荧光标记抗体
荧光微球标记抗体制备的详细步骤及问题分析
荧光微球标记抗体方法及问题分析很多公司开展了荧光胶乳免疫层析做定量分析及胶乳增强免疫比浊分析项目，关注胶乳标记技术的技术人员越来越多。
本人总结了部分胶乳微球标记技术相关主题帖，并加以分类，以便朋友们查阅，希望朋友们继续完善或分享经验。
1. 胶乳大小选择【求助】免疫胶乳或免疫颗粒（聚苯乙烯）的粒径免疫胶乳或免疫颗粒（聚苯乙烯）的粒径- 丁香园论坛【求助】乳胶免疫比浊中的乳胶颗粒大小与抗体乳胶免疫比浊中的乳胶颗粒大小与抗体- 丁香园论坛2. 胶乳标记方法【交流】蛋白如何偶联到聚苯乙烯乳胶颗粒上蛋白如何偶联到聚苯乙烯乳胶颗粒上- 丁香园论坛（求助）胶乳标记（求助）胶乳标记- 丁香园论坛【求助】抗原或抗体致敏胶乳的缓冲液和pH值抗原或抗体致敏胶乳的缓冲液和pH值- 丁香园论坛3. 胶乳标记过程问题【求助】胶乳偶联出现絮凝胶乳增强免疫比浊试剂稳定性问题- 丁香园论坛【求助】胶乳增强免疫比浊中抗体交联的问题胶乳微球物理吸附反应微球带磺酸基、羧基、醛基表面的都是疏水微球，都可以用来设计被动吸附蛋白。
磺酸基微球表面含带有负电荷的磺酸基团，pka大约为2，因此在酸性pH保持稳定。
醛基微球表面也带有磺酸基团，但能和蛋白行程共价键。
羧基微球表面含带负电荷的羧基基团，在pH5.0以上时保持稳定。
带有疏水基团的蛋白的吸附和配位结合，是最简单和直接的标记方法。
这种方法中，微球溶液和含目标蛋白的溶液混合，反应后，未结合的游离蛋白通过清洗步骤除去，从而获得胶体蛋白复合物。
疏水吸附方法只能用于疏水微球（硫酸盐、羧基、醛基表面修饰的微球）。
醛基表面修饰微球是一个特例，其疏水吸附结果取决于后来的共价结合。
虽然物理吸附是不依赖pH的，但反应缓冲液的pH对蛋白的结构有非常大的影响，从而影响蛋白吸附到微球上的反应效率。
一般，在被吸附蛋白等电点附近pH时，物理吸附效率会很高。
反应步骤：1. 用反应缓冲液系数蛋白到10mg/ml；2. 用反应缓冲液系数胶乳微球到1%；3. 将蛋白溶液加入到胶乳微球溶液中，10ml胶乳中加入1ml蛋白溶液。
荧光免疫标记技术
荧光染料的选择与特性
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荧光染料种类
常见的荧光染料包括异荧光染料特性
不同的荧光染料具有不同的激 发波长和发射波长，可选择适 用于不同检测需求的染料。
荧光染料标记方式
荧光染料稳定性
荧光染料可以通过化学键合、 生物素-亲和素系统等方式与抗 体或抗原结合。
反应条件控制
为了确保抗原-抗体反应的顺利进行，需要控制适宜的反应条件， 如温度、pH值和离子强度等。这些条件会影响抗原和抗体的活性 以及它们之间的结合能力。
荧光染料的标记与染色
选择合适的荧光染料
根据实验需求选择具有特定波长的荧光染料，以便在检测时能够产生明显的荧 光信号。荧光染料应具有高灵敏度、低背景干扰和稳定性好的特点。
标记抗原或抗体
将荧光染料与抗原或抗体结合，形成带有荧光的标记物。标记的过程可以通过 化学方法或生物技术实现，确保荧光染料与抗原或抗体牢固结合。
结果观察与数据分析
荧光显微镜观察
通过荧光显微镜观察抗原-抗体复合物的荧光信号，可以定性或定量分析样本中 的抗原含量。观察时需注意控制激发波长和发射波长，以获得最佳的荧光信号。
数据分析
利用相关软件对荧光信号进行定量分析，通过测量荧光强度、荧光分布和荧光色 彩等信息，计算抗原浓度或细胞数量等指标。数据分析有助于提高实验结果的准 确性和可靠性。
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荧光免疫标记技术的优缺点
优点
高灵敏度
荧光免疫标记技术能够检测到低浓度的抗原或抗 体，具有较高的灵敏度。
特异性高
荧光免疫标记技术通常采用特异性的抗体或抗原 ，能够针对特定的目标进行检测，具有较高的特 异性。
流式细胞术
利用荧光免疫标记技术对细胞 表面抗原进行标记，通过流式 细胞仪进行检测和分析，可以 对细胞进行分群、计数和功能 研究。
免疫荧光抗体技术
免疫荧光抗体技术摘要：免疫荧光抗体技术是指用荧光素对抗体或抗原进行标记，然后用荧光显微镜观察荧光以分析示踪相应的抗原或抗体的方法。
其中，最常用的是以荧光素标记抗体或抗抗体，用于检测相应的抗原或抗体。
本文主要对他们的原理、特点的介绍，并对其前景进行了探讨。
关键字：免疫荧光抗体技术研究进展Abstact Immunofluorescence antibody technology refers to an antigen or antibody labeled with fluorescein, then observed by fluorescence microscopy and fluorescence analysis in tracing the corresponding antigen or antibody . The most commonly used is labeled with fluorescein antibody or antibody, used to detect the corresponding antigen or antibody 。
