填充床式生化反应器连续生产L_丙氨酸

图 1 L- 丙氨酸浓度对酶动力学的影响 图 2 固定化细胞填充床反应器装置图
2. 2 Pseudomonas dacunhae DQ-p1 固定化细胞填充床反应器的研究
采用填充床反应器进行连续化生产, 实验装置如图 2。并就反应器的尺寸进行了初步的考察, 见
表 1。
在上述反应器条件下, 使含有 0. 1mmol/ L 磷酸吡哆醛的 1 mol/ L L- 天冬氨酸( pH 6. 0) 于 37 以
得到停留时间 与转化率 x 之间的关系( 相关系数为 0. 99) :
即, = 37. 2x2 + 16. 4x + 72. 9Ln( 1- x )
从实验结果可知, 产物抑制为非竞争性抑制, 转化率达到 80%时, 停留时间为 71 min。转化率达到
第4期
余 斐等: 填充床式生化反应器连续生产 L- 丙氨酸
种子培养基: 蛋白胨 1% ; 酵母膏 0. 5% ; NaCl 1% ; 琼脂 2. 2% , 用氨水调 pH 7. 0, 培养温 度 37 , 250 ml 三角瓶装 40 ml 培养基摇床培养 8 h。
发酵培养基: 反丁烯二酸 1% ; 玉米浆 1% ; 蛋白胨 0. 7% ; KH2P O4 0. 1% ; M gSO4 7H2O , 0. 02% ; ( NH 4) 2SO 4 0. 5% , 用氨水调 pH7. 2~ 7. 5, 装液量为 250 ml 三角瓶装 50 m l 培养基, 温度 37 , 摇床培养 24 h。 1. 5 固定化细胞的制备方法
用 k- 卡拉胶法固定, 并用戊二醛等交联硬化处理。 1. 6 分析方法 1. 6. 1 固定化细胞 L- 天门冬氨酸- - 脱羧酶活力测定[ 5]
取相当于 0. 5 g 天然细胞的固定化细胞, 加入含有 0. 1 mmol/ L 的磷酸吡哆醛的 1mol/ L L- 天门冬氨酸( pH 6. 0) 的底物溶液 10 ml, 混合物于 37 保温振荡 30 min, 过滤终止反应, 生 成的 L- 丙氨酸用纸层析法定量测定, 并计算酶活力。在上述条件下, 1 个酶活单位定义为每克 湿细胞每小时从 L- 天门冬氨酸中脱羧产生的 L- 丙氨酸微克分子数。 1. 6. 2 丙氨酸含量测定
反丁烯二酸+ 氨 Aspartase L- 天冬氨酸 L- 天冬氨酸 L- aspartate- -dacarboxylase L- 丙氨酸+ CO2
表 2 不同方式下 L- 丙氨酸转化率的比较
L- 天冬氨酸 转化率/ %
1. 2 底 物 1. 2. 1 L- 丙氨酸生产用底物
1mol/ L L- 天冬氨酸、1 mmol/ L Mg2+ 、0. 1 mmol/ L 磷酸吡哆醛( PL P) 氨水调 pH 6. 0。 1. 2. 2 L- 天冬氨酸生产用底物
1mol/ L 反丁烯二酸、1 mmol/ L M g2+ 氨水调 pH 8. 5。 1. 3 试 剂
第 16 卷第 4 期 1 99 7年1 2月
大 连 轻 工 业 学院 学 报 Journal of Dalian Institute of L ight Industry
Vol. 16, N o. 4 Dec . 1 9 9 7
填充床式生化反应器连续生产 L-丙氨酸
余斐
金凤燮
( 大连轻工业学院食品工程系, 大连, 116001)
轻工总会基金资助项目( 轻科 94056 号) 收稿日期: 1997- 10- 30 余 斐: 男, 1972 年 8 月生, 97 年 4 月本院发酵工程硕士毕业, 现华中理工大学任教
80
大连轻工业学院学报
第 16 卷
1 材料与方法
1. 1 菌 体 Pseudomonas dacunhae DQ- p1 Escherichia coli SF- D4 本实验室保存的。
K m)dS -
SdS ]
et = -
KP Vm
[
K
m
(
K
P
+
S 0)
dS S
+
(KP +
S0 -
K m)( S1 -
S0) -
1 2
(
S
2 1
-
S02) ]
