实时荧光定量pcr原理及应用
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实时荧光定量PCR原理及应用
张达威 上海吉泰生物科技有限公司
主要内容
• 荧光定量PCR原理 • 荧光定量PCR方法与应用
荧光定量PCR定义
在PCR反应体系中，加入荧光集团， 利用荧光信号的累积对PCR反应过程 实时监控，最终对初始模板进行定量。
传统PCR定量与实时定量PCR
➢ 传统的PCR定量是一种终点法的检测： 动态范围受限 检测重现性极差
应用之一：病原体检测与定量
1
2
3
4
应用之一：病原体检测与定量
应用之二：基因表达差异分析
相对定量：基因表达量上升或者表达被抑止的 倍数 •两种样品：Calibrator（对照，如正常组织） 与Sample（待测样品） •两个基因：目的基因与看家基因
应用之二：基因表达差异分析
Calibrator
Acceptordye (Quencher)
unbound probe free in solution
Light Taq
energy transfer
Light emission
Light
Light emission
Taq
Taqman探针：是与目的序列互补的
寡聚核苷酸，5‘端标记荧光报告集团， 3’端标记荧光淬灭集团，探针完整时 不发出荧光，水解后发出荧光。
C(t)值与阈值
[DNA]
Ct Ct
Ct Cycle
阈值threshold 检测极限
荧光定量PCR原理
• 起始模板浓度的对数 与C(t)值成反比
如何定量
① 绘制标准曲线 ② 所测样本C(t)值 ③ 定量
标准曲线
通过已知起始拷贝数的标准品作出的标准曲线，根据样品的Ct值，依据 Log起
， 始拷贝量与Ct的线性关系 就可以计算出样品中所含的模板量
传统PCR与实时定量PCR
终点检测
重复性好 精确度高
Ct
误差小
阈值与CT值
• 阈值threshold ：在荧光信号指数扩增阶段， 在扩增曲线任意位置上人为设定的一个值， 一般我们将荧光阈值的缺省设置是 3-15 个 循环的荧光信号的标准偏差的10 倍。
• CT=cycle threshold即阈值循环数：荧光信 号达到阈值设定值时PCR所经历的循环数。
➢ 不能区分引物二聚体，单链二级结构，非特异
性产物 ➢需要做熔解曲线分析产物的单一性
SYBR green 是一个很好的初级化学试剂，价格上存在优势， 在试验验证和问题分析上非常有用。
熔解曲线分析
单一峰，无非 特异性产物， 定量准确
有杂峰，有非 特异性产物， 定量不准确
Taqman探针法
Reporterdye
应用之二：基因表达差异分析
1
2
3
4
应用之二：基因表达差异分析
应用之三：SNP分析
两条探针分别针对不同等位基因
G T
A
A
T G
C
C
应用之三：SNP分析
FAM TET
1
FAM TET
2
应用之三：SNP分析
1
2
Thank you！
选择吉泰，选择成功！
本文观看结束！！！
谢谢 欣 赏！
荧光定量PCR方法
➢荧光染料法 ➢荧光探针法
染料和探针
DNA binding SYBR Green I™
TaqMan®
Probe based detection
Molecular Beacons
Taq
Taq
SYBR Green法作用机理
SYBR Green:
➢最大吸收波长约为 497nm ，发射波长最大约 为 520nm ➢染料只与双链DNA小沟结合，单链不结合 ➢游离时荧光信号非常低，结合后荧光信号强度 增强1000倍
➢ 实时定量PCR依靠荧光信号的扩增进行检测： 灵敏度高 重复性 好 动态范围宽 高通量
Gel-based quantification
11,500 counts / 5200 counts = 2.2 fold difference
Real-time quantification
Ct 18 and Ct 22, 2^(4 Ct shift) = 16 fold difference
Gene of Interest Ct
目的基因
Sample Ct
Ct1
Normalizer
Ct
Ct
Ct2
看家基因
应用之二：基因表达差异分析
/ Ct1
基因表达差异＝2
2 Ct2
＝2 Ct1 - Ct2
应用之二：基因表达差异分析
RNA抽提
定量PCRቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
RT
cDNA产物
系列稀释
两个基因的扩增效率
HIV-1 (HEX)
RNA Virus 74bp amplicon
HBV (CY5)
DNA virus 81bp amplicon
实时定量PCR应用
➢绝对定量 ➢相对定量 ➢SNP分析
应用之一：病原体检测与定量
绝对定量（检测起始模板数的精确拷贝数－病原 体的多少）
• 标准品（如质粒）：做系列梯度稀释 • 待测样本 • 阴性对照（NTC）
特点： ➢ 特异性高：只有引物和探针都和
同一模板结合时才能检测 ➢完全实时监测：一分子荧光信号对 应一条DNA链的产生 ➢多通道检测：可以在一次反应中同 时检测多个不同目的基因序列
Taqman 三通道实验
Daniel Candotti - Cambridge, UK
