蜡样芽胞杆菌的检验
蜡样芽孢杆菌国标检测方法
蜡样芽孢杆菌国标检测方法蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）是一种广泛存在于自然环境中的细菌，它可以生长在食品和环境中，因此对于食品和饮料行业来说，蜡样芽孢杆菌的检测非常重要。
国际上已经制定了相关的标准，而国内也制定了具体的检测方法。
本文将介绍蜡样芽孢杆菌国标检测方法并展开详细描述，以供相关行业参考。
1. 国标检测方法蜡样芽孢杆菌国标检测方法主要采用了生物学检测和分子生物学检测方法。
生物学检测主要使用平板计数法和过滤膜法，分子生物学检测主要使用聚合酶链式反应法（PCR法）和实时荧光定量PCR法（qPCR法）。
2. 样品选择需要检测的样品包括：发酵食品、膳食补充剂、调味品、果蔬制品、肉制品和乳制品等。
3. 样品制备样品制备前应先进行预处理。
首先采样应在保持样品原有状态的基础上进行。
对于固体样品，应采用加热处理或浸泡法进行分离；对于液体样品，应使用过滤方法或离心沉淀法进行分离。
4. 平板计数法平板计数法是指直接将样品加入含有富含营养物质的寒天平板中，将平板培养在适宜的环境中，形成菌落后进行计数。
整个操作过程需要消毒操作标本及工具，取样后用无菌吸管挤压或邀约样本，点样于寒天平板上，用无菌毛细管在菌液上滴蒸馏水，最后在恰当条件下培养。
5. 过滤膜法过滤膜法将膜片放入模具上，加入样品后进行过滤，将膜片放入含营养物质的寒天平板中，使其形成菌落后，进行计数。
操作过程中需要对膜片进行密封操作以避免空气污染。
6. PCR法PCR法是指从样品中提取DNA，并使用特定引物进行扩增，在扩增过程中计量目的DNA 的含量。
PCR方法的核心技术是产生大量DNA分子复制，以此来检测目标DNA。
7. qPCR法qPCR法是指通过PCR法产生信息荧光信号，以定量检测目标DNA的含量。
qPCR法和PCR法类似，都是通过DNA扩增并检测扩增产物来判断样品是否含有目标DNA。
8. 标准限值国标GB 4789.38-2016中规定蜡样芽孢杆菌在各类食品和饮料中的限值分别为100CFU/g和10CFU/mL，不得检出则符合标准。
致病菌检验-蜡样芽孢杆菌.
V-P反应
＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ － － － － － － －
明胶液化
＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ － ＋ ＋
与类似菌鉴别：
表2 蜡样芽孢杆菌与其他类似菌的鉴别
项目 过氧化氢酶 动力 硝酸盐还原 酪蛋白分解 卵黄反应 葡萄糖利用（厌氧） 甘露醇 木糖 溶血 已知致病菌特性 巨大芽 孢杆菌 ＋ ＋/－ － ＋/－ － － ＋ ＋/－ － 蜡样芽孢 杆菌 ＋ ＋/－ ＋ ＋ ＋ ＋ － － ＋ 产生肠毒素 苏云金芽孢 杆菌 ＋ ＋/－ ＋ ＋/－ ＋ ＋ － － ＋ 对昆虫致病的 内毒素结晶 蕈状芽孢杆菌 炭疽芽孢杆菌 ＋ － ＋ ＋/－ ＋ ＋ － － －/＋ 假根样生长 ＋ － ＋ －/＋ ＋ ＋ － － －/＋ 对动物
能分解葡萄糖，麦芽糖，蔗糖，水杨苷，产酸不产气。
不分解乳糖，甘露醇，阿拉伯糖，山梨醇，木糖 H2S（-），尿素酶试验（-）卵磷脂酶（+）， V-P试验（+），液化明胶。
二、致病性
食品蜡样芽胞杆菌数量>106/g（mL）时常可导致食物中毒，
导致中毒的主要原因是其产生的肠毒素 。 肠毒素类型： 耐热性肠毒素：100℃30min不能被破坏，常在米饭中形成。 不耐热肠毒素：能在各种食物中形成。
表1 蜡样芽孢杆菌生化分型
生化试验
型别 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
柠檬酸盐利用
＋ － ＋ － － ＋ ＋ － － － ＋ ＋ － ＋ ＋
硝酸盐还原
＋ ＋ ＋ － － － － ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ － － －
淀粉水解
＋ ＋ － ＋ － － ＋ － － ＋ ＋ － ＋ － ＋
临床症状：食物中毒，分为呕吐型和腹泻型两类。
食品中蜡样芽孢杆菌的检验课件
食品中蜡样芽孢杆菌的检验
4
（三）、生化反应
1、能分解GLU，麦芽糖，蔗糖，水杨 苷，产酸不产气。
2、不分解乳糖，甘露醇，阿拉伯糖， 山梨醇，木糖
3、H2S（-），尿素酶试验（-）卵磷脂 酶（+），V—P试验（+），液化明胶， 胨化中乳。
2、蜡样芽胞杆菌的形态与染色特性如何。 3、蜡样芽胞杆菌在普通营养琼脂和甘露醇 卵黄多粘菌琼脂平板上生长的菌落特征如何？ 4、写出蜡样芽胞杆菌检验的基本程序
食品中蜡样芽孢杆菌的检验
21
食品中蜡样芽孢杆菌的检验
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三、微生物检验
▪ 操作步骤：
2、分离试验
取检样或稀释液划线分离培养于选择性培养基 （MYP）上，置37℃培养12-20h，挑取可疑的蜡 状芽胞杆菌菌落接种于肉汤和营养琼脂作成纯培 养，然后做证实试验。
