人肝癌顺铂耐药细胞系的建立及其生物学特征

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材料与方法
药品与试剂
胞悬液接种至内铺小玻片的 I5 孔培养板内，置于 瑞 #"G 、 ’B ,HI 孵箱内培养 "I K 后用 &<> 洗 I 遍， 再用 &<> 洗 I 遍， 室温晾干， 中 氏染液染色 36 D8N， 性树胶封片， 光镜下观察、 拍照。 3J ’J I 透射电镜观察：胰酶消化收集 3 M 36" 个细 胞， 用 IJ ’B 戊二醛固定， 继用 IB 四氧化锇固定， 脱 水、包埋、切片和染色按常规处理，透射电镜 （+/-?,+/(466 型， 日本） 观察、 拍照。 !" 2 细胞生长曲线和群体倍增时间测定 将 ’ M 365 ; DE 单 细 胞 悬 液 接 种 至 3’ DE 培 养 瓶， 每瓶 I DE， 共 I3 瓶， 置于 #"G 、 ’B ,HI 孵箱内培 养。 每日计数 # 瓶细胞取均值，连续观察 " 日。 以 培养时间为横轴，细胞数为纵轴绘制细胞生长曲 （P:C9E8NF 线， 并按 &OXXVUW:N 公式 S # T 计算群体倍增时间 。-% Q - M E:FI ; Z E:F\X(E:F\6 [（其中 \6 为初 X8DV， -% ） 。 始细胞数， \X 为终末细胞数， - 为 \X(\6 时间） !" 3 （45-） 分析细胞周期分布 流式细胞仪 收集细胞 3 M 364 ; DE， &<> 洗 I 次， "6B 冷乙醇 固定过夜， 在流式 &<> 洗 I 次， &/ 染液冰浴 #6 D8N， ） （)?,> ,OE89CU <%， 上分析细胞周期分 细胞仪 *>? 布。 !" 6 细胞染色体的制备和分析 胰酶消化 6J 6’ !F ; DE 秋水仙素 #"G 处理 I K， 收获细胞，6J 6"’ D:E ; = ],E 溶液低渗处理 I6 D8N， 新鲜固定液 Z 甲醇^ 冰醋酸 Q #^ 3 [ 固定 # 次， 78VDWO 染液染色， 流水冲洗、 晾干， 油镜观察、 拍照。 !" 7 统计学处理 实验数据用 >?> 统计软件处理， 采用 "I 检验进 行分析。
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《癌症 》EF25*=* GH4B51+ HI E15<*BJ #$$#J #% K ! L ： !"# - !",
人肝癌顺铂耐药细胞系的建立及其生物学特征
杨俊霞 %!， 汤为学 #
（%: 重庆医科大学药理学教研室， 重庆 M$$$%,； 重庆 M$$$%,） #: 重庆医科大学病理生理学教研室，
顺铂（<2=>+1;25，<??@）是目前临床使用的最重
收稿日期： #$$%&%%&$"’ 修回日期： #$$#&$(&#! ! 通讯作者： )*+： !, - #( - ,!!%.%(! 345621&71589 #,(: 5*; /&012+：
要的抗癌药物之一， 具有广泛的抗瘤谱。 但由于耐药 性的产生使其不能发挥应有的治疗作用，而常常导 致化疗失败。肿瘤细胞发生耐药的机制十分复杂， 在体外建立多药耐药细胞系是研究肿瘤产生多药耐 （04+;2AB48 B*=2=;15<*， 的重要手段。鉴于 药性 C?D）
【<%"#6$4#】;$4=86,3+2 > ?%@*4#’A*： ?B48 B*=2=;15<* 2= 1 >H>4+1B ;H>2< 25 ;40HB =;4A7: )F* AB48&B*=2=;15; <*++ +25* *=;1X+2=F*A 25 Y2;BH 2= 8*5*B1++7 4=*A 1= ;F* B*=*1B<F 0HA*+: )H *6>+HB* ;F* 0*<F152=0 HI B*=2=;15<* HI F*>1;H<*++4+1B （ZEE） ;H <2=>+1;25J [* A*=285*A ;F2= =;4A7 ;H *=;1X+2=F 1 <2=>+1;25&25A4<*A F4015 F*>1;H<*++4+1B <1B<25H01 <1B<25H01 T B*=2=;15; ZEE <*++ +25* K NOP Q <??