第05章 细胞培养与常用病毒学技术

细胞的传代：扩大培养用胰酶将长成致密单层的细胞(原 代细胞、二倍体细胞株、细胞系)从一个培养瓶消化下来，并 分装为2～3瓶，补充培养基后继续培养的过程。原代细胞的传 代过程常称之为继代。
3. 单细胞制备方法
机械分散法：用于原代细胞的制备，如鸡胚成纤维细胞。 用剪刀将鸡胚剪成1mm3小块，放入底部有一块微孔铜丝网的 10-20ml注射器内，将组织细胞挤过网孔，即可得到分散的细 胞或配合酶消化法。 胰酶消化法：用于消化细胞间的蛋白成分。视不同组织和 细胞，胰酶浓度和消化时间有所不同；一般为0.25%，在室温 或37℃下作用一段时间胰酶消化后，再用吸管进行吹打，使之 分散为单细胞。 螯合剂分散法：EDTA(乙二胺四乙酸二钠)可与钙镁离子结 合，从而使上皮细胞类细胞分散，单独使用时消化效果可能不 佳，与胰酶配制在一起，消化效果更佳。配制EDTA液时，需用 无钙镁缓冲液。
三、病毒的培养技术
病毒可用细胞、鸡胚和动物进行培养。
（一）用细胞培养病毒
细胞培养：cell culture. 用机械的方法(剪碎)或化学的 方法(胰酶)，使动物组织或传代细胞分散成单个细胞悬液后， 给以相应的营养和温度等条件，在体外进行培养。 包括原代培养、继代培养和细胞系（cell line）培养。
第05章 细胞培养与常用病毒学技术
本章主要内容： 1. 动物细胞培养技术 2. 病毒及其培养技术 3. 病毒效价（滴度）测定技术 4. 常用分子病毒学技术
第1节 动物细胞培养技术
一、几个概念
1.原代细胞：直接由组织制备的细胞培养物。未经建系，不能 无限传代，仅可传有限代次，一般5～8代。 2.传代细胞：能够无限传代繁殖的细胞群，不具有来源组织的 核型和贴壁细胞依赖性。 3.鸡胚：孵化至9～11天的健康或SPF鸡胚。 4.基础培养基（minimum essential medium, MEM）：能够满 足动物细胞生长发育的基本营养需要的培养基。
将原始细胞悬液稀释至5×105个细胞/ml后，装瓶培养。
9-10日 龄鸡胚
幼龄动 物组织
加培养基吹打分散 过滤、补足培养基
25ml培养瓶装3ml，100ml培养瓶装10ml， 平放于37℃温箱培养
37℃培养24～48h，鸡胚成纤维细胞可形成致密单层，但 细胞瓶中需装合适的细胞量。
2) 细胞的传代 1）取生长良好的细胞； 2）倒掉培养液； 3）用PBS洗细胞面1～2次（可略去！）；
病毒的装配效率甚低，常因核酸不能与衣壳有机地结合，
形成缺乏感染性的空壳病毒（假病毒）。同样，病毒成分在细 胞内装配成完整病毒粒子的详细分子机制尚不清楚。
由于细胞的生物合成被病毒阻断，细胞发生变性及死亡 （CPE），细胞自身的溶解就将病毒释放出来。某些不产生明 显细胞病变的病毒的释放方式，目前还不十分清楚。相反， 小RNA病毒合成速度极快，病毒粒子在胞浆内大量积聚，也许 在细胞死亡之前，就可胀破细胞，释放病毒。 有囊膜病毒的释放过程就是病毒核衣壳获得囊膜的过程。 反转录病毒、披膜病毒、副粘病毒等，由于在胞浆内复制及 装配，病毒在胞浆膜上获得囊膜。而疱疹病毒由于在胞核内 复制及装配，病毒在核膜上获得囊膜。
ATTACHMENT
病 毒 的 复 制 过 程
PENETRATION UNCOATING
HOST FUNCTIONS
Transcription Translation REPLICATION
VIRAL LIFE CYCLE
ASSEMBLY (MATURATION)
RELEASE
MULTIPLICATION
侵入与吸附是一个连续过程。不过，侵入是一个依靠能量
的过程。目前发现病毒侵入细胞有3种方式：①病毒直接转入
胞浆，如小RNA病毒；②细胞吞饮病毒，如多瘤病毒；③病毒
囊膜同细胞膜融合，如流感病毒。无囊膜病毒以前二种方式侵 入，有囊膜病毒常以第三种方式进入。
2.脱壳 病毒脱壳，包括脱囊膜和脱衣壳两个过程。有囊膜病毒 (除痘病毒外)的脱囊膜过程就是上述侵入的过程。无囊膜病毒 则只有脱衣壳的过程。 病毒核衣壳的脱落和核酸的逸出主要发生在细胞浆内。但 不同病毒脱壳发生的地点和过程不完全一样。如呼肠孤病毒，