3 证实试验
（1）镜检观察形态
（2）培养特性
（3）生化性状及Βιβλιοθήκη 型食品中蜡样芽孢杆菌的检验
菌落计数
镜检
培养特性观察 生化试验
报告结果
食品中蜡样芽孢杆菌的检验
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三、微生物检验
（二）操作步骤：
1、菌数测定
以无菌操作将检样25g(ml),用灭菌生理盐水 或磷酸盐缓冲液做成10-1—10-5的稀释液。取各 稀释液0.1ml，接种在两个选择性培养基—甘 露醇卵黄多孢菌素（MYP）琼脂培养基上，用L 形涂棒涂布于整个表面，置36±1℃恒温箱培 养 12-20h后选取适当菌落数的平板进行计数， 蜡样芽胞杆菌在此培养基上的菌落为粉红色 （表示不发酵甘露醇），周围有粉红色的晕 （表示产生卵磷脂酶）。计算后从中选取5个 此种菌落做证实试验。
蜡样芽孢杆菌检测国标
蜡样芽孢杆菌检测国标蜡样芽孢杆菌是一种常见的致病微生物，它会引起食物中毒的发生。
针对蜡样芽孢杆菌的检测方法，我国制定了相关国家标准，本文将从以下三个方面进行介绍。
一、蜡样芽孢杆菌简介
蜡样芽孢杆菌又称为蜡样芽孢菌（Bacillus cereus），是一种革兰氏阳性菌。
其孢子分布广泛，可以在空气、土壤、水、食品等各种环境中存活，甚至在高温加工食品中也可以存活。
蜡样芽孢杆菌是一种致病微生物，能够引起急性食物中毒，这是因为它产生的毒素能够影响肠胃道，引起呕吐、腹泻等症状。
二、蜡样芽孢杆菌检测国标
为了保障人们的食品安全，我国对食品中的蜡样芽孢杆菌进行了规范化的检测方法，主要是通过标准的培养及鉴定步骤进行。
1.样品采集：首先需要确定样品的种类，其次选择适当的采集方法，例如在市场上购买的食品需要在废弃部位进行采集，以保障采样的准确性。
2.样品处理：将采集到的食品样品进行前处理，包括样品的清洁去除外部污染等步骤。
3.菌液制备：将采样到的食品样品用合适的培养基进行培养，培养出的菌落进行鉴定，得到蜡样芽孢杆菌后进行菌液制备。
4.检测方法：采用PCR法、生物分子方法、蛋白质检测法等方式对菌液进行检测，以确认菌液中是否有蜡样芽孢杆菌存在。
5.结果判定：判定样品中是否存在蜡样芽孢杆菌，并进行定性和定量分析。
三、总结
蜡样芽孢杆菌检测国标对食品安全有着重要的意义，它通过科学、规范的检测方法保障了人们的食品安全。
在实际操作中，应加强样品采集及前处理，保证样品的准确性。
同时，为了提高检测的灵敏度和准确性，应选择合适的检测方法。
最后，需要将检测结果进行有效记录，以便后续参考。
蜡样芽胞杆菌检测
提高检 出率
适用性 和可操
作性
重新修 订的意
义
扩大检 测范围
与国际 接轨
提高检出率
• 蜡样芽胞杆菌的最佳生长温度为30～32℃。 • 经标准修订协作组验证： • 30 ℃±1 ℃ 培养48h，平均生长率93.69%。 • 30 ℃±1℃ 培养24 h，平均生长率92.28%。 • 36 ℃±1 ℃ 培养24 h。平均生长率82.32%。
材料如下：
• 冰箱：2 ℃-5 ℃; • 恒温培养箱：30 ℃±1 ℃、36 ℃±1 ℃; • 均质器; • 电子天平：感量0.1 g ; • 无菌锥形瓶：100 mL、500 mL; • 无菌吸管：1 mL（具0.01 mL刻度）、10 mL（具0.1
mL刻度）或微量移液器及吸头;
• 无菌平皿：直径90 mm; • 无菌试管：18 mm×180 mm; • 显微镜：10倍-100倍（油镜）; • L涂布棒。
制品、蔬菜、鱼、糊、调味汁、布丁、汤、糕点、沙拉 等。在食品混合物如酱油、布丁、汤、红烧蔬菜炖肉中 也发现该菌。 • 1950年首次在挪威明确报告其致病作用。
蜡样芽胞杆菌引起的食物中毒
• 蜡样芽胞杆菌食物中毒以夏季（6 ～ 10月） 最高。
• 引起中毒的食品往往由于食前保存温度不当， 放置时间较长或食品加热不彻底而导致中毒。
菌体，游离芽胞
巨大芽胞杆菌
6.2 生化鉴定
•挑取纯培养的单个菌落，进行过氧化氢酶试验、 动力试验、硝酸盐还原试验、酪蛋白分解试验、 溶菌酶耐性试验、V-P试验、葡萄糖利用(厌氧) 试验、根状生长试验、溶血试验、蛋白质毒素结 晶试验。 •蜡样芽胞杆菌的主要生化特征见表1。
第十章食品中蜡样芽孢杆菌的检验
镜检
培养特性观察
生化试验
报告结果
检样25克
或
MYP
MYP 0.1ml 血平板或 营养琼脂 镜检 菌落计数 生化试验 结果报告
挑可疑菌落
或
思考题
1 、引起蜡样芽胞杆菌食物中毒的常见食物 有哪些，什么条件下可引起蜡样芽胞杆菌食 中毒。 2、蜡样芽胞杆菌的形态与染色特性如何。 3 、蜡样芽胞杆菌在普通营养琼脂和甘露醇 卵黄多粘菌琼脂平板上生长的菌落特征如何？ 4、写出蜡样芽胞杆菌检验的基本程序
（二）蜡样芽胞杆菌的食物中毒的一 般情况
1、季节性强：（6—10月）夏秋季为高峰期 2 、中毒发病率高： 60%—100% ，集团中爆发， 与葡萄球菌相似 3、中毒与性别、年龄无关： 4、潜伏期长短与中毒症状相关： 呕吐症 0.5—5h，发病 • 腹泻 8h后 5、污染源：主要泥土，灰尘，通过昆虫，不洁 用具，工作人员传播，原料也有.