This paper mainly introduces the principle, characteristics of them, and their prospects were discussed . Key words immuno ，Immunofluorescence， research progress1.免疫荧光抗体标记技术荧光抗体技术示意图免疫荧光标记技术（immunofluorescence technique）是将已知的抗体或抗原分子标记上荧光素，当与其相对应的抗原或抗体起反应时，在形成的复合物上就带有一定量的荧光素，在荧光显微镜下就可以看见发出荧光的抗原抗体结合部位，检测出抗原或抗体。
免疫荧光标记技术始创于20世纪40年[1]代初，1942年Coons等首次报道用异氰酸荧光素标记抗体，检查小鼠组织切片中的可溶性肺炎球菌多糖抗原。
荧光素FITC标记抗体方法
荧光素FITC标记抗体的方法当FITC在碱性溶液中与抗体蛋白反应时，主要是蛋白质上赖氨酸的r氨基与荧光素的硫碳胺键(thiocarbmide)结合，形成FITC-蛋白质结合物，即荧光抗体或荧光结合物。
一个IgG分子中有86个赖氨酸残基，一般最多能结合15～20个，一个IgG分子可结合2～8个分子的FITC，其反应式如下FITC-N=C=S + N-H2-蛋白质→ FITC-NS-C-N-H2-蛋白质常用Marsshall(1958)法标记荧光抗体，也可以根据条件采用Chadwick等标记法或Clark等(1963)的透析标记法。
1．Marsshall法(1)材料抗体球蛋白溶液、0．5mol／L(pH9．0)碳酸盐缓冲液、无菌生理盐水、异硫氰酸荧光素、1％硫柳汞水溶液、50ml小烧杯、4℃冰箱、电磁搅拌器、透析袋、玻棒、pH7．2或3．0的0．01mol／LPBS等。
(2)方法及步骤①抗体的准备取适量已知浓度的球蛋白溶液于烧杯中，再加人生理盐水及碳酸盐缓冲液，使最后免疫球蛋白浓度为20mg／ml，碳酸盐缓冲液容量为总量的1／10，混匀，将烧瓴置电磁搅拌器上(速度适当以不起泡沫为宜)5～10min。
②荧光素的准备根据欲标记的蛋白质总量，按每毫克免疫球蛋白加0．01mg荧光色素，用分析天平准确称取所需的异硫氰酸荧光素粉末。
也可用下述公式计算出免疫球蛋白、荧光素的量，还可以算出需加缓冲液的量。
a．蛋白溶液：含量Amg／m1；容积Bml。
b．总蛋白量(AXB)＝Crag。
c．C／20～C／10＝Dmg(如蛋白含量低于20mg／ml，用C／10；如高于20mg／ml，用C／20)。
d．荧光素FITC的量：(1／50～2／100)XC＝Emg。
e．巳0．5mol／L(pH9．5)碳酸盐缓冲液D／10＝Fml。
f．PBS量D-(B+F)=Gml。
注：A为蛋白含量，mg／ml；B为蛋白质溶液的容积；C为蛋白总量，mg；D为常数，mg；正为荧光素的量，mg；F为碳酸盐缓冲液的容积，ml；G为PBS的容积，ml。
荧光免疫标记技术
适用于标记样品量少、蛋白含量低的抗体溶液，此法标记抗体比较 均匀，非特异性染色也比较少。
【主要试剂与器材】 1．器材 （1）铁立架、蝴蝶夹、层析柱、洗脱瓶、搅拌器、磁棒、
紫外分光光度计 （2）烧杯、试管、滴管、吸管、洗耳球、pH试纸、黑纸 2．试剂 （1）抗体 （2）异硫氰基荧光黄（FITC） （3）葡聚糖凝胶（Sephadex G-25） （4）pH9.5，0. 5M 碳酸缓冲液 （5）pH7.0，0.005M 磷酸缓冲液
免疫标记技术的应用 标记物与抗原、抗体的连接技术； 标记后的抗原、抗体进行特异性检测的实验设计原理 以及相应的检测仪器的使用方法。
免疫荧光标记技术（immunofluorescence technique）
是将已知的抗体或抗原分子标记上荧光素，当与其相对应 的抗原或抗体起反应时，在形成的复合物上就带有一定量 的荧光素，在荧光显微镜下就可以看见发出荧光的抗原抗 体结合部位，检测出抗原或抗体。
荧光免疫标记技术
免疫标记（immunolabelling technic）
是指用一些易测定的、具有高度敏感性的标记物质：荧光素、放射 性核素、酶、胶体金、生物素、铁蛋白及化学（或生物）发光剂等作为 追踪物，标记特异性的抗原、抗体分子进行的抗原、抗体反应。
通过这些标记物的增强放大效应来显示反应系统中抗原、抗体的性 质与含量。并借助于荧光显微镜、射线测量仪、酶标检测仪、电子显微 镜和发光免疫测定仪等精密仪器对试验结果直接镜检观察或进行自动化 测定。
免疫荧光技术- 基本原理
免疫荧光技术是将抗原抗体反应的特异性和敏感性与显微 示踪的精确性相结合。
以荧光素作为标记物，与已知的抗体(或抗原)结合、但不 影响其免疫学特性。然后将荧光素标记的抗体作为标准试 剂，用于检测和鉴定未知的抗原。
抗体PE荧光素标记操作流程记录
1.目的
规范单克隆抗体标记荧光PE (快速标记法）标准操作程序
2.适用范围
适用于本公司抗体标记荧光PE (快速标记法）操作
3.术语和定义
藻红蛋白，简称“PE”。
相对分子质量较大，约为240kD，最大吸收峰为564nm。
4.职责和权限
实验员负责实施本规范，主管负责人监督执行。
5.实验试剂.
