实验免疫学技术

Remove the separation column from the magnet and flush out the retained cells as the positively selected cells
在几分钟内可以从复杂的细胞混 合物中分离高纯度细胞。细胞用 MACS 微型磁珠特异性标记，这 些细胞通过一个放在强而稳定磁 场中的分选柱。分选柱里的基质 造成一个高梯度磁场。被磁性标 记的细胞滞留在柱里而未被标记 的细胞则流出。当分选柱移出磁 场后，滞留柱内的磁性标记细胞 就可以被洗脱出来，这样就完全 可以获得标记和未标记的两个细 胞组份。
第一节 核酸分子杂交的探针标记
4. 标记物的选择：
–
–
放射性核素标记物： 32P、3H、35S等 非放射性核素标记物：

半抗原：生物素、地高辛等 配体：生物素是亲和素的配体，故还可用生物素-亲和素反应进 行杂交信号的检测


荧光素：FITC、罗丹明等，可以通过紫外线激发出荧光而被检测 化学发光探针：一些标记物可与某些物质反应发生化学发光现象。 通过化学发光可以像放射性核素一样直接使X-线胶片上的乳胶颗 粒感光。


第三节 流式细胞术
流式细胞仪的特点：
单个细胞分析

同时多参数分析 速度快：10000个细胞/秒
统计学意义：提供细胞群体的均值和分布情况
分选感兴趣的细胞
第三节 流式细胞术
工作原理：

流式细胞术（Flow Cytometry, 简称FCM,又名FACS）是一种 可以快速、准确、客观，并且同时检测单个微粒（通常是细胞） 的多项特性的技术，同时可以对特定群体加以分选 研究对象为生物颗粒，如各种细胞、染色体、微生物、及人工合 成微球等 研究的微粒特性包括多种物理及生物学特征，并加以定量
第一节 核酸分子杂交的探针标记
4. 标记方法的选择：
– 体内标记法
– 体外标记法

不需要活体生物或细胞培养系统 标记前的分离和纯化方便，可以用时再标记，减少放射性 核素污染 体外标记一般比体内标记的比放射活性高很多
第一节 核酸分子杂交的探针标记

DNA探针的酶促标记法
– 缺口平移法
– 随机引物法
免疫学其他实验技术

核酸分子杂交的探针标记,Southern 印迹杂交 聚合酶链反应--------免疫PCR 流式细胞术 蛋白质芯片 免疫传感器 免疫磁珠技术 动物模型
第四节 蛋白质芯片技术

Microarray 或 Biochip （生物芯片）是一种 微型多参数生物传感器。它通过在一微小的基 片表面固定大量的分子识别探针，或构建微分 析单元和系统，实现对化合物、蛋白质、核酸、 细胞或其它生物组分准确、快速、大信息量的 筛选或检测。
应用于免疫学的分子生物学技术
应用于免疫学的其他分子生物学技术

核酸分子杂交 聚合酶链反应--------免疫PCR 流式细胞术 蛋白质芯片 免疫传感器 免疫磁珠技术 动物模型
第一节 核酸分子杂交的探针标记
1. 特点：
– 免疫学在分子水平发展的一门技术
– 定性、定量检测特异DNA或RNA序列片段
点抗原测抗体
3.检测标本中的抗体或抗原
点抗体测抗原
渗滤式蛋白芯片
反应完毕后0.5小时内，将晶片放入晶片放入晶片阅 读系统进行阅读分析
第四节 蛋白质芯片技术
蛋白质芯片的应用：
– 微生物感染－病原体抗原、抗体的检测 – 自身抗体的检测 – 特定蛋白的检测

HLA分型
过敏原检测
– 肿瘤标志物的检出
亲合素
生物素标记的指示分子DNA PCR 定性和定量分析NPY
第二节 聚合酶链反应

IM-PCR的应用和发展
–
IM-PCR目前尚处于研究阶段，尚未有一个十分成熟 和忙一的方法,配套试剂尚缺乏,所以应用得尚不多。 适用于检测一些含量特别少的抗原分子；
–
免疫学其他实验技术

核酸分子杂交的探针标记,Southern 印迹杂交 聚合酶链反应--------免疫PCR 流式细胞术 蛋白质芯片 免疫传感器 免疫磁珠技术 动物模型
第二节 聚合酶链反应

