第二章预处理
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一、概述
细胞的破碎：
用一定方法（机械法、物理法、化学 法、酶法等）打开细胞壁或膜，使细胞的 内含物有效地释放出来。
第二章预处理
提取： 目的物从胞内转移到外界溶液中
（提取剂）
细胞 （提取剂）
破碎
匀浆
离心
wenku.baidu.com提取液（液体目的物）
沉淀 洗涤 提取物（固体目的物）
第二章预处理
机械法
破碎方法
非机械法
固体剪切力 液体剪切力 干燥处理 溶液作用
1）盐析 2）等电点沉淀 3）加热法 4）有机溶剂沉淀法 5）吸附法 6）其它沉淀法
第二章预处理
•有色物质的去除 常用脱色方法为吸附法
如活性炭吸附、树脂吸附等
第二章预处理
发酵液处理性能的改善
降低发酵液的黏度 加热法和加水稀释法
调节pH值 因pH直接影响发酵液中某些物质的
电离度和电荷性质，通过调节pH值可以 改善过滤特性。
第二章预处理
絮凝剂分类
习惯分为： 无机絮凝剂、有机絮凝剂
无机絮凝剂： 无机盐类絮凝剂(如硫酸铝、 硫酸亚铁、氯
化铝等)；无机高分子絮凝剂(如聚合氯化铝、 聚合铝铁等) 有机絮凝剂：
天然高分子 絮凝剂(如淀粉的改性产物)； 人工合成高分子絮凝剂 (如阳离子聚丙烯酰胺)
第二章预处理
无机与有机复合絮凝剂往往效果更好；
重组蛋白的提取步骤
1．大肠杆菌的酶解 采用溶菌酶或超声破碎方法来破壁
2．包含体的清洗 用溶剂清洗包含体能进一步除去杂蛋白
3．从包含体中溶解重组蛋白（变性） 选择和优化溶解液（一般为尿素和盐酸胍）， 使包含体中重组蛋白溶解
4. 重组蛋白的复性 稀释法、透析法、层析法、分子伴侣等
第二章预处理
第二节 细胞的破碎与提取
对于胞外产物，经预处理应尽可能使目的产物 转移到液相，然后经固液分离除去固相；
对于胞内产物，则应首先收集菌体或细胞，经 细胞破碎后，目的产物进入液相，随后再将细胞碎 片分离。
第二章预处理
3.1 微生物发酵液预处理 主要包括 1）发酵液杂质的去除 2）改善培养液的处理性能
第二章预处理
发酵液杂质的去除
第二章预处理
细菌及某些放线菌菌体细小，发酵 液粘度大，往往不能直接过滤，直接用 离心法实现，则能耗很大，应用微滤的 方法，又容易产生膜堵塞。此时可选择 采用细胞絮凝技术。
第二章预处理
细胞絮凝技术
指在某些高分子絮凝剂存在下，基于架桥 作用，使胶粒形成粗大的絮凝团的过程，是一 种以物理的集合为主的过程。 通常需控制絮凝剂浓度保持在较窄的范围内, 如胶体的颗粒表面吸附大量的高分 子物质,反而 会在表面形成空间保护层。
微生物絮凝剂具较好发展潜力，主要以多 糖、多聚氨基酸蛋白质或糖蛋白为主，还 有少量的DNA和脂类絮凝剂；
絮凝效果与加入量、分子量和类型，溶液 的pH值、搅拌速率和时间等因素有关。
第二章预处理
絮凝机理
（1）胶体理论
细菌可看做胶粒，因细胞表面的极性基团引起的表 面吸附…….
（2）高聚物架桥理论
细胞表面分泌的高聚物形成的胞外纤丝通过架桥交 联而使细胞絮凝。
第二章预处理
植物组织预处理需注意：
⑴ 温度尽可能低；
⑵ 提取液的量要保证“充分浸入”； ⑶ 加入足量酚类吸附剂； ⑷ 加入足量氧化酶抑制剂； ⑸ 搅拌转速要恰当； ⑹ pH要控制在合适范围，一般5.5～7.0 。
第二章预处理
酚类吸附剂的种类：
天然和合成的聚合物：如清蛋白、尼龙粉、 聚乙烯吡咯烷酮-可溶的（PVP）和聚乙烯 聚吡咯烷酮-不溶的（PVPP）
聚苯乙烯和聚丙烯树脂：如基于聚苯乙烯
的离子交换树脂，包括阴离子交换树脂和 阳离子交换树脂。
第二章预处理
氧化酶抑制剂的种类
2-巯基乙醇、二硫苏糖醇(DTT)及二硫赤藓 糖醇(DTE)是常用的抗氧化剂，而抗坏血酸盐则 较少使用。
前三种既是多酚氧化酶的抑制者又是醌的清 除剂；
抗坏血酸盐在低浓度的醌存在下就很易被消 耗，因此须在相对较高的浓度条件下使用 （50mmol/L）。
（3）双电层理论
细胞表面本身有电荷，加入的电解质的排斥作用而 促使细胞产生聚并作用。
第二章预处理
3.2 大肠杆菌重组蛋白的提取制备
多拷贝质粒上强启动子过量表达重组蛋白 质使整个细胞的蛋白质表达水平提高,但大多情 形下会导致诸如包含体的不溶性蛋白聚集的形 成.