2)细胞株（cell strain）
从原代培养细胞群中筛选出的具有特定性质或标志的细胞群。
地鼠肾细胞株 BHK21
非洲绿猴肾细胞 Vero细胞
3)细胞系(cell line) 从肿瘤组织培养建立的细胞群或培养过程中发生突变或转 化的细胞，在培养条件下可无限繁殖。
人结肠癌上皮细胞Caco-2细胞
人子宫颈癌细胞HeLa细胞系
病毒感染增殖的一般过程：
动物病毒的增殖过程大致可以分为：吸附与侵入、脱壳、 病毒成分的合成以及装配与释放等4个主要阶段。 1.吸附和侵入 病毒吸附分两步进行，即可逆的非特异性吸附和不可逆的 特异性吸附。首先，非特异性吸附即病毒与细胞以静电引力相 结合。这种吸附可发生在细胞表面任何部位且易被冲洗、高浓 度盐类和一定的pH环境所破坏，使病毒从吸附物上重新解脱出 来。 随后是病毒的特异性吸附，即病毒蛋白(抗受体)与细胞膜 上的受体特异性结合。这种吸附是不可逆的。病毒吸附细胞的
粒子。
4.装配和释放 新合成的病毒核酸和病毒蛋白在感染细胞内逐步成熟。所
谓成熟，是指核酸进一步被修饰，病毒蛋白亚单位以最佳物理
方式形成衣壳。
例如脊髓灰质炎病毒的RNA必须同一个基因蛋白(VPg)结合 后，才能成为病毒RNA。与此同时，衣壳蛋白VP0、VP1和VP3形 成5S的结构单位，再由60个5S形成80S的衣壳。病毒RNA进入衣 壳，就形成完整病毒粒子，这就是装配。
过程，可在几分钟到几十分钟的时间内完成。
细胞受体主要是胞膜上的糖蛋白。据估计，一个宿主细胞 上的特异性受体部位可达104～105个。但不一定每个细胞表面 都有特定病毒的特异受体。细胞有无特定病毒的受体，直接影 响是否对该病毒具有易感性。所以，病毒受体的研究是研究病 毒感染的分子机制的重要内容之一。
2.细胞的传代
移去细胞瓶中生长液，用PBS洗两次，用0.25%的胰酶消化 液分散细胞，视细胞消化程度确定消化时间，一般在2-5min。 待部分细胞出现脱落后，轻轻拍打细胞瓶，使细胞脱离瓶壁。 加入生长液，用吸管吹打数次使细胞彼此分开，传代于2-3个
与原培养瓶同样大小的培养瓶中，在37℃、5％CO2培养。
4. 某些RNA病毒(反转录病毒)的RNA经反转录合成互补DNA (cDNA)，与细胞基因组整合，并随细胞DNA的复制而增殖，这 就是所谓的DNA前病毒。 5. 病毒没有细胞壁，也不进行蛋白质、糖和脂类的代谢 活动，因此对抗生素具有明显的抵抗力。 6. 病毒基因组形式多样：dsDNA、ssDNA、dsRNA、 +ssRNA、-ssRNA等。既有线状，又有环状，还有分节段的。 细胞是组成动物、植物、微生物等生物体的基本单位，但 病毒与此不同，一个简单的病毒由蛋白质衣壳和核酸组成，复 杂一些的病毒仅在衣壳外面多一层囊膜，故病毒可被称为亚细 胞生物或分子生物。 病毒没有生长，也不以二等分裂方式繁殖，而是以某种方 式将基因组释放到细胞内，一方面以其为模板转录mRNA合成蛋 白，另一方面合成子代核酸，再组装为子代病毒粒子，最后释 放到细胞外，这一过程叫增殖。
因此，病毒具有生命活动型和生命静止型的双重存在形 式。与其他微生物不同，病毒有其自身的特性。
一、病毒的特征
1. 病毒一般只含有一种核酸——DNA或RNA，而其他微生 物，包括细菌、支原体、立克次氏体和衣原体，则都同时含有 两种核酸； 2. 病毒通过基因组复制和表达，产生子代病毒的核酸和 蛋白，随后装配成完整的病毒粒子；而在其他微生物，则是核 酸和许多其他组成成分一起参与生长、增殖过程，并常以二分 裂或类似的方式进行； 3. 病毒缺乏完整的酶系统，不具备其他生物“产能”所 需的遗传信息，因此必须利用宿主细胞的酶类和产能机构，并 借助宿主细胞的生物合成机构复制其核酸以及合成由其核酸编 码的蛋白，乃至直接利用细胞成分。可以这样认为，病毒的生 物合成实质上是病毒遗传信息控制下的细胞生物合成过程；
并不发生完全的脱壳。某些在细胞核内增殖的DNA病毒，例如