5.1溶液配制
5.2其他试剂
6.操作流程
6.1抗体活化
将抗体用0.01mol/L PBS稀释为1mg/mL，加入mL 活化液(体积比为抗体溶液：反应活化液=10:1），旋涡振荡器混匀后，室温避光反应10min。
6.2与PE反应形成共轭物
将抗体混合液（步骤6.1）加入mg PE荧光素中（加入量：抗体与荧光素质量比为1:1），在室温条件下避光反应3小时，反应开始时间：至结束时间：；（或2-8度条件下避光过夜）。
6.3荧光淬灭
向共轭物（步骤6.2）中加入mL 淬灭剂（淬灭剂添加量按抗体体积：淬灭剂体积=10:1添加）。
混匀后，室温孵育30分钟，去除游离的荧光素的荧光效应。
淬灭开始时间：至结束时间：。
6.4层析
将共轭物（步骤6.3）层析柱分离，进一步去除游离的荧光素或抗体。
6.5保存
收集得到的标记抗体（步骤6.4），上机测试后根据效价，用Storage Buffer 按比例稀释后，4℃避光保存，有效期一年。
几种常见的抗体标记方法-酶标记、荧光素标记、同位素标记、生物素标记
几种常见的抗体标记方法-酶标记、荧光素标记、同位素标记、生物素标记抗体标记主要有酶标记、荧光素标记、同位素标记、生物素标记等，还有一些其他的标记方法例如金标记，本文主要讲述了这些抗体标记的基本原理、操作步骤。
一、酶标记1、辣根过氧化物酶(HRP)标记辣根过氧化物酶(HRP)标记单抗和多克隆抗体的常用方法是过碘酸钠法。
其原理是HRP的糖基用过碘酸钠氧化成醛基，加入抗体IgG 后该醛基与IgG氨基结合，形成Schiff氏碱。
为了防止HRP 中糖的醛基与其自身蛋白氨基发生偶合，在用过碘酸钠氧化前先用二硝基氟苯阻断氨基。
氧化反应末了，用硼氢化钠稳定Schiff氏碱。
这里介绍两种程序。
程序一：(1)将5mg HRP溶于0.5ml 0.1mol/L NaHCO3溶液中;加0.5ml 10mmol/LNaIO4溶液，混匀，盖紧瓶塞，室温避光作用2小时。
(2)加0.75ml 0.1mol/L Na2CO3混匀。
(3)加入0.75ml小鼠已处理的腹水，或纯化单抗等(15mg/ml)，混匀。
(4)称取SephadexG25干粉0.3g，加入一支下口垫玻璃棉的5ml注射器外筒内;随后将上述交联物移入注射器外套;盖紧，室温作用(避光)3小时或4℃过夜。
(5)用少许PBS将交联物全部洗出，收集洗出液，加1/20V体积新鲜配制的5mg/mlNaBH4溶液，混匀，室温作用30分钟;再加入3/20V NaBH4溶液，混匀，室温作用1小时(或4℃过夜)。
(6)将交联物过Sephadex g200或Sepharose6B(2.6×50cm)层析纯化，分管收集第一峰。
(7)酶结合物质量鉴定：克分子比值测定酶量(mg/ml)=OD403×0.4IgG量(mg/ml)=(OD280-OD403×0.3)×0.62克分子比值(E/P)=酶量×4/IgG量，一般在1-2之间。
酶结合率=酶量×体积/抗体，标记率一般为0.3-0.6，即1-2个HRP分子结合在一个抗体分子上，标记率可大于0.6，0.8，0.9;OD403/OD280等于0.4时，E/P约为1。
几种常见的抗体标记方法-酶标记、荧光素标记、同位素标记、生物素标记
几种常见的抗体标记方法-酶标记、荧光素标记、同位素标记、生物素标记抗体标记主要有酶标记、荧光素标记、同位素标记、生物素标记等，还有一些其他的标记方法例如金标记，本文主要讲述了这些抗体标记的基本原理、操作步骤。
、酶标记1 、辣根过氧化物酶(HRP) 标记辣根过氧化物酶(HRP) 标记单抗和多克隆抗体的常用方法是过碘酸钠法。
其原理是HRP 的糖基用过碘酸钠氧化成醛基，加入抗体IgG后该醛基与IgG 氨基结合，形成Schiff 氏碱。
为了防止HRP中糖的醛基与其自身蛋白氨基发生偶合，在用过碘酸钠氧化前先用二硝基氟苯阻断氨基。
氧化反应末了，用硼氢化钠稳定Schiff 氏碱。
这里介绍两种程序。
程序一：(1)将5mg HRP 溶于0.5ml 0.1mol/L NaHCO3 溶液中加0.5ml 10mmol/LNaIO4 溶液，混匀，盖紧瓶塞，室温避光作用2 小时。
(2)加0.75ml 0.1mol/L Na2CO3 混匀。
(3)加入0.75ml 小鼠已处理的腹水，或纯化单抗等(15mg/ml) ，混匀。
(4)称取SephadexG25 干粉0.3g ，加入一支下口垫玻璃棉的5ml 注射器外筒内;随后将上述交联物移入注射器外套;盖紧，室温作用(避光)3小时或4C过夜。