重组菌E. coli M15(pQE32-AG第N)二外章源预基处因理的诱导表达(A未诱导，B诱导)
发酵成分复杂，对提取影响最大的是高价无 机离子和杂蛋白 主要影响后期离子交换、萃取、膜过滤等……
无机离子的去除
钙离子: 加入草酸(形成沉淀，酸化发酵液，草酸钙还
能促使蛋白质凝固
镁离子: 加入三聚磷酸钠可与之形成可溶性络合物，可
不再干扰离子交换
铁离子: 加黄血盐使其形成普鲁士蓝沉淀
第二章预处理
•可溶性蛋白质的去除：
第二章 生物样品的预处理
生物样品中往往含有大量有机物、无 机物及各种微量元素等，因此对目标组分 进行初步富集和分离，对干扰组分进行初 步去除等工作都属于预处理。
第二章预处理
种类：
植物或动物细胞培养液、微生物发酵液、动物血液、 乳液和动植物组织提取液等。
特征：
⑴ 目标产物浓度较低，悬浮液大部分是“水”，组 分复杂，是含多种物质的混合物；
第二章预处理
2. 动物组织预处理
匀浆化前的预处理 (冷冻) 提取物缓冲液的选择(中性) 蛋白酶抑制剂的添加 保护剂的添加(β-巯基乙醇、EDTA、辅酶等 ) 提取液的澄清 ( 高速离心、沉淀、吸附等)
第二章预处理
3. 微生物物质的提取制备
大多数发酵产物存在于发酵液中，也有少数产 物存在于菌体中，或发酵液和菌体中都含有。
珠磨法 压榨 高压匀浆 超声破碎
酶溶法 化学法 物理法
第二章预处理
二、常用的几种破碎方法 ㈠． 组织捣碎
原理：机械运动产生剪切力的作用破细胞
利用高速旋转的叶片所产生的剪切力将 组织细胞破碎。（10000～20000r/min）
⑵ 分离过程易失活，pH、离子强度、温度等变化常常 造成产物的失活；
⑶ 性质不稳定，易随时间变化，如受空气氧化，微生 物污染，蛋白水解作用等。
第二章预处理
1.植物组织
植物组织被破坏时，一些目的物和酚 类处混合接触状态，很易发生反应。产物 苯醌和单宁酸类会继续和目的物反应, 使 目的物失去活性。为此去除酚类化合物或 避免反应往往是必须进行的步骤。
细胞的破碎：
用一定方法（机械法、物理法、化学 法、酶法等）打开细胞壁或膜，使细胞的 内含物有效地释放出来。
第二章预处理
提取： 目的物从胞内转移到外界溶液中
（提取剂）
细胞 （提取剂）
破碎
匀浆
离心
wenku.baidu.com提取液（液体目的物）
沉淀 洗涤 提取物（固体目的物）
第二章预处理
机械法
破碎方法
非机械法
固体剪切力 液体剪切力 干燥处理 溶液作用
1）盐析 2）等电点沉淀 3）加热法 4）有机溶剂沉淀法 5）吸附法 6）其它沉淀法
第二章预处理
•有色物质的去除 常用脱色方法为吸附法
如活性炭吸附、树脂吸附等
第二章预处理
发酵液处理性能的改善
降低发酵液的黏度 加热法和加水稀释法
调节pH值 因pH直接影响发酵液中某些物质的
电离度和电荷性质，通过调节pH值可以 改善过滤特性。
第二章预处理
絮凝剂分类
习惯分为： 无机絮凝剂、有机絮凝剂
无机絮凝剂： 无机盐类絮凝剂(如硫酸铝、 硫酸亚铁、氯
化铝等)；无机高分子絮凝剂(如聚合氯化铝、 聚合铝铁等) 有机絮凝剂：
天然高分子 絮凝剂(如淀粉的改性产物)； 人工合成高分子絮凝剂 (如阳离子聚丙烯酰胺)
第二章预处理
无机与有机复合絮凝剂往往效果更好；
重组蛋白的提取步骤
1．大肠杆菌的酶解 采用溶菌酶或超声破碎方法来破壁
2．包含体的清洗 用溶剂清洗包含体能进一步除去杂蛋白
3．从包含体中溶解重组蛋白（变性） 选择和优化溶解液（一般为尿素和盐酸胍）， 使包含体中重组蛋白溶解
4. 重组蛋白的复性 稀释法、透析法、层析法、分子伴侣等
第二章预处理
第二节 细胞的破碎与提取
对于胞外产物，经预处理应尽可能使目的产物 转移到液相，然后经固液分离除去固相；
对于胞内产物，则应首先收集菌体或细胞，经 细胞破碎后，目的产物进入液相，随后再将细胞碎 片分离。
第二章预处理
3.1 微生物发酵液预处理 主要包括 1）发酵液杂质的去除 2）改善培养液的处理性能
第二章预处理
发酵液杂质的去除
第二章预处理
细菌及某些放线菌菌体细小，发酵 液粘度大，往往不能直接过滤，直接用 离心法实现，则能耗很大，应用微滤的 方法，又容易产生膜堵塞。此时可选择 采用细胞絮凝技术。
第二章预处理
细胞絮凝技术
指在某些高分子絮凝剂存在下，基于架桥 作用，使胶粒形成粗大的絮凝团的过程，是一 种以物理的集合为主的过程。 通常需控制絮凝剂浓度保持在较窄的范围内, 如胶体的颗粒表面吸附大量的高分 子物质,反而 会在表面形成空间保护层。
微生物絮凝剂具较好发展潜力，主要以多 糖、多聚氨基酸蛋白质或糖蛋白为主，还 有少量的DNA和脂类絮凝剂；
絮凝效果与加入量、分子量和类型，溶液 的pH值、搅拌速率和时间等因素有关。
第二章预处理
絮凝机理
（1）胶体理论
细菌可看做胶粒，因细胞表面的极性基团引起的表 面吸附…….