4、在血平板上，菌落呈浅灰色，不透 明，似白色毛玻璃状，有溶血环。 5、在甘露醇卵黄多粘菌素平板上，菌 落呈粉红色,具有白色混浊环.。
（三）、生化反应
1、能分解GLU，麦芽糖，蔗糖，水杨苷，产 酸不产气。 2 、不分解乳糖，甘露醇，阿拉伯糖，山梨 醇，木糖 3 、 H2S （ - ），尿素酶试验（ - ）卵磷脂酶 （+），V—P试验（+），液化明胶，胨化 中乳。
一、概况
一、生物学特性
（一）、形态与染色 革兰氏阳性大杆菌，芽胞不突出菌体，菌体两 端较平整，多数呈链状排列，周身鞭毛，有 动力。
菌荧 和光 蜡染 样色 芽的 孢铜 杆绿 菌假 单 胞 杆 用孔雀绿染色的蜡样芽孢杆菌芽孢
（二）、培养特性
1、需氧，最适生长30—32℃. 2、在肉汤中混浊生长，有菌膜或壁环， 振摇易乳化。 3、在普通琼脂平板上，菌落灰白色,不 透明，边缘不整齐，表面粗糙，呈毛 玻璃状或白蜡状。
腊样芽孢杆菌
二、流行病学
1、细菌分布 蜡样芽胞杆菌在自然界分布广泛，常存在 于土壤、灰尘和污水中，植物和许多生熟食品 中常见。已从多种食品中分离出该菌，包括肉、 乳制品、蔬菜、鱼、土豆、糊、酱油、布丁、 炒米饭以及各种甜点等。 在美国，炒米饭是引发蜡样芽胞杆菌呕吐 型食物中毒的主要原因；在欧洲大都由甜点、 肉饼、色拉和奶、肉类食品引起；在我国主要 与受污染的米饭或淀粉类制品有关。
三、致病性
蜡样芽胞杆菌引起食物中毒是由于该菌产生 肠毒素。它产生两种性质不同的代谢物，引起 腹泻型综合症的是一种大分子量蛋白；而引起 呕吐型综合症的被认为是一种小分子量、热稳 定的多肽。 致呕吐型综合症的肠毒素至今尚未提纯， 致腹泻型综合症的肠毒素已提纯，其纯化的 肠毒素分子量为55-6.0×103。致腹泻的肠毒 素能使小白鼠致死。
血琼脂平板
甘露醇卵黄多粘菌素平板
3、耐热性 2、培养特性 蜡杆芽胞杆菌耐热，其37℃16小时的肉汤 培养物的D80℃值（在80℃时使细菌数减少90% 所需的时间）约为10-15分钟；使肉汤中细菌 （2.4×107/mL）转为阴性需100℃20分钟。其 游离芽胞能耐受100℃30分钟，而干热灭菌需 120℃60分钟才能杀死。
3.蜡样芽胞杆菌检验程序
4.操作步骤
4.1 菌数测定 以无菌操作将检样25g (m1)，用灭菌生理盐水或磷酸盐缓冲液 做成 10-1-10 -5 的稀释液按GB/T4789.2测定。取各稀释液。0.1mL， 接种在两个选择性培养基-甘露醇卵黄多粘菌素(MYP)琼脂培养基上， 用L形棒涂布于整个表面，置3 6 ℃士1 ℃培养12h -20h ，选取适 当菌落数的平板进行计数，蜡样芽胞杆菌在此培养幕上的菌落为粉 红色（表示不发酵甘露醇）周围有粉红色的晕（表示产生卵磷脂酶） 。计数后，从中挑取五个此种菌落做证实试验，根据证实的蜡样芽 胞杆菌的菌落数计算出该平板上的菌落数，然后乘其稀释倍数， 即得每克（毫升）样品中所含蜡样芽胞杆菌数。例如：将0.1m1的104 样品稀释液涂布于MYP平板土，其可疑菌落为2 5个，取五个鉴定， 证实四个菌落为蜡样芽胞杆菌，则1g( ML ） 检样中所含蜡样芽 胞杆菌数为： 2 5 X 4 /5 X104 X10＝2X106
蜡样芽胞杆菌检验
生化鉴定
挑取纯培养的单个菌落，进行 酪蛋白分解试验（+）、动力试验 （大多+）、V-P试验（+）、硝酸盐 还原试验（+）、糖发酵试验（+）、 溶菌酶耐性试验（+）。
根状生长试验
挑取单个可疑菌落平行划线接种于 营养琼脂平板上，30 ℃±1 ℃培养 24 h±2 h 蕈状芽胞杆菌形成根状生长的特征 蜡样芽胞杆菌菌株形成粗糙的似毛 玻璃状或融蜡状的菌落
蜡样芽胞杆菌检验 标准操作程序
国巢湖国巢
背景
革兰氏阳性芽胞杆菌 在自然界广泛存在 可引起食物中毒等食源性疾病
背景
国际上，早在1906年就有由该菌引起的病例报道，目前全世界 每年都有相当数量的病例发生
在国内，首次报告是1973年南京某托儿所儿童因进食泡饭引起呕 吐型蜡样芽胞杆菌食物中毒，至今除西藏外，每个省、自治区、直辖 市已经都有报，有些地区甚至占细菌性食物中毒的首位
溶血试验
挑取纯培养的单个可疑菌落接种于 TSSB琼脂（胰酪胨大豆羊血琼脂） 平板上，30 ℃±1 ℃培养24 h±2 h。
溶血试验
蜡样芽胞杆菌菌落为浅灰色，不透明，似白色 毛玻璃状，有草绿色溶血环或完全溶血环 苏云金芽胞杆菌和蕈状芽胞杆菌呈现弱的溶血 现象 多数炭疽芽胞杆菌为不溶血 巨大芽胞杆菌为不溶血
使用前，如MYP琼脂平板表面有水珠，可放在25℃ ～ 50℃的培养 箱里干燥，直到平板表面的水珠消失
30 ℃±1 ℃培养24 h±2 h 同一稀释度3个平板所有菌落数合计 在15CFU～150CFU典型或可疑蜡样芽 胞杆菌菌落的平板，进行计数
从典型菌落中至少挑取5个（小于5 个全选），划线接种于营养琼脂平 板， 30 ℃±1 ℃培养24 h±2 h， 进行确证实验
蜡样芽胞杆菌的检验实验讲义-2011
蜡样芽胞杆菌的检验实验讲义前言蜡样芽孢杆菌为革兰氏阳性需氧芽胞杆菌，在自然界分布广泛。