PCR工作原理
– 简单理解为2n级数扩增模板
– 三步过程：变性、退火、链延伸
– PCR产物的检测方法

PCR类型
– 一般PCR
Biblioteka Baidu– 反转录PCR – 定量PCR
检测病原体基因
第二节 聚合酶链反应

定量PCR
– 半定量PCR – 实时PCR,又称荧光定量PCR
常规PCR基础上运用荧光能量传递技术，加入荧光标 记探针，借助荧光信号来检测PCR产物。提高了灵敏度， 还可以做到PCR每循环一次就收集一个数据，建立实时扩 增曲线，准确地确定CT值，根据CT值确定起始DNA的拷贝 数，做到真正意义上的DNA定量。
– 实验方法：
IM-PCR指示分子DNA的制备：
3型腺病毒感染HeLa细胞，细胞病变达100%
提取病毒DNA
基因亚克隆
质粒纯化后酶切线形化
加入生物素化dUTP， dATP ， dCTP ， dGTP ，用Klenow 聚合酶合成生物素化DNA
双抗体夹心IM-PCR：
包被NPY单克隆抗体 封闭 加入不同稀释度的NPY抗原 加入NPY多克隆抗体 加入生物素化羊抗兔IgG
第一节 核酸分子杂交的探针标记
2. 原理：
具有一定同源性的 两条核酸单链在一定条 件下按碱基互补配对原 则退火形成双链的过程。 杂交的双方是探针与待 测核酸，杂交后形成的 异质双链分子称为杂交 分子。由于杂交是在分 子水平进行的，故称为 分子杂交。
第一节 核酸分子杂交的探针标记
3. 探针：
– cDNA探针
Pass the mixture of labeled and unlabeled cells over a separation column placed in the magnetic field of a MACS separator. Collect the flow through as the nonmagnetic fraction.
– RNA探针
第一节 核酸分子杂交的探针标记
3. 探针：
– RNA探针：
将目的基因克隆到Sp6或T7启动子下游的MCS中，
用适当的限制性内切酶在插入序列的下游消化重组质 粒，使之线性化，加入Sp6或T7 RNA聚合酶、NTP和 [α-32P]-UTP，即可以目的基因的DNA为模板合成高放 射性的RNA探针。
基因芯片实验程序
基因芯片实验程序
Gene chips的应用



病原体的检出 肿瘤相关基因表达谱 位点突变 遗传性疾病 测序 耐药基因检测 疾病的分子分型 HLA分型
免疫学其他实验技术

核酸分子杂交的探针标记,Southern 印迹杂交 聚合酶链式反应--------免疫PCR 流式细胞术 蛋白质芯片 免疫传感器 免疫磁珠技术 动物模型
第三节 流式细胞术

流式免疫荧光技术的应用：
–
–
免疫学：研究细胞周期或DNA倍体与细胞表面受体及抗原表 达的关系；进行免疫活性细胞的分型与纯化；分析淋巴细胞 亚群与疾病的关系；免疫缺陷病如艾滋病的诊断；器官移植 后的免疫学监测等。 血液学：血液细胞的分类、分型，造血细胞分化的研究，血 细胞中各种酶的定量分析，如过氧化物酶、非特异性酯酶等； 用NBT及DNA双染色法可研究白血病细胞分化成熟与细胞增 殖周期变化的关系，检测母体血液中Rh(+)或抗D抗原阳性细 胞，以了解胎儿是否可能因Rh血型不合而发生严重溶血；检 测血液中循环免疫复合物可以诊断自身免疫性疾病，如红斑 狼疮等。
第三节 流式细胞术

流式免疫荧光技术的应用：
– –
测量细胞大小、内部颗粒的性状 检测细胞表面和细胞浆抗原、细胞内DNA、RNA 含量等
第三节 流式细胞术

流式免疫荧光技术的应用：
–
–
细胞生物学：细胞凋亡研究；定量分析细胞周期并分选 不同细胞周期时相的细胞；分析生物大分子如DNA、 RNA、抗原、癌基因表达产物等物质与细胞增殖周期 的关系 肿瘤学：DNA倍体含量测定是鉴别良、恶性肿瘤的特 异指标。近年来已应用DNA倍体测定技术，对白血病、 淋巴瘤及肺癌、膀胱癌、前列腺癌等多种实体瘤细胞进 行探测。
– 基因组探针
– 寡核苷酸探针 – RNA探针
第一节 核酸分子杂交的探针标记
3. 探针：
– cDNA探针
mRNA→逆转录cDNA →插入适当载体→转入细菌
进行质粒扩增→限制性内切酶消化释放插入片段
第一节 核酸分子杂交的探针标记
3. 探针：
– cDNA探针
– 基因组探针
– 寡核苷酸探针