（2）高聚物架桥理论
细胞表面分泌的高聚物形成的胞外纤丝通过架桥交 联而使细胞絮凝。
第二章预处理
植物组织预处理需注意：
⑴ 温度尽可能低；
⑵ 提取液的量要保证“充分浸入”； ⑶ 加入足量酚类吸附剂； ⑷ 加入足量氧化酶抑制剂； ⑸ 搅拌转速要恰当； ⑹ pH要控制在合适范围，一般5.5～7.0 。
第二章预处理
酚类吸附剂的种类：
天然和合成的聚合物：如清蛋白、尼龙粉、 聚乙烯吡咯烷酮-可溶的（PVP）和聚乙烯 聚吡咯烷酮-不溶的（PVPP）
聚苯乙烯和聚丙烯树脂：如基于聚苯乙烯
的离子交换树脂，包括阴离子交换树脂和 阳离子交换树脂。
第二章预处理
氧化酶抑制剂的种类
2-巯基乙醇、二硫苏糖醇(DTT)及二硫赤藓 糖醇(DTE)是常用的抗氧化剂，而抗坏血酸盐则 较少使用。
前三种既是多酚氧化酶的抑制者又是醌的清 除剂；
抗坏血酸盐在低浓度的醌存在下就很易被消 耗，因此须在相对较高的浓度条件下使用 （50mmol/L）。
（3）双电层理论
细胞表面本身有电荷，加入的电解质的排斥作用而 促使细胞产生聚并作用。
第二章预处理
3.2 大肠杆菌重组蛋白的提取制备
多拷贝质粒上强启动子过量表达重组蛋白 质使整个细胞的蛋白质表达水平提高,但大多情 形下会导致诸如包含体的不溶性蛋白聚集的形 成.
重组菌E. coli M15(pQE32-AG第N)二外章源预基处因理的诱导表达(A未诱导，B诱导)
发酵成分复杂，对提取影响最大的是高价无 机离子和杂蛋白 主要影响后期离子交换、萃取、膜过滤等……
无机离子的去除
钙离子: 加入草酸(形成沉淀，酸化发酵液，草酸钙还
能促使蛋白质凝固
镁离子: 加入三聚磷酸钠可与之形成可溶性络合物，可
不再干扰离子交换
铁离子: 加黄血盐使其形成普鲁士蓝沉淀
第二章预处理
•可溶性蛋白质的去除：
第二章 生物样品的预处理
生物样品中往往含有大量有机物、无 机物及各种微量元素等，因此对目标组分 进行初步富集和分离，对干扰组分进行初 步去除等工作都属于预处理。
第二章预处理
种类：
植物或动物细胞培养液、微生物发酵液、动物血液、 乳液和动植物组织提取液等。
特征：
⑴ 目标产物浓度较低，悬浮液大部分是“水”，组 分复杂，是含多种物质的混合物；
第二章预处理
2. 动物组织预处理
匀浆化前的预处理 (冷冻) 提取物缓冲液的选择(中性) 蛋白酶抑制剂的添加 保护剂的添加(β-巯基乙醇、EDTA、辅酶等 ) 提取液的澄清 ( 高速离心、沉淀、吸附等)
第二章预处理
3. 微生物物质的提取制备
大多数发酵产物存在于发酵液中，也有少数产 物存在于菌体中，或发酵液和菌体中都含有。
珠磨法 压榨 高压匀浆 超声破碎
酶溶法 化学法 物理法
第二章预处理
二、常用的几种破碎方法 ㈠． 组织捣碎
原理：机械运动产生剪切力的作用破细胞
利用高速旋转的叶片所产生的剪切力将 组织细胞破碎。（10000～20000r/min）
⑵ 分离过程易失活，pH、离子强度、温度等变化常常 造成产物的失活；
⑶ 性质不稳定，易随时间变化，如受空气氧化，微生 物污染，蛋白水解作用等。
第二章预处理
1.植物组织
植物组织被破坏时，一些目的物和酚 类处混合接触状态，很易发生反应。产物 苯醌和单宁酸类会继续和目的物反应, 使 目的物失去活性。为此去除酚类化合物或 避免反应往往是必须进行的步骤。