在植物、许多生熟食品上均能分离到，例如乳制品、禽畜类制品、蔬菜、汤汁、淀粉类制品等。
污染食品后，在20℃～45℃，pH4.9～9.3条件下可以迅速繁殖并产生大量肠毒素。
该菌引起的食物中毒的食品感官性状均无明显变化，除食品有发粘、稍有异味无明显腐败变质现象，容易被人忽视。
当一次摄入食品中细菌数量达到100万／g（ml），即可发生食物中毒。
特性：①生物学性状，革兰氏阳性大杆菌，菌体两端较平整，多数呈链状排列。
芽胞呈椭圆形，多位于菌体中央或稍偏于一端，芽胞囊不突出菌体。
引起食物中毒的菌株多为周毛菌，有动力，不形成荚膜；②培养特性，需氧菌，最适生长温度28 ℃～35℃，最适pH7.0～7.4，营养要求不高。
在普通培养基上生长的菌落较大，直径3mm～10mm，灰白色，不透明，表面粗糙成毛玻璃状或融蜡状，边缘不整齐，呈扩散状。
在血平板上形成浅灰色、不透明呈毛玻璃状的菌落，有草绿色溶血环或完全溶血环。
在甘露醇卵黄多粘菌素（MYP）培养基菌落为粉红色（不发酵甘露醇），周围有粉红色的晕（产生卵磷脂酶）。
在普通肉汤中呈混浊生长，常形成均膜或壁环；③生化性状，卵磷脂酶、酪蛋白酶、过氧化氢酶、青霉素酶、明胶液化、硝酸盐还原试验均阳性。
溶血。
不发酵甘露醇、木糖、阿拉伯糖。
实验安排一、稀释菌悬液的制备：二、细菌接种：不发酵甘露醇，且产生卵磷脂酶的细菌。
（在MYP培养基上呈粉红色，周围有粉红色晕的菌落。
三、菌数测定：四、形态学观察：肉汤培基、营养琼脂培基、革兰氏染色、动力。
五、生化试验：酪蛋白酶、硝酸盐还原酶、明胶酶、过氧化氢酶阳性第一部分用灭菌生理盐水将检样作成10-1～10-5的稀释液。
取每个稀释度0.1ml接种在甘露醇卵黄多粘菌素（MYP）琼脂培养基上，用L形棒涂布于整个表面，置于32±1℃温箱培养12～20h。
一、稀释菌悬液的制备：1. 每组取5支高压灭菌的玻璃试管，用10ml吸管吸取9ml生理盐水分别加入5支试管之中。
蜡样芽孢杆菌活菌数含量的测定操作规程
蜡样芽孢杆菌活菌数含量的测定操作规程一、引言蜡样芽孢杆菌是一种常见的微生物，其活菌数含量的测定对于粮食、食品和医药行业具有重要意义。
本文档旨在提供一份蜡样芽孢杆菌活菌数含量的测定操作规程，以确保测定结果准确可靠。
二、仪器与试剂- 无菌培养基- 自动培养箱- 显微镜- 十倍镜- 干燥烘箱- 无菌分注器- 离心机- 紫外灯三、操作步骤1. 准备工作- 清洗并消毒所有使用过的实验器材。
- 配制无菌培养基，确保培养基的质量符合要求。
2. 样品处理- 将待测样品加入适量的无菌水中，并通过搅拌均匀。
- 取适量的处理后的样品，通过无菌分注器加入无菌培养基中。
3. 培养- 将含有待测样品的无菌培养基均匀涂布于一片无菌培养基平板上。
- 将平板放入自动培养箱中，设置适当的温度和培养时间进行培养。
4. 菌落计数- 取出培养完毕的平板，使用显微镜和十倍镜对菌落进行观察和计数。
- 记录菌落数，得到待测样品中蜡样芽孢杆菌的菌落形成单位（CFU）。
5. 活菌数计算- 将菌落计数结果乘以相应的稀释倍数，得到待测样品中蜡样芽孢杆菌的活菌数含量。
6. 结果确认- 将结果与标准值进行比较，确保测定结果准确可靠。
四、风险提示- 操作过程需保持无菌操作，避免污染。
- 使用紫外灯时需注意安全，避免直接照射眼睛和皮肤。
五、总结蜡样芽孢杆菌活菌数含量的测定操作规程是确保测定结果准确可靠的重要工作。
按照本文档的要求进行操作，能够有效地保证测定的准确性，并为粮食、食品和医药行业的安全生产提供科学依据。
蜡样芽孢杆菌检测标准
蜡样芽孢杆菌检测标准蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）是一种常见的细菌，广泛存在于土壤、水、空气和食品中。
它是一种厌氧菌，在适宜的条件下能够迅速生长繁殖，因此对其检测标准十分重要。
蜡样芽孢杆菌的存在会对食品安全造成威胁，因为它可以产生多种毒素，其中包括引起食物中毒的致病毒素。
因此，对食品中蜡样芽孢杆菌的检测标准必须严格执行，以保障食品安全。
首先，蜡样芽孢杆菌的检测应该基于科学的方法和标准。
目前，国际上对蜡样芽孢杆菌的检测标准主要包括ISO标准和FDA标准。
ISO标准主要适用于食品和饮用水等领域，而FDA标准则更多地用于医药和化妆品等领域。
在执行检测时，应当严格按照相关标准进行操作，以确保检测结果的准确性和可靠性。
其次，蜡样芽孢杆菌的检测应该注重样品的采集和保存。
在采集样品时，应当避免外界污染，并选择适当的容器进行保存，以防止细菌的生长和繁殖。
同时，在运输和保存过程中，应当注意避免温度和湿度的变化，以确保样品的完整性和稳定性。
另外，蜡样芽孢杆菌的检测还应该关注检测方法的选择和操作流程。
目前常用的检测方法包括培养法、PCR法和免疫学方法等。
在选择检测方法时，应当根据具体的检测对象和要求进行合理的选择，并严格按照操作流程进行操作，以确保检测结果的准确性和可靠性。
除此之外，蜡样芽孢杆菌的检测还应该关注检测结果的解读和评估。
