酒精+99ML蒸馏水五、瑞特氏染色液1、0.1G瑞特氏染粉研磨，再加中性甘油3ML，充分研磨，后徐徐加入甲醇液60ML，边研边搅，存于棕色瓶中过夜，过滤后贮于棕色瓶中，越久越好。
2、磷酸盐缓冲液甲液：磷酸氢二钠23.86G，1000ML蒸馏水。
乙液：磷酸二氢钾9.07G，1000ML蒸馏水。
4份甲液+1份乙液即可。
附录一染色液的配制免费
附录一染色液的配制免费附录一染色液的配制1、吕氏（Loefflev）美蓝染色液A液：2%美蓝（Methylene blue）95%酒精溶液B液：10%KOH溶液取A液30ml、B液0.1ml与100ml蒸馏水混合。
2、石炭酸复红染色液A液：4%碱性复红（basic fuchsin）95%酒精溶液B液：5%石炭酸溶液将碱性复红在研钵中研磨后，逐渐加入95%酒精，继续研磨使其溶解、配成A液。
取A液10ml、B液90ml混合即可。
一般可将此溶液稀释5-10倍使用。
但稀释液易变质失效，一次不宜多配。
3、革兰氏（gram）染色液（1）草酸铵结晶紫染液：A液：1%结晶紫（Crystal violet）95%酒精溶液B液：1%草酸铵（Ammonium oxalate）溶液取A液20mlB液80ml，静置48/小时后使用。
（2）路哥氏（Lugol）碘液：碘片1.0g、碘化钾2.0g、蒸馏水300ml先将碘化钾溶解在少量水中，再将碘片溶解在碘化钾溶液另，待碘全部溶解后，加够水即成。
（3）95%酒精溶液（4）沙黄（蕃红）复染液：2.5%沙黄（Safranlne O）95%酒精溶液。
取此液10ml与90ml蒸馏水混匀即成。
4、芽孢染色液（1）5%孔雀绿(Malachite green)溶液。
（2）0.5%沙黄溶液。
5、荚膜染色液将黑色素在蒸馏水中煮沸5min，配成5%溶液，然后加入福尔马林（40%甲醛）0.5%(V/V)作防腐剂。
（2）沙黄染色液与革兰氏染色液中的沙黄复染液相同。
6、鞭毛染色液A液：单宁酸5.0g、FeC131.5g、蒸馏水100ml，福尔马林（15%）2.0ml、NaOH(1%)1.0ml。
配好后应当日使用，次日即效果差，第三日则不能使用。
B液：2%AgNO3溶液待AgNO3溶解后，取出10ml备用。
向其余的90ml AgNO3中滴入浓NH4OH，使之成为很浓厚的悬浮液，再继续滴加NH4OH，直到新形成的沉淀又重新刚刚溶解为止。
革兰氏染色——精选推荐
⾰兰⽒染⾊⾰兰⽒染⾊法是细菌学中⼴泛使⽤的⼀种鉴别染⾊法，1884年由丹麦医师Gram创⽴。
细菌先经碱性染料结晶染⾊，⽽经碘液媒染后，⽤酒精脱⾊，在⼀定条件下有的细菌此⾊不被脱去，有的可被脱去，因此可把细菌分为两⼤类，前者叫做⾰兰⽒阳性菌（G+），后者为⾰兰⽒阴性菌（G—）。
为观察⽅便，脱⾊后再⽤⼀种红⾊染料如碱性蕃红等进⾏复染。
阳性菌仍带紫⾊，阴性菌则被染上红⾊。
有芽胞的杆菌和绝⼤多数和球菌，以及所有的放线菌和真菌都呈⾰兰⽒正反应；弧菌，螺旋体和⼤多数致病性的⽆芽胞杆菌都呈现负反应。
⾰兰⽒阳性菌和⾰兰⽒阴性菌在化学组成和⽣理性质上有很多差别，染⾊反应不⼀样。
现在⼀般认为⾰兰⽒阳性菌体内含有特殊的核蛋⽩质镁盐与多糖的复合物，它与碘和结晶紫的复合物结合很牢，不易脱⾊，阴性菌复合物结合程度底，吸附染料差，易脱⾊，这是染⾊反应的主要依据。
另外，阳性菌菌体等电点较阴性菌为低，在相同PH条件下进⾏染⾊，阳性菌吸附碱性染料很多，因此不易脱去，阴性菌则相反。
所以染⾊时的条件要严格控制。
例如，在强碱的条件下进⾏染⾊，两类菌吸附碱性染料都多，都可呈正反应；PH 很低时，则可都呈负反应。
此外，两类菌的细胞壁等对结晶紫—碘复合物的通透性也不⼀致，阳性菌透性⼩，故不易被脱⾊，阴性菌透性⼤，易脱⾊。
所以脱⾊时间，脱⾊⽅法也应严格控制。
⾰兰⽒染⾊法⼀般包括初染、媒染、脱⾊、复染等四个步骤，具体操作⽅法是：1）涂⽚固定。
2）草酸铵结晶紫染1分钟。
3）⾃来⽔冲洗。
4）加碘液覆盖涂⾯染1分钟。
5）⽔洗，⽤吸⽔纸吸去⽔分。
6）加95%酒精数滴，并轻轻摇动进⾏脱⾊，30秒后⽔洗，吸去⽔分。
7）蕃红梁⾊液（稀）染10秒钟后，⾃来⽔冲洗。
⼲燥，镜检。
染⾊的结果，⾰兰⽒正反应菌体都呈紫⾊，负反应菌体都呈红⾊。
⼀、常⽤染⾊液的配制⒈碘-碘化钾（I2-KI）溶液能将淀粉染成蓝紫⾊，蛋⽩质染成黄⾊，也是植物组织化学测定的重要试剂。
配⽅：碘化钾2g ；蒸馏⽔300ml ；碘1g先将碘化钾溶于少量蒸馏⽔中，待全溶解后再加碘，振荡溶解后稀释⾄300mL，保存在棕⾊玻璃瓶内。
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革兰氏染色液配制
文稿归稿存档编号：[KKUY-KKIO69-OTM243-OLUI129-G00I-FDQS58-
革兰氏染色液
保质期：2-8度一年.