(5)用少许PBS 将交联物全部洗出，收集洗出液，加1/20V 体积新鲜配制的5mg/mlNaBH4 溶液，混匀，室温作用30 分钟;再加入3/20V NaBH4溶液，混匀，室温作用1小时(或4C过夜)。
(6)将交联物过Sephadex g200 或Sepharose6B(2.6 X 50cm)层析纯化，分管收集第一峰。
(7)酶结合物质量鉴定：克分子比值测定酶量(mg/ml)=OD403 X 0.4IgG 量(mg/ml)=(OD280- OD403X 0.3) X 0.62克分子比值(E/P)=酶量X 4/IgG量，一般在1-2之间。
酶结合率=酶量X体积/抗体，标记率一般为0.3-0.6，即1-2个HRP 分子结合在一个抗体分子上，标记率可大于0.6，0.8，0.9;OD403/OD280 等于0.4 时，E/P 约为1 。
免疫荧光技术
葡聚糖凝胶G25或G50，用pH=7.4的0.01%PBS溶胀 后装柱，加入标记后的抗体溶液，然后用上述 PBS洗脱，取洗脱液加入20%三氯醋酸使蛋白沉淀 后，上清液中的荧光素应低于0.01ug/ml。
⑵ 除去标记不适当的抗体：
采用DEAE纤维素离子柱。将DEAE纤维素用pH=7.6的 0.01mol/L磷酸盐缓冲液平衡装柱，加入标记抗体溶液， 进行分步洗脱。 未结合荧光素的抗体，所帶负电少，最先洗出。 中间洗脱出来的是荧光标记合适的抗体部分。 过量结合荧光素的抗体，所帶负电多，最后洗出。 但经此法纯化，标记抗体损失达50%。
⑶ 除去非特异反应物质：
将荧光抗体用同一正常组织或同种动物其它组织 的组织粉预先吸收。 按每ml标记抗体加100mg组织粉比例混合， 4℃ 磁力搅拌1h，静置1h，1800r/min于4℃条件下离 心20min取上清液，再用每ml标记抗体加组织粉 比例重复一次。
（三）荧光抗体的鉴定
荧光素与蛋白结合率：
P:总蛋白质的量。F：荧光色素量。（物质的量）
*
*
固定标本染色以F/P=1.5左右为宜 活细胞染色以F/P=2.4左右为宜.
F/P值高则抗体分子结合的荧光素多。
F/P=
IgG (mg/ml)
荧光色素（μg/L ） 160 000x10 3 荧光色素 ( μg/L ） x 0.4 x 6
IgG (mg/ml) 390x10
病毒
无水乙醇,丙酮、CCl4
（3）固定后处理
抗原固定后必须立即以冷PH7.4 PBS冲洗,顺序经过三缸 浸泡,每缸3min，末次再以蒸馏水浸泡1min以脱盐。 标本固定干燥后最好立即进行荧光染色及镜检，如必须 保存则应保持干燥，置于4℃以下保存，一般细菌涂片或 组织切片经过固定后可保存一个月以上，但病毒和某些 组织 抗原标本则需-20℃以下保存。
荧光素FITC标记抗体的原理和操作方法
荧光素FITC标记抗体的原理和操作方法中文名称：异硫氰酸荧光素酯中文别名：荧光素-5-异氰酸酯; 异硫氰酸荧光酯异构体; 异硫氰酸荧光橙红; 异硫氰酸荧光红; 异硫氰酸荧光黄; 异硫氰酸荧光素（同分异构体I）; 荧光素5-异硫氰酸盐,异构体1,95%; 异硫氰酸荧光素异构体1.95+%; 异硫氰酸荧光素英文名称：Fluorescein isothiocyanate isomer I英文别名：Fluorescein isothiocyanate, isomer 1; 5-FITC;5-Isothiocyanato fluorescein; FITC; FITC-CELITE(R); FITC ISOMER; FITC 'ISOMER I'; FITC, ISOMER I; FLUORESCEIN ISOMER I ISOTHIOCYANATE;2-(6-hydroxy-3-oxo-3H-xanthen-9-yl)-5-isothiocyanatobe nzoic acidCAS号：3326-32-7 EINECS号：222-042-0 分子式：C21H11NO5S分子量：389.3807InChI：InChI=1/C21H11NO5S/c23-12-2-5-15-18(8-12)27-19-9-13(24 )3-6-16(19)20(15)14-4-1-11(22-10-28)7-17(14)21(25)26/h 1-9,23H,(H,25,26)分子结构：密度： 1.46g/cm3熔点：360℃沸点：735.6°C at 760 mmHg闪点：398.7°C水溶性：practically insoluble蒸汽压： 1.02E-22mmHg at 25°C【FITC标记原理】当FITC在碱性溶液中与抗体蛋白反应时，主要是蛋白质上赖氨酸的r氨基与荧光素的硫碳胺键(thiocarbmide)结合，形成FITC-蛋白质结合物，即荧光抗体或荧光结合物。