转化率 x = ( S0 - S 1)/ S0, S1/ S0 = 1- x 代入得:
et =
K2PVSm02( x 2-
x) -
KPK m ( KP + Vm
制。
L- 天冬氨酸 L-aspartate- -dacarboxylase L- 丙氨酸+ CO2
在考察 L- 丙氨酸浓度对酶活影响时发现 L- 丙氨酸存在严重的底物抑制, 结果如图 1。当 L- 丙氨酸浓度为 0. 2 mol/ L 时, 酶活急剧下降到 1900 酶活单位, 仅为原酶活的 1/ 3 左右, 说明 抑制作用非常强烈。当 L- 丙氨酸浓度达到 0. 8 mol/ L 时, 酶活仅仅剩 700 酶活单位。由于产 物抑制的存在, 使得在连续反应过程中, 后期转化率的提高将占用更长的时间。如何降低抑制 程度是缩短停留时间的关键。
展开剂: 正丁醇 醋酸( 36% ) 无水乙醇 水= 4 1 0. 5 0. 5; 显色剂: 0. 2% 印三酮丙酮溶 液; 洗脱剂: 0. 1% 硫酸铜 75% 乙醇溶液= 2 38; 新华一号滤纸。
2 结果与讨论
2. 1 Pseudomonas dacunhae DQ-p1 固定化细胞动力学的研究 固定化细胞 L- 天冬氨酸- - 脱羧酶催化 L- 天冬氨酸生成 L- 丙氨酸可看做单底物反应机
反应器 I
反应器
图 3 固定化细胞填充床反应器动力学
代
= - S1
S0
dS VmS
=-
KP Vm
S1 ( Km +
S0
S)(KP + S
P) dS
(Km +
S) (1+
P KP
)
P = S0 - S 代入, 可得:
et = -
KP Vm
S1 [K m( KP +
S0
S 0)
dS S
+
(KP +
S0 -
S0) Ln(1- x ) +
KP(KP +
S0 Vm
K m ) S0x
a0 =
K
PS
2 0
2 Vm
a1 =
KP(KP - Km)S0 Vm
a2 = -
KPKm ( KP + Vm
S0)
简化为, = a0x 2 + a1x + a2Ln( 1- x ) , 计算机拟合, 得: a0 = 37. 2, a1 = 16. 4, a2 = - 72. 9
83
90% 时, 停留时间为 110 min。转化率达到 95% 时, 停留时间为 175 min。固定化细胞效率为 0. 015g L-
丙氨酸/ g 固定化细胞 h, 反应器效率为 0. 13g L- 丙氨酸/ ml 反应器 h。
同时, 还发现反应器 的拟合效果不如反应器 I, 这可能由于反应器 I 的几何尺寸大于反应器 , 其
本文以经紫外线( UV) 、硫酸二乙酯( DES) 、甲基磺酸乙酯( EMS) 、亚硝基胍( NT G) 等常 规理化因子进行诱变得到的菌株 Pseudomonas dacunhae DQ- p1 为出发菌株, 将 k- 卡拉胶包埋 的固定化细胞增殖[ 3] , 消除固定化操作对酶的损伤不利影响; 并进一步提高单位体积固定化 细胞的浓度而无须增加菌体包埋量, 然后用戊二醛等交联硬化处理, 提高了固定化细胞的机械 强度; 结果使固定化细胞的稳定性增强, 延长了使用时间。并研究了反应器的几何尺寸对反应 速率的影响, 得到了反应器的数学模型, 为工业化生产提供了工艺上的参考, 也为工厂设备的 设计提供初步的计算及选型依据。
不同的流速上行流经反
表 1 填充床反应器规格
应器, 测定其转化率, 得图 3。反应器的停留时间 定 义为 = VR/ F
编号
反应器直径 mm
40 25
填充高度 mm
400 250
高径比
10 10
填充体积 ml
330 140
填充率 固定化细胞重量
%
g
66
357
61
104
百度文库
82
大连轻工业学院学报
式中: VR 为反应器的体积; F 为通过反应液的体 积流量。
发酵培养基: 谷氨酸 3% ; 蛋白胨 0. 9% ; 酪蛋白水解液 0. 5% ; KH2P O4 0. 05% ; M gSO47H2O 0. 01% , 用氨水调 pH7. 2, 装液量为 250 ml 三角瓶装 50 ml 培养基, 温度 30 ,