革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法，媒染剂碘液进入菌体后与结晶紫结合，革兰氏阳性菌对碘与结晶紫摄取量多且牢固，不易被酒精脱色。
革兰氏阴性菌对碘与结晶紫摄取量少，不牢固，易被酒精脱色。
为观察方便，脱色后再用一种红色染料如碱性蕃红进行复染。
阳性菌仍带紫色，阴性菌则被染上红色。
操作步骤：
1、标本处理：
（1）.有菌部位的标本，如痰液、粪便、各种拭子、创面等可直接涂片。
（2）.无菌部位的标本，如脑脊液、胸水、腹水、胆汁、尿液、关节液等，应取适量标本（最高可达5-7ml）,经3000rpm?离心10min.，取沉渣涂片染色。
2、涂片制作：菌液涂片时，用接种环沾取菌液点在载玻片上，标本可直接在玻片上涂布；菌落涂片时，先取生理盐水一滴，置玻片上，用接种针挑取菌落在盐水中涂布。
制作的涂片应自然干燥，并经火焰固定，固定的温度不宜过高，以玻片背面接触手背不烫为准，否则可能使细菌形态改变。
将固定后的涂片进行染色。
3、染色方法：
革兰氏染色的关键在于严格掌握酒精脱色程度，如脱色过度，则阳性菌可被误染为阴性菌；而脱色不够时，阴性菌可被误染为阳性菌。
此外，菌龄也影响染色结果，如阳性菌培养时间过长，或已死亡及部分菌自行溶解了，都可能会呈阴性反应。
（1）.加上结晶紫后，染色1分钟，水洗。
（2）.加上碘液后染色1分钟，水洗。
（3）.加上95%酒精,摇动玻片,根据涂片厚度,脱色约30-60秒，水洗,吸去水分。
（4）.加上蕃红后，染色1分钟，水洗。
（5）.吸干或在空气中凉干后，油镜镜检。
4．结果观察：紫色为革兰氏阳性，红色为革兰氏阴性。
注意事项：
1．标本涂片不能太厚，严格按操作要求进行。
2．玻片通过火焰温度不能太高。
3．若涂片较厚，应延长脱色时间，直至不再出现紫色为止。
4．碘液变透明，则不能使用。
5.水洗时动作要轻柔,沿载玻片对角线方向用洗瓶冲洗,以免把菌体冲掉。
革兰氏染色液如果用量少，买现成的比较话算，如果用量大，自己配起来也溶液，就是试剂种类多了点。
其配制方法如下：
(1)结晶紫(crystal violet)液：结晶紫乙醇饱和液(结晶紫2g溶于
20mL95%乙醇中)20mL，1%草酸铵水溶液80mL?将两液混匀置24h后过滤即成。
(2)卢戈(Lugol)氏碘液：碘0.33g，碘化钾0.66g，蒸馏水100mL。
先将碘化钾溶于少量蒸馏水中，然后加入碘使之完全溶解，再加蒸馏水至100mL即成。
配成后贮于棕色瓶内备用，如变为黄色即不能使用。
(3)95%乙醇：用于脱色，脱色后可选用以下(4)或(5)的其中一项复染即可。
(4)番红溶液：番红O(safranine，又称沙黄O)2.5g, 95%乙醇100mL，溶解后可贮存于密闭的棕色瓶中，用时取20mL与80mL蒸馏水混匀即可。