在获得检测结果后，应当根据相关标准和法规进行结果的解读和评估，以确定是否符合安全标准。
同时，还应当对检测过程中出现的异常情况进行分析和处理，以确保检测结果的真实性和可靠性。
总的来说，蜡样芽孢杆菌的检测标准对于保障食品安全至关重要。
在执行检测时，应当严格按照科学的方法和标准进行操作，注重样品的采集和保存，选择合适的检测方法并严格执行操作流程，最终对检测结果进行准确的解读和评估。
只有这样，才能有效地预防和控制蜡样芽孢杆菌对食品安全造成的威胁。
实验三、蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)的检验
4．证实试验
（1）形态观察
本菌应为G＋杆菌，宽度在1μm或1μm以上，芽孢呈卵圆形， 不突出菌体，多位于菌体中央或稍偏于一端。
革兰氏染色法一般包括初染、媒染、脱色、复染等四个步骤，具体操 作方法是： 1）涂片固定。 2）草酸铵结晶紫染1分钟。 3）自来水冲洗。 4）加碘液覆盖涂面染约1分钟。 5）水洗，用吸水纸吸去水分。 6）加95%酒精数滴，并轻轻摇动进行脱色，20秒后水洗，吸去水分。 7）蕃红染色液（稀）染2分钟后，自来水冲洗
（2）培养特性 本菌在肉汤中生长混浊，常有菌膜或壁环， 振摇易乳化。琼脂平板上形成的菌落不透明， 表面粗糙，似毛玻璃状或融蜡状且边缘不齐。
（3）生化特性
本菌有动力；产生卵磷脂酶和酪蛋白酶；过氧 化氢酶试验阳性；溶血；不发酵甘露醇和木糖； 能液化明胶和还原硝酸盐；在厌氧条件下能发酵
葡萄糖。
A、 MYP平板实验
选择性培养基（分离培养） MYP 36 ℃ ±1℃ 12h~20h 营养琼脂培养基 染色镜检 生化试验 菌株保存
报
告
2．菌数测定
以无菌操作将检样25g或25 mL，用灭菌生理盐水或磷酸盐缓冲液
做成10-1～10-5的稀释液。取各稀释液0.1mL，接种在两个选择培养基
（甘露醇卵黄多黏菌素琼脂）平板上，用L形棒涂布于整个表面，置 37℃培养12～20h后，选取菌落数在30个左右者进行计数。蜡样芽孢
还原） 不变为阳性（亚硝酸盐
已分解成氨和氮气）
D、木糖-明胶（Gelatin）液化试验
结果观察与记录：
明胶液化，为阳性，+。 明胶凝固，为阴性，-。
E、L-酪氨酸分解试验
接种于L-酪氨酸琼脂培养基上，35℃培养48 h,阳性反应菌落周围培养基应出现澄清透明 区（表示产生酪蛋白酶）。阴性时应继续培 养72 h再观察。
蜡样芽孢杆菌的检测.ppt
实验结果
3 计数（表面涂布法）
1克样品中含的蜡样芽孢杆菌数： 证实阳性菌落数 挑取的菌落数
MYP平板上的菌落数×
× 稀释倍数× 10
举例：将检样10-4稀释液0.1mL涂布于MYP琼脂平板 上，生成的可疑菌落数为25个，取5个进行鉴定， 证实为蜡样芽胞杆菌的是4个，则1g样品中含的蜡 样芽孢杆菌数为（25×4/5）×104×1/0.1
检验程序
检样 50g(mL)+450mL无菌磷酸盐缓冲稀释液
10-1~10-6稀释液 选择性培养基 MYP
30°C , 24h
形态观察 菌数测定 营养琼脂 30°C , 24h 证实试验
革兰染色 生长及菌落观察 鉴别试验
生化反应
肠毒素测定
报告
实验步骤
1
样品的保存和送检 待检样品应保持在6℃以下运送并尽可能不使其冷冻。 对可疑是该菌引起的食物中毒的病人，应取可疑食 物或病患者的呕吐物、粪便，且立刻在3小时内送检。 送达实验室后，应保存于4℃并尽快检验。
4 证实试验
预 实 验 营 养 琼 脂 培 养 基
菌落形态观察
革兰染色
镜检观察菌体
生 化 实 验
卵磷脂酶实验 L-酪氨酸分解实验
触酶实验 溶血实验
双氧水
MYP琼脂平 板 L-酪氨酸琼脂培养基
鉴 别 试 验
胰酪胨大豆羊血琼脂平板
动力与硝酸盐还原实验
动力-硝酸盐生化鉴定管
1 形态观察 本菌革兰染色阳性，呈短链或长链，芽孢位于菌体 中央或偏端，不是菌体胀大。
2、了解蜡样芽孢杆菌菌落特点和掌握生化反 应结果的判断方法。
实验原理：蜡样芽胞杆菌具有以下生化特性：
不发酵甘露醇：在甘露醇-卵黄-多粘菌素 （MYP）琼脂平板上生成微粉红色菌落。 产生卵磷脂酶：分解MYP琼脂中的卵磷脂， 在菌落周围产生粉红色混浊环（沉淀环）。
致病菌检验 蜡样芽孢杆菌
分离培养：从MYP平板上挑可疑菌落到营养琼脂上进行纯培养。 证实试验： （1）形态观察 （2）培养特性 （3）生化性状及生化分型 ①生化性状
本菌有动力；能产生卵磷脂酶和酪蛋白酶；过氧化氢酶试验阳性； 溶血；不发酵甘露醇和木糖；常能液化明胶和使硝酸盐还原；在厌氧条 件下能发酵葡萄糖。 ②生化分型
根据蜡样芽孢杆菌对柠檬酸盐利用、硝酸盐还原、淀粉水解、 V-P 反应、明胶液化性状的试验，分成不同的型别。
蜡样芽孢杆菌数=可疑菌落数×证实为阳性菌落数的比例×稀释倍数×10
?MYP培养基中含有卵黄、甘露醇、多 粘菌素和pH指示剂酚红等。多粘菌素 可抑制杂菌的生长。 ?蜡样芽孢杆菌不发酵甘露醇，菌落为 粉红色（否则为黄色）。 ?该菌产生卵磷脂酶，由于脂肪和卵磷 脂被分解，在菌落周围产生粉红色的晕。