@ L [1= *=;1X+2=F*A AB48&B*=2=;15; <*++ +25* 15A =;4A7 2;= <F1B1<;*B2=;2<=: B*#(,2"： 8B1A41++7 X7 25<B*1=258 AH=* HI <2=>+1;25 15A 25;*B02;;*5; 1A0252=;B1;2H5’ AB48 =*5=2;2Y2;7 [1= A*;*<;*A X7 C)) 1==17’ ;F* <F158*= HI 2;= X2H+H82<1+ <F1B1<;*B2=;2<= [*B* A*;*B025*A 4=258 +28F; 02<BH=<H>7J *+*<;BH5 02<BH=<H>7J <*++ <H45;258J I+H[ （\EC） <7;H0*;B7 J 15A <FBH01;H=H0* 151+7=2=: 9*"3&#"： NOP Q <??@ <*++ +25* [1= A*Y*+H>*A 1I;*B ( 0H5;F= [2;F =;1X+* B*=2=;15<* ;H <2=>+1;25 15A ;F* B*=2=;15<* 25A*6 [1= %$: !%’ NOP Q <??@ <*++= *6F2X2;*A <BH==&B*=2=;15<* ;H 0157 H;F*B <F*0H;F*B1>*4;2< 18*5;= K R&\4HBH4B1<2+J *>21AB2107<25J *;< L : )F* 0HB>FH+H87 15A <FBH01;H=H0* 540X*B HI NOP Q <??@ <F158*A’ AH4X+258 ;20* >BH+H58*A ； 15A ;F* <*++ 540X*B HI S&>F1=* 15A O# Q C&>F1=* A*<B*1=*A [F2+* 25 O$ Q O% >F1=* 25<B*1=*A <H0>1B*A [2;F >1B*5; <*++=: .,+4&3"’,+： NOP Q <??@ <*++ +25* =FH[= ;F* ;7>2<1+ 15A =;1X+* B*=2=;15; >F*5H;7>*: C*DE,62"F Z*>1;H<*++4+1B <1B<25H01’ E2=>+1;25’ ?B48 B*=2=;15<*’ E*++ +25*
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杨俊霞， 等 J 人肝癌顺铂耐药细胞系的建立及其生物学特征
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目前国内外尚缺乏人肝癌耐 $%%& 的细胞模型，本 文采用逐步递增 $%%& 浓度、 间歇作用体外诱导法， 建立了人肝癌顺铂耐药细胞系，为深入研究人肝癌 顺铂耐药的机制和筛选耐药逆转剂提供理想的实验 工具。
每一浓度的抑制率， 并根据中效方程式 计算出各 种 抗 癌 药 物 的 半 数 抑 制 浓 度 （/,’6 ） 及 耐 药 指 数 （耐药细胞） （亲 （UVW8WXON$V 8NPVY， ， 1/） 1/ Q /,’6 ; /,’6 本细胞） 。 !" 1 3J ’J 3 细胞形态学观察 光镜观察 Z 瑞氏染色法 [ ： 将 ’ M 365 ; DE 单细
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I66 !E，并加入倍比稀释成 ’ 种浓度的各种抗癌药 物各 I6 !E， 每一浓度重复 # 孔， 对照组加入等体积 并设空白对照组， 置 #"G 、 &<>， ’B ,HI 孵箱内培养 每孔加无血清培养液 I66 !E 及 4! K 后吸去上清液， ’ DF ; DE 2-- I6 !E，继续培养 5 K，小心吸去上清 （%2>H） 置于微量振 液， 每孔加二甲基亚砜 I66 !E， （<8:(1OP .I’’6 荡器上振荡 ’ D8N， 自动酶标读数仪 （ ! 值） 型， 测各孔吸光度值 ， 检测波长为 466 *>?） （3 R ! 用药组 ; ! 细胞对照组 ） 按抑制率 Q ND。 M 366B 计算