荧光标记抗体原理
荧光标记抗体原理
荧光标记抗体是指将一种荧光物质与抗体结合，使抗体具有荧光性质。
荧光标记抗体原理如下：
1. 选择一种具有良好荧光性质的荧光物质，常用的荧光物质包括荧光素、荧光染料（如荧光同种异构体（FITC）、荧光硫氰酸异硫氰酯（Alexa Fluor）等）等。
2. 将选择的荧光物质与抗体进行化学反应，常用的偶联试剂包括异硫氰酸酯（Isocyanate）和丙酮醛等。
3. 反应后，荧光物质与抗体结合成荧光标记抗体。
荧光物质的选择要求与抗体具有良好的结合活性和稳定性，且不影响抗体的特异性和亲和性。
4. 荧光标记抗体可用于免疫组化、流式细胞术、免疫印迹等实验中，通过检测其荧光信号来定位和定量分析抗体所结合的目标分子。
荧光标记抗体的优势在于其具有较高的灵敏度、选择性和多色选择性，可用于多重标记和共定位分析等研究。
同时，荧光标记抗体还可以与其他标记抗体（如酶标记抗体）结合使用，以增加信号的稳定性和可见度，从而提高实验结果的可靠性。
荧光素FITC标记抗体的方法
荧光素FITC标记抗体的方法当FITC在碱性溶液中与抗体蛋白反应时，主要是蛋白质上赖氨酸的r氨基与荧光素的硫碳胺键(thiocarbmide)结合，形成FITC-蛋白质结合物，即荧光抗体或荧光结合物。
一个IgG分子中有86个赖氨酸残基，一般最多能结合15～20个，一个IgG分子可结合2～8个分子的FITC，其反应式如下FITC-N=C=S + N-H2-蛋白质→FITC-NS-C-N-H2-蛋白质常用Marsshall(1958)法标记荧光抗体，也可以根据条件采用Chadwick等标记法或Clark等(1963)的透析标记法。
1．Marsshall法(1)材料抗体球蛋白溶液、0．5mol／L(pH9．0)碳酸盐缓冲液、无菌生理盐水、异硫氰酸荧光素、1％硫柳汞水溶液、50ml小烧杯、4℃冰箱、电磁搅拌器、透析袋、玻棒、pH7．2或3．0的0．01mol／LPBS等。
(2)方法及步骤①抗体的准备取适量已知浓度的球蛋白溶液于使最后免疫球蛋白浓度为再加人生理盐水及碳酸盐缓冲液，烧杯中，20mg／ml，碳酸盐缓冲液容量为总量的1／10，混匀，将烧瓴置电磁搅拌器上(速度适当以不起泡沫为宜)5～10min。
②荧光素的准备根据欲标记的蛋白质总量，按每毫克免疫球蛋白加0．01mg荧光色素，用分析天平准确称取所需的异硫氰酸荧光素粉末。
也可用下述公式计算出免疫球蛋白、荧光素的量，还可以算出需加缓冲液的量。
a．蛋白溶液：含量Amg／m1；容积Bml。
b．总蛋白量(AXB)＝Crag。
c．C／20～C／10＝Dmg(如蛋白含量低于20mg／ml，用C／10；如高于20mg／ml，用C／20)。
d．荧光素FITC的量：(1／50～2／100)XC＝Emg。
e．巳0．5mol／L(pH9．5)碳酸盐缓冲液D／10＝Fml。
f．PBS量D-(B+F)=Gml。
注：A为蛋白含量，mg／ml；B为蛋白质溶液的容积；C为蛋白总量，mg；D为常数，mg；正为荧光素的量，mg；F为碳酸盐缓。
荧光抗体标记_实验报告
一、实验目的1. 掌握荧光抗体标记技术的基本原理和操作步骤。
2. 学会使用荧光显微镜观察荧光标记的抗体与抗原的结合情况。
3. 了解荧光抗体标记技术在生物医学研究中的应用。
二、实验原理荧光抗体标记技术是将荧光素与特异性抗体结合，形成荧光标记抗体。
这种标记抗体仍保持抗体原有的活性，当与相应的抗原发生特异性结合时，荧光标记抗体在荧光显微镜下呈现出明亮的荧光，从而实现对抗原的检测和定位。
三、实验材料1. 实验试剂：FITC标记的抗体、抗原、抗体稀释液、磷酸盐缓冲液（PBS）、甘油、甲醇等。
2. 实验仪器：荧光显微镜、离心机、移液器、吸管、试管、载玻片等。
四、实验步骤1. 标准化抗体将FITC标记的抗体用抗体稀释液稀释至适当浓度。
2. 制备抗原将待检测的抗原用磷酸盐缓冲液（PBS）稀释至适当浓度。
3. 制备细胞悬液将待检测的细胞用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤后，离心弃去上清液，加入适量的磷酸盐缓冲液重悬细胞。
4. 混合抗原与抗体将抗原与抗体按一定比例混合，在室温下孵育一段时间。