分离培养和证实试验:
3、检验程序
检样 25 g（mL）加225 mL生理盐水
包括四个步骤： ①菌数测定:涂布甘露醇卵黄多粘 菌素（MYP） 平板计数。
做成10-1~10-5的稀释液 37℃，18 h ~ 24 h
②分离培养:从MYP 上 挑可疑菌 落进行纯培养。
选择性培养基 （菌数测定）
MYP
③证实实验:包括形态观察、培养 36℃±1℃ 12 h ~ 20 h 特性、生化性状和生化分型试验。
V-P 反应
＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ － － － － － － －
蜡样芽胞杆菌检验(食品微生物学检验)
食品安全国家标准食品微生物学检验蜡样芽胞杆菌检验1 范围本标准规定了食品中蜡样芽胞杆菌（Bacillus cereus）的检验方法。
本标准第一法适用于蜡样芽胞杆菌含量较高的食品中蜡样芽胞杆菌的计数；第二法适用于蜡样芽胞杆菌含量较低的食品样品中蜡样芽胞杆菌的计数。
2 设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：a)冰箱：2 ℃～5 ℃；b)恒温培养箱：30 ℃±1 ℃、36 ℃±1 ℃；c)均质器；d)电子天平：感量0.1 g ；e)无菌锥形瓶：100 mL、500 mL；f)无菌吸管：1 mL（具0.01 mL刻度）、10 mL（具0.1 mL刻度）或微量移液器及吸头；g)无菌平皿：直径90 mm；h)无菌试管：18 mm×180 mm；i)显微镜：10倍～100倍（油镜）；j)L涂布棒。
3 培养基和试剂3.1磷酸盐缓冲液（PBS）：见附录A中A.1。
3.2 甘露醇卵黄多黏菌素（MYP）琼脂：见附录A中A.2。
3.3 胰酪胨大豆多黏菌素肉汤：见附录A中A.3。
3.4营养琼脂：见附录A中A.4。
3.5 过氧化氢溶液：见附录A中A.5。
3.6 动力培养基：见附录A中A.6。
3.7 硝酸盐肉汤：见附录A中A.7。
3.8 酪蛋白琼脂：见附录A中A.8。
3.9 硫酸锰营养琼脂培养基：见附录A中A.9。
3.100.5%碱性复红：见附录A中A.10。
3.11 动力培养基：见附录A中A.11。
3.12 糖发酵管：见附录A中A.12。
3.13 V-P培养基：见附录A中A.13。
3.14 胰酪胨大豆羊血（TSSB）琼脂：见附录A中A.14。
3.15 溶菌酶营养肉汤：见附录A中A.15。
3.16西蒙氏柠檬酸盐培养基：见附录A中A.16。
3.17明胶培养基：见附录A中A.17。
4 蜡样芽胞杆菌平板计数法（第一法）4.1检验程序蜡样芽胞杆菌平板计数法检验程序见图1。
图1 蜡样芽胞杆菌平板计数法检验程序4.2 操作步骤4.2.1 样品处理冷冻样品应在45 ℃以下不超过15 min或在2 ℃～5 ℃不超过18 h解冻，若不能及时检验，应放于-10 ℃ ~ -20 ℃保存；非冷冻而易腐的样品应尽可能及时检验，若不能及时检验，应置于2 ℃～5 ℃冰箱保存，24 h内检验。
蜡样芽孢杆菌的检测
产生明胶酶：将明胶水解为多肽再水解为氨 基酸而使其由半固体转化为液态状。
触酶实验: 产生过氧化氢酶分解过氧化氢生 成水和氧气。
动力和硝酸盐试验: 蜡样芽胞杆菌运动活泼, 能还原硝酸盐为亚硝酸盐。
实验材料
•甘露醇-卵黄-多粘菌素（MYP）琼脂平板 •营养琼脂培养基 •L-酪氨酸营养琼脂培养基 •胰酪胨大豆羊血琼脂(TSSB) •动力-硝酸盐生化鉴定管 •木糖-明胶生化鉴定管 •硝酸盐试剂(1%对氨基苯磺酸溶液, 0.2% α-萘胺溶 液) •3%的双氧水 •革兰染液
THE END！
4 证实试验
预
菌落形态观察
实 验
革兰染色
镜检观察菌体
营
养
生
琼
化
脂
实
卵磷脂酶实验 L-酪氨酸分解实验
MYP琼脂平
板 L-酪氨酸琼脂培养基
培
验
养
触酶实验
双氧水
基 鉴
溶血实验
胰酪胨大豆羊血琼脂平板
别
动力与硝酸盐还原实验
试
验
动力-硝酸盐生化鉴定管
1 形态观察
本菌革兰染色阳性，呈短链或长链，芽孢位于菌体 中央或偏端，不是菌体胀大。
检验程序
检样 50g(mL)+450mL无菌磷酸盐缓冲稀释液
10-1~10-6稀释液
选择性培养基 MYP 30°C , 24h
形态观察 菌数测定
证实试验
营养琼脂 30°C , 24h
革兰染色 生长及菌落观察 鉴别试验 生化反应 肠毒素测定
报告
实验步骤
1 样品的保存和送检 待检样品应保持在6℃以下运送并尽可能不使其冷冻。 对可疑是该菌引起的食物中毒的病人，应取可疑食 物或病患者的呕吐物、粪便，且立刻在3小时内送检。 送达实验室后，应保存于4℃并尽快检验。
蜡样芽孢杆菌国标检测方法
蜡样芽孢杆菌国标检测方法蜡样芽孢杆菌是一种常见的致病菌，可以引发许多疾病，比如肺炎、食物中毒等。
因此，对于蜡样芽孢杆菌的检测方法非常重要。
目前，我国规定的蜡样芽孢杆菌国标检测方法共包括以下几个步骤：首先，样品前处理。