$%%& 山 东 齐 鲁 制 药 厂 生 产 ； ’( 氟 尿 嘧 啶 （’()*） 上海旭东海普药业有限公司生产； 羟基喜树 （+,&-） 碱 吉林长春天诚药业有限公司生产； 表阿霉 素 （.&/） 江苏法玛西亚有限公司生产；长春新碱 （0,1） 上 海 华 联 药 业 有 限 公 司 生 产 ； 丝 裂 霉 素 （22,） 日 本 协 和 发 酵 工 业 株 式 会 社 生 产 ； 提供； 1&2/(3456 培养液由 789$: ; <1= 公司（*>?） （2--） 四甲基偶氮唑盐 为上海华舜生物工程有限公 司产品。 !" # 细胞培养 由重庆医科大学病毒性 @7A 为人肝癌细胞系， 肝炎研究所提供。细胞培养于 1&2/(3456 培养液中 （含 36B 热灭活小牛血清， 青霉素 366 C ; DE 和链霉 ） 在 #"G 、 饱和湿度条件下培 素 366 !F ; DE ， ’B ,HI 、 养， 6J 3B 胰蛋白酶消化传代。 !" $ 耐药细胞系 %&’ ( )**+ 的建立 采用逐步递增 $%%& 浓度间歇作用的方法诱 导 。 取 对 数 生 长 期 @7A 细 胞 接 种 至 含 $%%& 的 （6J 3 !F ; DE） 从低浓度 开始， 1&2/(3456 培养液中， 作用 5! K 后弃去含药培养液，加入新鲜培养液，继 续培养，待其恢复正常生长，消化传代后复用 6J 3 如此反复换液、 传代， 逐步 !F ; DE $%%& 处理 5! K， 提高 $%%& 浓度间歇诱导， 最终获得一株能耐受 6J ’ 命名为 @7A ; $%%&， 并将其 !F ; DE $%%& 的细胞系， 维持培养在含 6J 3 !F ; DE $%%& 的完全培养液中。 !" , -.. 法检测各种抗癌药的细胞毒作用 每孔 L4 孔培养板内加 ’ M 365 ; DE 单细胞悬液，
【摘 要 】 背景与目的： 药物耐受性是当前肿瘤研究的热点。国内外普遍应用体外建立的耐药细胞系作为研究
模型。 为探讨肝癌对顺铂耐药的机理， 本研究首次建立人肝癌顺铂耐药细胞系并研究其生物学特性。 方法： 采用逐步 递增顺铂浓度， 间歇作用体外诱导法建立人肝癌顺铂耐药细胞系 NOP Q <??@； 光镜、 电镜、 C)) 法测定药物敏感性； 活细胞计数法、 流式细胞仪及染色体分析等方法观察其生物学特征的改变。结果： 历时 ( 个月建成人肝癌顺铂耐药 其对顺铂的耐药指数为 %$: !% ， 并且与 R& 氟尿嘧啶、 表阿霉素等多种抗癌药有不同程度的交叉 细胞系 NOP Q <??@， 耐药性； 体外群体倍增时间较亲代细胞延长； 细胞周期分析发现其 NOP Q <??@ 的细胞形态及染色体数目发生改变； 且耐药性能稳定。 S 期与 O# Q C 期细胞减少、 O$ Q O% 期细胞增多。结论： NOP Q <??@ 细胞具有耐药表型， 关键词： 肝癌； 顺铂； 药物耐受性； 细胞系 中图分类号： D"(R: " 文献标识码： T （#$$# ） 文章编号： %$$$ - M,"U $! - $!"# - $R
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#" ! 特征
结
果
%&’ ( )**+ 耐药细胞系的建立及多药耐药 采用逐步递增 $%%& 浓度 间歇作用的方法对
@7A 细胞进行体外诱导筛选，历时 # 个月获得了在 6J ’ !F ; DE $%%& 作 用 下 生 长 良 好 的 耐 药 细 胞 系 @7A ; $%%&。2-- 法检测结果表明_ @7A ; $%%& 细 胞对 $%%& 的耐药指数为 36J !3，并且对另外 ’ 种