肝癌细胞和正常肝细胞自体荧光光谱比较研究

肝癌细胞和正常肝细胞的自体荧光光谱研究

李静，曾红娟，庞小峰

电子科技大学生命科学与技术学院，四川成都（610054）

Email: orangeljj@

摘要：本文采用荧光光谱技术对体外培养的SMMC-7721肝癌细胞和HL-7702正常肝细胞的自体荧光进行了研究。结果表明：两种细胞的自体荧光的发射光谱在波长为550-720nm 范围内发射峰的数目和峰位均相同(602nm和691nm)，只是主峰的波形略有差异。而在波长为720nm-800nm范围内，肝癌细胞有一特征荧光峰，峰位置在波长为734nm附近，而正常肝细胞则无此峰。通过对多代培养的细胞进行荧光光谱测试，发现两种细胞的荧光光谱特征在细胞传代的过程中保持不变，说明细胞中的组成物质在细胞传代过程中保持稳定。这两方面的实验为利用荧光光纤传感器来检测癌症打下了坚实的基础。

关键词：肝癌细胞；正常肝细胞；自体荧光光谱

中图分类号：TN249

1．引言

目前全世界发现有100多种癌症，身体的任何部位均可能受到侵袭。仅在2005年我国就有760万人死于癌症，占全世界5800万死亡人数的13%。在所有因癌症死亡者中，有70%以上发生于低收入和中等收入国家。全世界造成男性死亡5种最常见癌症(按发生频度排列)为：肺癌、胃癌、肝癌、结肠直肠癌和食道癌。造成女性死亡5种最常见癌症(按发生频度排列)为：乳腺癌、肺癌、胃癌、结肠直肠癌和宫颈癌。总的来说，对国内在不同阶段因不同癌症而导致死亡的死亡率顺序进行调查统计的结果显示，70年代中的顺序为胃癌、食管癌、肝癌、肺癌、宫颈癌；90年代初的顺序为胃癌、肝癌、肺癌、食管癌、结直肠癌；本世纪初的顺序为：肺癌、食管癌、肝癌、胃癌、结直肠癌。另外对1991年-2000年中国城市和农村主要癌症发病率进行统计，发现在城市居民中肺癌占首位，其次为肝癌、胃癌、结、直肠癌，食管癌，这五种癌症合计占癌症死因的71.25%。在农村患者中，肝癌居第一位，其次为肺癌、胃癌、食管癌及结、直肠癌，这五种癌症合计占癌症死因的79.4%。不管在城市还是在农村，对全世界范围来说，对那些因癌症而死亡的病人如能及早发现和充分治疗，其中有1/3癌症都是可以治愈的。这里及早发现的一个含义就是要进行早期检查。目前的早期检查主要是指常规检查。

对于肝癌常用的实验室检查主要包括：1、甲胎蛋白的含量测定；2、γ谷氨酰转移酶的含量测定；3、α－L－岩藻糖苷酶的含量测定；4、B型超声波；5、电子计算机体层摄影、磁共振以及肝动脉造影等[1]。这些常规检查，不仅过程非常复杂，费时较长以外，而且还伴随着一定程度的痛苦。如果我们能提供一种检查过程快捷且经济实惠，检查结果可靠的方法，这将会更有利于推动常规检查工作的开展。近年来，利用荧光光谱技术来诊断恶性肿瘤已日渐引起肿瘤专家的关注，由于这种诊断方法具有快速、客观、灵敏、准确、无损伤且简单实用等特点并可以检测出常规方法难以发现的早期肿瘤的微弱荧光，有希望成为一种新的癌症诊断方法而引起国内外学者广泛关注，并且在这方面做了大量的研究工作。不过他们的研究主要集中在肿瘤组织和血清的荧光光谱方面[2-5]，而采用荧光光谱技术来对体外培养的肝癌细胞进行研究这方面的报道很少。

本研究的目的就是通过对体外培养的肝癌细胞和正常肝细胞的自体荧光进行研究，找到这两种细胞自体荧光光谱的特征，为采用荧光光谱技术进行肿瘤研究提供依据。

2．实验

2.1 细胞培养

人肝癌细胞SMMC-7721[6]和正常人肝细胞HL-7702[7]，均购自华西医院移植免疫重点实验室。将两种细胞分别加入含10% 新生牛血清（GIBCO）的PMI1640培养基（Hyclone）并置于5%CO2的培养箱中，37。C常规培养。

2.2 样品制作

将原位杂交专用盖玻片置于六孔培养板中，将细胞按5×105/mL的密度接种于培养板中，制作细胞爬片。在细胞生长的第4天将细胞爬片取出，检测爬片上细胞的荧光光谱。

2.3 检查细胞的自体荧光光谱

采用日立F-7000荧光光谱仪，检查前用PBS缓冲液洗涤爬片三次。检测条件为：激发光波长（EX）：488nm[8], 发射光波长（EM）范围：550nm-800nm，狭缝（Band Width）：5nm，扫描速度（Scan Speed）：60000nm/min, 响应时间（Response）：0.002s。

3．实验结果

3.1 正常肝细胞与肝癌细胞的荧光光谱比较

两种细胞爬片在488nm光激发下的荧光发射光谱如图1所示。从图中可以看出，对于正常肝细胞，在550-800nm波长范围内，存在两个特征荧光峰，峰位置分别在602 nm和691nm 处，两个峰位置上的荧光强度比约为10：1。而对于肝癌细胞，在550-800nm波长范围内，却存在三个特征荧光峰，峰位置分别在602 nm、734nm和691nm处，前两个峰位置上的荧光强度比约为3：1，在691nm处荧光峰则非常弱。说明肝癌细胞除了含有与正常细胞的相同的生命物质外，它还含有正常细胞所没有的生命物质。

图1两种细胞荧光光谱

3.2 多代培养的正常肝细胞与肝癌细胞的荧光光谱比较

按照上述实验方法分别对正常肝细胞与肝癌细胞进行传代培养，每代培养的细胞爬片分

别进行荧光测试，测试所得的荧光光谱如图2所示，图2（a）为肝癌细胞SMMC-7721的荧光光谱图，图2(b)为正常肝细胞HL-7702细胞荧光光谱图。从这两幅图中可以看出，两种细胞各自所具有的荧光光谱特征在细胞的传代过程中保持不变，说明了组成细胞的物质在细胞的传代过程中保持不变。

图2 多代培养的SMMC-7721细胞(a)和HL-7702细胞(b)的荧光光谱图

4．结论

肿瘤细胞体外培养是进行癌变机理和癌分子生物学研究的重要手段。尽管培养细胞的人造环境和有机体的自然环境不同，然而，培养的细胞和机体内细胞的行为及基本规律是类似的。所以在体外得到的结果对于了解体内肿瘤发生、发展过程也是重要的[9]。我们通过体外正常肝细胞和肝癌细胞的培养实验得知，正常肝细胞与肝癌细胞确实具有不同的荧光光谱特征，这正好说明了癌细胞和正常细胞相比，它的物理、化学性质都发生了变化。所以它们的荧光光谱，可以作为诊断肿瘤的一个依据[10]。