5. 洗涤将混合后的溶液在室温下用磷酸盐缓冲液洗涤3次，每次洗涤后离心弃去上清液。
6. 封片将洗涤后的细胞沉淀用甘油封片，封片剂与细胞沉淀的比例为1:1。
7. 荧光显微镜观察将封片置于荧光显微镜下观察，调整显微镜参数，观察荧光标记的抗体与抗原的结合情况。
五、实验结果通过荧光显微镜观察，发现荧光标记的抗体与抗原发生了特异性结合，形成明亮的荧光复合物。
阳性细胞在荧光显微镜下呈现出明显的荧光信号，而阴性细胞则无荧光信号。
六、实验讨论1. 实验过程中，抗体与抗原的孵育时间、洗涤次数和封片剂的选择对实验结果有较大影响。
本实验中，抗体与抗原的孵育时间为30分钟，洗涤次数为3次，封片剂为甘油。
2. 荧光抗体标记技术具有特异性高、灵敏度高、操作简便等优点，广泛应用于生物医学研究、临床诊断等领域。
3. 在实验过程中，应注意以下几点：（1）抗体与抗原的比例要适中，过多或过少都会影响实验结果；（2）孵育时间不宜过长或过短，以免影响抗体与抗原的结合；（3）洗涤时要充分，以去除未结合的抗体和抗原；（4）封片剂的选择要合适，以保证荧光信号的稳定。
免疫荧光检测方法
免疫荧光检测方法
免疫荧光检测是一种基于抗原抗体反应的检测技术，利用荧光物质标记抗体，对组织或细胞内的抗原物质进行定位和定性分析。
以下是免疫荧光检测的两种主要方法：
1. 直接法：将标记的特异性荧光抗体直接加在抗原标本上，经一定的温度和时间的染色，用水洗去未参加反应的多余荧光抗体，室温下干燥后封片、镜检。
2. 间接法：滴加以/L，的PBS适当稀释的待检抗体标本，覆盖已知抗原标
本片。
将玻片置于有盖搪瓷盒内，37℃保温30分钟。
以上是免疫荧光检测方法的介绍，如有需要，建议咨询专业医师。
免疫荧光技术原理
免疫荧光技术原理
免疫荧光技术是一种通过特定抗体和荧光染料的结合来检测和定位抗原的方法。
其基本原理是利用抗体的高度特异性和荧光染料的高度敏感性，在光学显微镜下观察和分析。
以下是免疫荧光技术的基本步骤和原理：
1. 样品制备：首先，需要将要检测的样品进行处理和制备。
这可能涉及到细胞培养、组织切片或体液的准备等。
2. 抗体标记：将特异性抗体与荧光染料结合。
荧光染料通常包括荧光素、染料片段（如FITC、Rhodamine等）或其他荧光物质。
3. 样品固定：将样品进行固定，防止抗体和抗原在后续步骤中的失活或破坏。
常用的样品固定方法包括冷冻切片、固定液浸泡和染色等。
4. 抗原检测：将标记过的抗体与样品中的抗原结合。
由于抗体的高度特异性，只有目标抗原与抗体匹配才会发生结合。
5. 洗涤：通过洗涤步骤去除非特异性结合物。
这可以减少背景信号，提高检测的敏感性和特异性。
6. 观察和分析：将样品放置在显微镜下，使用特定的荧光显微镜进行观察。
荧光染料的激发光源会使标记过的抗体发出荧光信号，这样可以定位和分析抗原的位置、数量和分布。
通过免疫荧光技术，研究人员可以在细胞、组织和体内分析抗原的表达、定位和相互作用。
它在免疫学、生物学、医学和病毒学等领域有广泛的应用，如抗体检测、细胞标记、癌症研究等。
它的高灵敏度和高空间分辨率使其成为了一种重要的研究技术。
荧光抗体技术
第二节荧光抗体技术一、荧光抗体的制备（一）抗体的荧光素标记用于标记的抗体，要求是高特异性和高亲和力的。
所用抗血清中不应含有针对标本中正常组织的抗体。
一般需经纯化提取igg后再作标记。
作为标记的荧光素应符合以下要求：①应具有能与蛋白质分子形成共价健的化学基团，与蛋白质结合后不易解离，而未结合的色素及其降解产物易于清除。
②荧光效率高，与蛋白质结合后，仍能保持较高的荧光效率。
③荧光色泽与背景组织的色泽对比鲜明。
④与蛋白质结合后不影响蛋白质原有的生化与免疫性质。
⑤标记方法简单、安全无毒。
⑥与蛋白质的结合物稳定，易于保存。
常用的标记蛋白质的方法有搅拌法和透析法两种。
以fitc标记为例，搅拌标记法为：先将待标记的蛋白质溶液用0.5ml/lph9.0的碳酸盐缓冲液平衡，随后在磁力搅拌下逐滴加入fitc溶液，在室温持续搅拌4～6h 后，离心，上清即为标记物。
此法适用于标记体积较大，蛋白含量较高的抗体溶液。
优点是标记时间短，荧光素用量少。
但本法的影响因素多，若操作不当会引起较台强的非特异性荧光染色。
透析法适用于标记样品量少，蛋白含量低的抗体溶液。
此法标记比较均匀，非特异染色也较低。
方法为：先将待标记的蛋白质溶液装入透析袋中，置于含fitc的0.01mol/lph9.4碳酸盐缓冲液中反应过夜，以后再对pbs透析法去除游离色素。