乳多空病毒、腺病毒和疱疹病毒，其核衣壳可能在未被完全脱 壳的情况下就进入细胞核内。口蹄疫病毒则可能就在细胞膜上
Байду номын сангаас
脱掉衣壳，病毒核酸直接进入细胞内。
脱壳必须有酶的参与，脱壳酶来自宿主细胞，有的为病毒 基因编码。迄今，病毒侵入细胞并脱壳的详细分子机制尚未完
二、病毒复制周期
复制：病毒的增殖：Replication、Multiplication。病毒
以其核酸侵入易感细胞内，在病毒核酸信号指挥下，利用宿主
细胞，按其自身为模板合成病毒的蛋白质、核酸及其它部件， 然后装配成新的病毒粒子，最后释放到细胞外，开始另一个感 染周期。 复制周期(Replication cycle)：即感染循环(infection cycle)。从病毒吸附于宿主细胞开始，到子代病毒从细胞释放 出来为止的全过程，称为病毒的复制周期。
应注意：冻存过程应缓慢，而复苏过程应迅速。
第2节 病毒及其培养技术
病毒：属于微生物界，是细胞内专性寄生的最小生命形 态--微生物，即在自然情况下，它只能在活的细胞内才能复 制和增殖。
细胞外的病毒，没有新陈代谢，不表现生命活性。但当
其进入宿主细胞后，病毒核酸迅即启动和复制，最后产生数
量增多的子代病毒；病毒具有遗传性和变异性。
细胞培养技术是研究病毒的分子感染机制、生物大分子装
配机制的重要手段，也是大量增殖病毒，制备细胞培养疫苗的 基础技术。
1.细胞培养的类型
体外培养的细胞有两种基本形态
成纤维样细胞
上皮样细胞
1)原代细胞
由新鲜的、分化程度较低的组织或胚胎，经剪碎并用胰 酶消化后制备的细胞。
鸡胚成纤维细胞 CEF：Chicken embryo fibroblast
3.换液与维持培养 待传代后的细胞生长至≥80%满度时(一般应≤24hrs)，将 生长液换掉，加入同样数量的维持液，继续培养。通常可维持
2～3天。待细胞长满并开始出现衰老死亡者时，重复传代、换
液的操作。
4.细胞冻存 待细胞长满后，也可将细胞保存起来。保存在-80℃或液 氮中。具体操作如下：用消化液将细胞分散后，加入含10% DMSO（二甲基亚砜）的FBS营养液，使细胞浓度达106-107/ml， 分装于细胞冻存管中，1ml/管。按照4℃、1hr，-20℃、4hrs、 -80℃过夜的顺序冻存，最后置液氮中长期保存。
8.接毒：将毒种按一定比例加入细胞培养物中，以进一步增
殖病毒的过程。方法分为单层接种和同步接毒。
二、细胞培养步骤
1.细胞的复苏 从液氮中取出冻存的细胞，迅速投入37℃水浴中，待完全
融化后，直接转入盛有5-10mL细胞生长液的60mm细胞培养瓶中，
在37℃、5％CO2培养，待细胞贴壁后，换生长液培养。
全研究清楚。
3.病毒成分的合成 病毒侵入细胞并脱壳后，在其遗传信息的控制下，一方面
病毒利用自身的特异性核酸聚合酶或反转录酶等进行病毒成分
的合成；另一方面利用细胞生物合成的场所和原材料合成病毒
的各种组成成份及其所需的酶类，包括病毒核酸转录或复制时
所需的聚合酶；最后是由新合成的病毒成分装配成完整的病毒
4. 细胞培养的方法
1)原代细胞的制备：鸡胚成纤维细胞。取9～11日龄鸡胚， 去头、四肢、内脏，PBS洗涤；置于小烧杯中，用剪刀剪碎
(1mm3)。用0.25%胰酶消化：37℃、30min，吸弃胰酶，在组
织块中加入培养液，用吸管轻轻吹打，使细胞分散，用纱布 过滤，计数细胞悬液中的细胞数。 细胞计数：白细胞计数板。在白细胞计数板上放上盖玻片 取少量细胞悬液进行适当稀释，取一滴滴入白细胞计数板，使 其渗入盖玻片下，计数五个大方格内的细胞总数： 细胞数/ml＝(五个大方格中的细胞总个数÷5)×10000× 稀释倍数
5.生长液：含10%FBS和1%双抗的DMEM培养液。
6.维持液：含2%FBS和1%双抗的DMEM培养液。 7.消化（分散）液：0.25%胰酶。配方入下： NaCl KCl Na2HPO4 · 2O 12H KH2PO4 EDTA 胰酶 水至 0.8g 0.2g 0.29g 0.02g 0.03g 0.25g 100mL