摇床培养 24 h。 1. 4. 2 Escher ichi a col i SF- D4 培养基
采用层析滤纸, 点样 0. 5~ 1 l, 用下述的溶剂和材料, 先平衡 8 h 再上行法展开 16 h, 自然 风干, 用 0. 2% 印三酮溶液显色, 干后热风烘 20 min, 将显色斑点剪成为 2. 5 3. 5 cm 纸片放
第4期
余 斐等: 填充床式生化反应器连续生产 L- 丙氨酸
81
入比色管, 加洗脱剂 5 ml 室温放置 1 h, 用 721 分光光度计在 520 nm 下测吸光度。参比用未显 色滤纸, 将测得的光密度在 L- 丙氨酸标准曲线上查其含量。
摘要 在酶法合成 L- 丙氨酸过程中, 产物 L- 丙氨酸对 酶有抑制作用。本 文
选用 PF R 型填 充床 式 反 应器, 以 k- 卡 拉 胶为 包 埋材 料, 包 埋 Pseudo monas dacunhae DQ- p1, 在 底物 为 1mol/ L L- 天 冬氨 酸, 反应 条件 37 、pH 6. 0 时, 连续生产 L- 丙氨酸。在转化率达到 95% 时, 计算出固定化细胞和反应 器 的效率分别为 0. 015 g L- 丙氨酸/ g 固定化细 胞 h、0. 013 g L- 丙氨酸/ ml 反应器 h。还建立了填充床反应器停留时间与转化 率的数学模 型进行系 统 仿真。并连接 Escher ichia coli SF- D4 和 Pseudomonas dacunhae DQ- p1 的 固 定化细胞柱式反应器, 试 验了从 石油裂解 副产 品反 丁烯二 酸连 续生产 L- 丙 氨酸。
传质和反应更为均匀一些, 与活塞流的理论模型更加接近所导致的。 2. 3 固定化 E. coli SF-D4 和 P. dacunhae DQ-p1 连续生产 L- 丙氨酸的研究
在确定 L- 丙氨酸酶法转化反应器选型和反应器动力学的基础上, 进一步研究了固定化大肠杆菌
和假单胞杆菌从石油裂解副产品反丁烯二酸两步 反应生成 L- 丙氨酸可行性。
在常态下, 对反应器作物料衡算:
第 16 卷
S 0 及 S1 各为进、出口处的底物浓度。以 d VR
微元体为考虑对象 FdS = v dVR
V R0
d VR F
=
S1 -
S0
ds v
可得,
dVR F
=
S
1-
S0
ds v
=
S1
-
S0
ds v
V=
(K m +
Vm S
S)( 1+
P KP
)
入, 并考虑填充床的持液率 , 则可得:
L-天门冬氨酸( 纯度 98% ) , 本院生化实验室提供; 反丁烯二酸, 山东周村有机化工厂; 磷 酸吡哆醛, Sigma 公司产品; 其他试剂均为分析纯、化学纯和生化纯。 1. 4 培 养 基 1. 4. 1 Pseudomonas dacunhae DQ- p1 培养基[ 4]
种子培养基: 蛋白胨 0. 25% ; 牛肉膏 0. 25% ; 酵母膏 0. 25% ; NaCl 0. 5% ; 琼脂 2. 2% , 用 氨水调 pH 7. 0, 培养温度 30 , 250 m l 三角瓶装 40 ml 培养基摇床培养 8 h。
关键词 固定化细胞; L- 丙氨酸; L- 天冬氨酸; 填充 床反应器 中图分类号 T Q 922. 2
L-丙氨酸为白色无味粉状晶体, 甜度为蔗糖的 70% 。由于在医药和食品工业上有广泛的 应用价值而需求量日益增大。L- 丙氨酸的生产方法经历了提取法、发酵法和利用 L- 天冬氨酸- 脱羧酶酶法转化等三种方式, 由于前两种方式产量低和出现 DL 型混合物, 使应用受到了限 制[ 1] 。随着 L- 天冬氨酸工业化生产的实现, L- 丙氨酸的酶法转化就显 示了极大的优越性。 1982 年日本田边株式会社首先实现了 L- 丙氨酸酶法生产的工业化[ 2] , 本文主要研究从石油裂 解副产品- 反丁烯二酸连续生产 L- 丙氨酸。在实验中发现 L- 丙氨酸酶法转化过程存在着严重 的产物抑制, 所以在反应器选型中根据产物抑制存在时 PFR 型优于 CST R 型的原则, 选取了 柱式填充床反应器。