在此步骤中，需要将待检样品样品进行预处理，确保样品中的蜡样芽孢杆菌含量达到检测标准。
一般而言，对于不同类型的样品，处理方法也会有所不同。
比如在食品及饲料中检测，可以添加适当数量的生长因子，利于蜡样芽孢杆菌的生长和繁殖；在水及废水中检测，需要进行过滤、浓缩等步骤，以提高样品中菌落的数量。
其次，培养。
在此步骤中，待检样品需要在适当的培养基上进行培养，并采用适宜的培养条件和温度，使蜡样芽孢杆菌营养生长，并清晰地表现出其形态特征。
比如在肉汤杨氏平板上进行培养，在37℃下进行孵育，并对培养基的pH值和氧气浓度进行控制，以确保蜡样芽孢杆菌可以正常生长。
第三，菌落特征的观察。
在此步骤中，需要对培养出的蜡样芽孢杆菌菌落的特征进行观察。
一般而言，蜡样芽孢杆菌的菌落呈灰白色，中心较高，表面光滑细腻，菌体呈杆状，染色后呈青紫色，有时并可呈蓝绿色。
最后，进行鉴定和计数。
在此步骤中，需要对菌落进行进一步的鉴定和计数。
一般而言，可以采用荧光抗体技术、PCR扩增等方法进行检测，以确保检测结果的准确性和可靠性。
以上就是针对蜡样芽孢杆菌国标检测方法的详细介绍。
对于我们日常生活中经常遇到的食品、水源等，如果能够采用这些方法进行检测，那么对于保障我们的健康会起到非常重要的作用。
同时，也提醒大家在生活中注意卫生，遵守食品安全规定，以免受到蜡样芽孢杆菌等致病菌的侵害。
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（4）与类似菌鉴别 • 本菌与其他类似菌的鉴别见表2。
呕吐型中毒：多见于过剩米饭和油炒饭，由耐热性 肠毒素为致病因素；潜伏期短，一般为2～3小时，最短 为30分钟，最长5～6小时；症状以呕吐，腹痉挛为主， 腹泻则少见，一般经过8～10小时而治愈。
腹泻型中毒：由各种食品中不耐热肠毒素引起，潜 伏期在6小时以上，一般为6～14小时；症状以腹泻，腹 痉挛，而呕吐却不常见；病程24～36小时。
形态观察 染色镜检
证实试验
培养特性
生化特性 生化分型
报告
2．菌数测定 • 以无菌操作将检样25g或25 ml按菌落总数测定方式，用 灭菌生理盐水或磷酸盐缓冲液做成10-1～10-5的稀释液。 取各稀释液0.1ml，接种在选择培养基（甘露醇卵黄多 黏菌素琼脂）平板上，用L形棒涂布于整个表面，臵 37℃培养12～20h后，选取菌落数在30个左右者进行计 数。蜡样芽孢杆菌在此培养基上生成的菌落为红色（表 示不发酵甘露醇）,环绕有白色至淡粉红色的晕（表示 产生卵磷脂酶）。
上的菌落为粉红色(表示不发 酵甘露醇)，周围有粉红色的 晕（表示产生卵磷脂酶）。
（5）在普通肉汤内生长迅速，肉汤混浊，常常有菌膜或壁 环，振摇易乳化。
3、生化性状：
（1）葡萄糖发酵试验：接种于酚红葡萄糖肉汤中， 厌氧条件下35℃培养24h。培养基应由红色变 为黄色。（表明本菌在厌氧条件下分解葡萄糖产酸） （2）硝酸盐还原试验：阳性（红色）。 （3） V-P试验：接种于改良V-P培养基中，35℃ 培养48 h。加V-P试剂及肌酸数粒，静止 1h，应为阳性反应（伊红色）。
化氢酶试验阳性；溶血；不发酵甘露醇和木糖；
能液化明胶和还原硝酸盐；在厌氧条件下能发酵 葡萄糖。
四、实验结果
根据以上实验作出检验报告。
五、思考题
1．如何区分蜡样芽孢杆菌和苏云金芽孢 杆菌？ 2．设计蜡样芽孢杆菌计数程序？
4．证实试验
（1）形态观察 本菌应为G＋杆菌，宽度在1μm或1μm以上， 芽孢呈卵圆形，不突出菌体，多位于菌体中 央或稍偏于一端。 （2）培养特性 本菌在肉汤中生长混浊，常有菌膜或壁环， 振摇易乳化。琼脂平板上形成的菌落不透明， 表面粗糙，似毛玻璃状或融蜡状且边缘不齐。
（3）生化特性
本菌有动力；产生卵磷脂酶和酪蛋白酶；过氧
碱不敏感，pH6-11对本菌基本上不受影响，pH5以
下，生长可受到抑制。
（二）流行病学特点
1、季节性特点： 以夏、秋季，尤其是6～10月为多见。 2、食品种类 －剩饭，特别是大米饭。 －乳及乳制品、畜禽肉类制品、蔬菜、莱汤、马铃薯、 豆芽、甜点心、调味汁、色拉。 国内：与淀粉质食品相关多。
3、临床症状
• 计数后，从中挑取5个这样的菌落作证实试验。根 据试验证实为蜡样芽孢杆菌的菌落数，计算出该 培养皿内的蜡样芽孢杆菌数，然后乘其稀释倍数 即得每克或每毫升样品所含的蜡样芽孢杆菌数。
选取具有15-150个典型或可疑蜡样芽孢杆菌菌落的平板 ,进行计数。计算同一稀释度两个平板的平均菌落数。
计数后，从中挑取5个此种菌落做证实试验，根据证实 的蜡样芽孢杆菌的菌落数，计算出该平板上的菌落数，然 后乘其稀释倍数，即得每克（毫升）样品中所含蜡样芽胞 杆菌数。
（4）L-酪氨酸分解试验：接种于L-酪氨酸琼脂培
养基上，35℃培养48 h,阳性反应菌落周围培
养基应出现澄清透明区（表示产生酪蛋白
酶）。阴性时应继续培养72 h再观察。 （5）溶菌酶试验：用直径2mm接种环取纯菌悬液
一环,接种于溶菌酶肉汤中，35℃培养24h。 该菌在本培养基（含0.001％的溶菌酶）中能 生长。如出现阴性反应,应继续培养24 h。