低速离心，取上清。
标记完成后，还应对标记抗体进一步纯化以去除未结合的游离荧光素和过多结合荧光素的抗体。
纯化方法可采用透析法或层析分离法。
（二）荧光抗体的鉴定荧光抗体在使用前应加以鉴定。
鉴定指标记包括效价及荧光素与蛋白质的结合比率。
抗体效价可以用琼脂双扩散法进行滴定，效价大于1:16者较为理想。
荧光素与蛋白质结合比率（f/p）的测定和计算的基本方法是：将制备的荧光抗体稀释至a2801≈1.0，分别测读a280（蛋白质特异吸收峰）和标记荧光素的特异吸收峰，按公式计算。
按公式计算。
f/p值越高，说明抗体分子上结合的荧光素越多，反之则越少。
荧光免疫标记技术
免疫标记技术的应用 标记物与抗原、抗体的连接技术； 标记后的抗原、抗体进行特异性检测的实验设计原理
以及相应的检测仪器的使用方法。
免疫荧光标记技术（immunofluorescence technique）
将荧光素作为标记物与已知的特异性抗体以化学方法结合， 形成荧光素-蛋白质结合物（即荧光标记抗体），此结合物 仍保留着抗体的活性，同时具有荧光素的示踪作用。当它 与相应的抗原特异结合后形成的复合物上就带有一定量的 荧光素，在荧光灯源紫外线或蓝紫光激发下产生黄绿色荧 光，通过在荧光显微镜下观察或流式细胞仪分析可对相应 抗原进行定性、定位或定量的检测
FITC标记方法： 搅拌法：
适用于标记体积较大、蛋白质含量较高的抗体溶液。优点是标记时 间短、荧光试剂用量少，但此法所受影响因素较多，若操作不当会 引起较强的非特异性荧光染色出现。 直接标记法 间接标记法 改良法
透析法：
适用于标记样品量少、蛋白含量低的抗体溶液，此法标记抗体比较 均匀，非特异性染色也比较少。
计算F/P值，并对该比值作一简单分析。
荧光抗体的鉴定（特异性和敏感性鉴定）
效价 抗体效价可以用琼脂双扩散法进行滴定，效价大于1:16者 较为理想。 荧光素与蛋白质的结合比率 荧光素与蛋白质结合比率（f/p）的测定和计算
f/p值越高，说明抗体分子上结合的荧光素越多，反之则越 少。一般用于固定标本的荧光抗体以f/p＝1.5为宜，用于 活细胞染色的以f/p＝2.4为宜。
异硫氰酸荧光素(FITC)
四甲基异硫氰酸罗丹明（TRITC）
最大吸引光波长为550nm，最大发射光波长为620nm 呈橙红色荧光 与FITC的翠绿色荧光对比鲜明，可配合用于双重标记或对比染色 其异硫氰基可与蛋白质结合，但荧光效率较低
荧光抗体标记技术
荧光抗体标记技术荧光抗体标记技术是一种广泛应用于生物医学研究领域的方法。
它可以用来检测医学样品中的分子或细胞，并对这些样品进行定量和定位分析。
在这种技术中，荧光染料通过共价键结合在抗体分子上，使得这些抗体成为抗原组织切片和细胞样品中的分子的标志物。
本文将详细介绍荧光抗体标记技术的原理、应用和优缺点等方面。
荧光抗体标记技术是基于三种原理的。
第一种原理是抗体的特异性。
正常情况下，抗体和抗原是相互作用的，这种特异性是荧光抗体标记技术的关键。
第二种原理是荧光染料的化学性质。
荧光染料是带有单电子的分子，它们可以通过激发或激光扫描光源进行激发并发出特定波长的荧光。
这种荧光可以在显微镜下观察到，从而得到关于标志物分子位置的信息。
第三种原理是显微成像技术。
显微镜通过光学、荧光和电子成像技术等手段，可以把观察到的样品放大到显微镜视野内，便于观察和研究。
荧光抗体标记技术的步骤分为标记前准备、荧光标记和特异性验证。
标记前准备包括抗体制备、样品制备、预处理和靶向。
荧光标记是在标记前准备的基础上，将荧光染料共价结合到抗体分子上的过程。
这一步骤有别于传统的化学标记技术，因为它通过利用抗体的生物胶体化学性质来实现标记。
荧光抗体标记技术可以更加快捷和简便地标记样品，而且准确性更高。
特异性验证是一种质量控制方法，用于确保标记的抗体仅对目标分子或组织点进行标记。
1. 细胞和组织检测荧光抗体标记技术可以用来标记细胞和组织中的分子、蛋白质和其他生物分子，从而研究它们在组织结构和功能中的作用。
这些分子的定位和分量可以通过显微镜来捕捉，从而帮助研究人员更好地理解细胞和组织的功能和生物过程。
2. 免疫荧光检测荧光抗体标记技术也广泛应用于识别、定位和判定免疫相关分子和生物分子的分布。
这种检测方式可以用于分析抗体、抗原、免疫球蛋白和细胞等样品。
在临床诊断中，荧光抗体标记技术可用于检测人类疾病的血清、尿液和乳腺组织等样品。