HCV (FAM)
RNA virus 65bp amplicon
张达威 上海吉泰生物科技有限公司
主要内容
• 荧光定量PCR原理 • 荧光定量PCR方法与应用
荧光定量PCR定义
在PCR反应体系中，加入荧光集团， 利用荧光信号的累积对PCR反应过程 实时监控，最终对初始模板进行定量。
传统PCR定量与实时定量PCR
➢ 传统的PCR定量是一种终点法的检测： 动态范围受限 检测重现性极差
应用之一：病原体检测与定量
1
2
3
4
应用之一：病原体检测与定量
应用之二：基因表达差异分析
相对定量：基因表达量上升或者表达被抑止的 倍数 •两种样品：Calibrator（对照，如正常组织） 与Sample（待测样品） •两个基因：目的基因与看家基因
应用之二：基因表达差异分析
Calibrator
Acceptordye (Quencher)
unbound probe free in solution
Light Taq
energy transfer
Light emission
Light
Light emission
Taq
Taqman探针：是与目的序列互补的
寡聚核苷酸，5‘端标记荧光报告集团， 3’端标记荧光淬灭集团，探针完整时 不发出荧光，水解后发出荧光。
C(t)值与阈值
[DNA]
Ct Ct
Ct Cycle
阈值threshold 检测极限
荧光定量PCR原理
• 起始模板浓度的对数 与C(t)值成反比
如何定量
① 绘制标准曲线 ② 所测样本C(t)值 ③ 定量
标准曲线
通过已知起始拷贝数的标准品作出的标准曲线，根据样品的Ct值，依据 Log起
， 始拷贝量与Ct的线性关系 就可以计算出样品中所含的模板量
传统PCR与实时定量PCR
终点检测
重复性好 精确度高
Ct
误差小
阈值与CT值
• 阈值threshold ：在荧光信号指数扩增阶段， 在扩增曲线任意位置上人为设定的一个值， 一般我们将荧光阈值的缺省设置是 3-15 个 循环的荧光信号的标准偏差的10 倍。
• CT=cycle threshold即阈值循环数：荧光信 号达到阈值设定值时PCR所经历的循环数。
➢ 不能区分引物二聚体，单链二级结构，非特异
性产物 ➢需要做熔解曲线分析产物的单一性
SYBR green 是一个很好的初级化学试剂，价格上存在优势， 在试验验证和问题分析上非常有用。
熔解曲线分析
单一峰，无非 特异性产物， 定量准确
有杂峰，有非 特异性产物， 定量不准确
Taqman探针法
Reporterdye
应用之二：基因表达差异分析
1
2
3
4
应用之二：基因表达差异分析
应用之三：SNP分析
两条探针分别针对不同等位基因
G T
A
A
T G
C
C
应用之三：SNP分析
FAM TET
1
FAM TET
2
应用之三：SNP分析
1
2
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荧光定量PCR方法
➢荧光染料法 ➢荧光探针法
染料和探针
DNA binding SYBR Green I™
TaqMan®
Probe based detection
Molecular Beacons
Taq
Taq
SYBR Green法作用机理
SYBR Green:
➢最大吸收波长约为 497nm ，发射波长最大约 为 520nm ➢染料只与双链DNA小沟结合，单链不结合 ➢游离时荧光信号非常低，结合后荧光信号强度 增强1000倍
➢ 实时定量PCR依靠荧光信号的扩增进行检测： 灵敏度高 重复性 好 动态范围宽 高通量
Gel-based quantification
11,500 counts / 5200 counts = 2.2 fold difference
Real-time quantification
Ct 18 and Ct 22, 2^(4 Ct shift) = 16 fold difference
Gene of Interest Ct
目的基因
Sample Ct
Ct1
Normalizer
Ct
Ct
Ct2
看家基因
应用之二：基因表达差异分析
/ Ct1
基因表达差异＝2
2 Ct2
＝2 Ct1 - Ct2
应用之二：基因表达差异分析
RNA抽提
定量PCRቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
RT
cDNA产物
系列稀释
两个基因的扩增效率
HIV-1 (HEX)
RNA Virus 74bp amplicon
HBV (CY5)
DNA virus 81bp amplicon
实时定量PCR应用
➢绝对定量 ➢相对定量 ➢SNP分析
应用之一：病原体检测与定量
绝对定量（检测起始模板数的精确拷贝数－病原 体的多少）
• 标准品（如质粒）：做系列梯度稀释 • 待测样本 • 阴性对照（NTC）
特点： ➢ 特异性高：只有引物和探针都和
同一模板结合时才能检测 ➢完全实时监测：一分子荧光信号对 应一条DNA链的产生 ➢多通道检测：可以在一次反应中同 时检测多个不同目的基因序列
Taqman 三通道实验
Daniel Candotti - Cambridge, UK
HCV (FAM)
RNA virus 65bp amplicon