三、实验方法与步骤
1．蜡样芽孢杆菌检验程序
2．菌数测定
以无菌操作将检样25g或25 ml按菌落总数测定方式，用灭菌生理盐水 或磷酸盐缓冲液做成10-1～10-5的稀释液。取各稀释液0.1ml，接种在
选择培养基（甘露醇卵黄多黏菌素琼脂）平板上，用L形棒涂布于整个
表面，置37℃培养12～20h后，选取菌落数在30个左右者进行计数。 蜡样芽孢杆菌在此培养基上生成的菌落为红色（表示不发酵甘露醇）,
4、致病性
蜡样芽胞杆菌引起食物中毒，除必须具有大量的细菌 外，肠毒素也是重要的致病因素。
耐热性肠毒素：100℃30分钟不能被破坏，为引起呕吐 型中毒的致病因素,常在米饭中形成。 不耐热肠毒素：是引起腹泻型胃肠炎的病因，能在各种 食物中形成。
5、抵抗力
蜡样芽胞杆菌100 ℃ 20分钟即可被杀死；对酸
环绕有白色至淡粉红色的晕（表示产生卵磷脂酶）。计数后，从中挑
取5个这样的菌落作证实试验。根据试验证实为蜡样芽孢杆菌的菌落数， 计算出该培养皿内的蜡样芽孢杆菌数，然后乘其稀释倍数即得每克或 每毫升样品所含的蜡样芽孢杆菌数。
3．分离培养
将检样或其稀释液划线于上述选择性培 养基平板上，置37℃培养12～20h，挑取 可疑蜡样芽孢杆菌的菌落接种于肉汤和营 养琼脂培养基上做纯培养，然后做证实试 验。
例如将0.1mL 10-4样品稀释液涂布于MYP平板上，其可疑 菌落为25个，取5个鉴定，证实四个菌落为蜡样芽孢杆菌， 则1g（mL）检样中所含蜡样芽孢杆菌数为：
25×4/5×104×10＝2×106
3．分离培养 • 将检样或其稀释液划线于上述选择性培养基平板上， 臵37℃培养12～20h，挑取可疑蜡样芽孢杆菌的菌 落接种于肉汤和营养琼脂培养基上做纯培养，然后 做证实试验。
蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)的检验
（一）蜡样芽胞杆菌生物学性状
1、形态和染色特性 该菌为革兰氏阳性的大杆菌，菌体两端较平整，芽
胞呈椭圆形，位于菌体中央稍偏一端,多呈链状排列,
无荚膜，有周鞭毛。
2、培养特性
（1）需氧菌，生长温度范围在10-45℃之间。最适 生长温度为28-35℃。
选择性培养基（分离培养） MYP 36 ℃ ±1℃ 12h~20h 营养琼脂培养基 染色镜检 生化试验 菌株保存
报
告
10-1~10-5的 稀释液的制备
每个稀释度 36±1℃ 菌落计数 0.1mL接种于2个 12~20h MYP培养基
36±1℃ 12~20h
挑取菌落接种肉汤和营养琼脂培养基（分离培养）
4．证实试验 （1）形态观察 • 本菌应为G＋杆菌，宽度在1μm或1μm以上，芽孢呈卵 圆形，不突出菌体，多位于菌体中央或稍偏于一端。 （2）培养特性 • 本菌在肉汤中生长混浊，常有菌膜或壁环，振摇易乳化。 琼脂平板上形成的菌落不透明，表面粗糙，似毛玻璃状 或融蜡状且边缘不齐。
（3）生化特性
• 本菌有动力；产生卵磷脂酶和酪蛋白酶；过氧化 氢酶试验阳性；溶血；不发酵甘露醇和木糖；能 液化明胶和还原硝酸盐；在厌氧条件下能发酵葡 萄糖。
（三）检测方法
检样 25g(ml)+225ml生理盐水
1.蜡样芽孢杆菌检验程序：
做成10-1-10-5的稀释液 37℃，18h-24h 选择性培养基（菌数测定） MYP 36 ℃ ±1℃ 12h~20h 菌数计算 生长及菌落观察
中华人民共和国国家 标准食品卫生微生物 学检验蜡样芽孢杆菌 检验GB/T 4789.282003
5.结果报告
• 报告1g（mL）检样中所含蜡样芽孢杆菌数量[个 /g(mL)]。
实验三、食品中蜡样芽孢杆菌的检验
一、实验目的
1．学习蜡样芽孢杆菌检验的原理和方法。
2．了解蜡样芽孢杆菌形态特征、培养特
性和生化特性。
二、实验原理
蜡样芽孢杆菌为需氧、能产生芽孢的革兰 氏阳性杆菌，在自然界分布较广，食品在正 常情况下就可能有此菌存在，因而易从各种 食品中检出。蜡样芽孢杆菌能发酵麦芽糖、 蔗糖和水杨苷，不发酵乳糖、甘露醇、木糖、 阿拉伯糖、山梨醇和侧金盏花醇,卵磷脂酶和 酪蛋白酶，过氧化氢酶试验阳性，溶血，能 在24h 内液化明胶和还原硝酸盐，在厌氧条 件下能发酵葡萄糖。
(4)生化分型 • 根据蜡样芽孢杆菌对柠檬酸盐利用、硝酸盐 还原、淀粉水解、V-P反应、明胶液化的试 验，分成不同型别，见表1。
表1
型 别
蜡样芽孢杆菌生化分型
生 化 试 验 V-P反应 明胶液化
柠檬酸盐利用
硝酸盐还原 淀粉水解
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
（2）在普通培养基上生长良好。
本菌在普通琼脂平板上，生长
的菌落呈乳白色，不透明，直
径4-6mm,边缘不整齐，表面粗 糙，呈毛玻璃状或白蜡状。
（3）在血液琼脂平板上形成 浅灰色、不透明、似毛玻璃 状的菌落。菌落周围初呈草 绿色溶血,时间稍长即完全透
明。
（4）蜡状芽胞杆菌在甘露醇
卵黄多粘菌素琼脂(MYP)