3. 肿瘤诊断和治疗荧光抗体标记技术在肿瘤诊断和治疗方面也有广泛的应用，特别是在早期癌症诊断和治疗中。
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取已知浓度的抗体蛋白溶液（1ml， 50mg/ml ） ， 用pH9.5，0.5M 碳酸缓冲液（1.25ml）稀释至最终 浓度为20mg/ml。置于包黑纸的小烧杯中，并放入磁 棒。 称取适量FITC并溶解（已完成） 开启搅拌器，将FITC溶液用滴管逐滴滴入含抗体蛋 白溶液的烧杯内，加盖搅拌1小时。
实验步骤
荧光抗体标记
原理
荧光抗体标记技术是将荧光素以化学方法与特异性抗体共价 结合，形成荧光素-蛋白质结合物（即荧光标记抗体），此 结合物仍保留着抗体活性，同时具有荧光素的示踪作用。当 它与相应的抗原特异结合后，借助于荧光显微镜观察呈现明 亮的特异荧光。
原理
实验中常用异硫氰基荧光黄（fluorescein isothiocyanate, FITC）作为标记物，在碱性溶液中，FITC上的化学基团 异硫氰基（-N=C=S）与抗体蛋白自由氨基（主要是赖氨 -N=C=S 酸的ε-氨基）结合，形成荧光抗体。
分子筛层析原理
荧光素标记抗体的纯化采用凝胶过滤法，又称分子排阻层析或分子筛层 析，是以多孔网状结构凝胶颗粒作为层析介质。每种型号的凝胶颗粒， 其所具有的海绵状立体网孔结构的孔径较一致，犹如分子筛一样，可以 分离一定大小的分子。当不同大小分子的混合物加至柱表面时，大分子 不能进入胶粒的网孔内，在胶粒之间的空隙中向下移动，首先被洗脱； 而小分子则在下移的过程中，可不断进入胶粒的网孔内而反复遇阻，下 移速度慢，逐渐与大分子分开，因而后被洗脱。本实验根据所提纯的分 子大小采用葡聚糖凝胶Sephadex G-25，分离荧光素标记抗体与游离荧 光素。
值越高，说明抗体分子上结合的荧光素越多，标记抗体的灵 敏度就高，反之则越少； 但F/P过高会增加荧光素标记抗体的负电荷，从而增加与组织 细胞的非特异性吸附； 一般用于固定标本的荧光抗体以F/P＝1.5为宜，用于活细胞 F/P＝1.5 F/P 染色的以F/P＝2.4为宜。 F/P＝2.4 F/P
实验步骤
实验步骤
收集：当黄绿色荧光出现在洗脱液时，用试管收集全 部黄绿色荧光溶液。 黄色荧光溶液洗脱较慢，用蒸馏水洗脱约15分钟，直 至黄色荧光消失，停止洗脱后，将柱内凝胶回收入凝 胶瓶内。
实验步骤
将试管内收集的溶液混匀，作10倍稀释 （0.8ml+7.2ml PB）后在紫外分光光度计分别测 OD495nm和OD280nm值。 计算F/P值，并对该比值作一简单分析。
F/P=
2.87×OD495nm OD280nm－0.35×OD495nm
注意事项
1.影响标记效率的因素有温度、时间、pH、荧光素和蛋白 的量等，需注意控制。 2.荧光素及其标记抗体的操作过程注意避光，搅拌速度应适 当以避免气泡产生。 3.层析柱装柱注意正确操作，使柱体均匀、柱面平整，无气 泡、裂隙。 4.上样和洗脱时应做到“前切”和“后切”。”指样品走至 与凝胶平面相切时再加入洗脱缓冲液。
用Sephadex G-50装25cm层析柱，凝胶沉积约18cm （离管口7 cm，避免凝胶柱干掉），用pH7.0， 0.005M 磷酸缓冲液（PB）平衡洗脱约10分钟，流速 控制为1ml/分钟。 吸取上述标记液上凝胶柱，注意不可使柱面干掉。 用pH7.0，0.005M PB洗脱，流速控制为1ml/分钟。 可看到黄色与黄绿色荧光在凝胶柱分开。
FITC的标记原理与方法 FITC的标记原理与方法
荧光素-N=C=S + NH2-抗体
荧光素-N-C-N-抗体 H S H
（1）荧光抗体的标记
作为标记的荧光素应符合以下要求： 作为标记的荧光素应符合以下要求 ①应具有能与蛋白质分子形成共价健的化学基团， 与蛋白质结合后不易解离，而未结合的色素及其 降解产物易于清除。 ②荧光效率高,与蛋白质结合后，仍能保持较高的 荧光效率。 ③荧光色泽与背景组织的色泽对比鲜明。 ④与蛋白质结合后不影响蛋白质原有的生化与免 疫性质，与蛋白质的结合物稳定，易于保存。 ⑤标记方法简单、安全无毒。
常用于标记的荧光素： 异硫氰酸荧光黄（FITC） ） 四乙基罗丹明（RB200） ）
（2）标记抗体的纯化
①透析法 ②层析分离法
（3）荧光抗体的鉴定
F/P比率： F/P 将制备的荧光抗体稀释至A280≈1.0 A ≈1.0，分 别测读A280（蛋白质特异吸收峰）和标记 A 荧光素的特异吸收峰。
F/P值 F/P