人工合成 根据氨基酸序列推导出核酸序列
免疫学其他实验技术


核酸分子杂交的探针标记 Southern 印迹杂交 聚合酶链反应--------免疫PCR 流式细胞术 蛋白质芯片 免疫磁珠技术 免疫传感器 动物模型
Label the cells of interest with MACS MicroBeads in a short incubation step.


将待测细胞染色后制成单细 胞悬液。用一定压力将待测 样品压入流动室，不含细胞 的磷酸缓冲液在高压下从鞘 液管喷出，鞘液管入口方向 与待测样品流成一定角度， 这样鞘液就能够包饶着样品 高度流动，组成一个圆形的 流束，待测细胞在鞘液的包 被下单行排列，依次通过检 测区域。
第三节 流式细胞术
• 液流系统 • 光学系统 激光光源 光集中系统 • 电子系统 光电转换 数据处理系统
–
–
固相支持物￫包被单克隆抗体￫抗原￫多克隆抗体￫生物素 化抗抗体￫亲合素￫生物素化DNA ￫PCR
第二节 聚合酶链反应

实验举例IM-PCR检测NPY
– 实验材料：
亲合素，生物素化dUTP，生物素化羊抗兔IgG， NPY标准品，NPY单克隆抗体、NPY多克隆抗体、腺 病毒六邻体基因引物，3型腺病毒
– PCR法 – 末端标记法
第一节 核酸分子杂交的探针标记

非放射性核素探针的Southern印迹杂交
地高辛标记检测试剂盒，此体系是将具有类固醇半 抗原性质的地高辛配基标记的dUTP用随机引物法掺入到 探针DNA链上，然后与靶DNA上的同源序列进行杂交，加 入碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体，在底物硝基蓝四氮 唑（NBT)和BCIP存在下，进行酶联免疫显色反应，从而 到达检测目的。
第三节 流式细胞术

是对单细胞进行定量分析和分选的一种自动分析细胞的高新技术， 被誉为实验室的“CT”。

流式细胞仪（flow cytometer，FCM）是集现代电子物理技术、 激光技术、电子计算机技术于一身的先进科学仪器
流式细胞定量技术与传统的免疫学方法相结合，进行细胞表面抗 原、癌基因抗原、其他细胞内抗原、细胞受体及其他成分检测， 弥补了传统免疫学难以准确定量的弊端，已初步形成一个独特的 学科分支——流式免疫学 荧光激活细胞分类仪（fluorescence activated cell sorter， FACS）
指示分子DNA连接起来，再通过PCR扩增指示分子， 根据PCR产物的量间接的检测抗原的量。
第二节 聚合酶链反应

IM-PCR的几种反应方式：
–
固相支持物￫抗原吸附￫特异性抗体￫生物素化抗抗体￫亲 合素￫生物素化DNA ￫PCR 固相支持物￫抗原吸附￫特异性抗体￫SPA生物素蛋白￫亲 合素￫生物素化DNA ￫PCR
2.pGEX-CT703 3.PCR product
第二节 聚合酶链反应

免疫聚合酶链反应，immuno-PCR，IM-PCR
– 将抗原、抗体反应与PCR结合构成的一种新技术，
其原理和过程基本类似ELISA，不同的是PCR放大系 统取代了酶标记的催化放大反应。
– 需要一个中间的连接分子将抗原、抗体复合物与一
第四节 蛋白质芯片技术
生物芯片的主要类别:
– 蛋白芯片 – 基因芯片 – 芯片实验室
蛋白芯片的原理
1.将抗原或抗体交联（UV）或吸附在膜上
2. 抗体或抗抗体标记示踪
– –
酶：HRP、AKP 胶体金
–
荧光素：Cy3、Cy5、FITC、RB200、藻胆蛋白等
3.检测标本中的抗体或抗原
点抗原测抗体
3.检测标本中的抗体或抗原
第二节 聚合酶链反应 荧光定量PCR技术：
是指在PCR反应体系中加入荧光基团， 利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，
最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的
方法。
第二节 聚合酶链反应
PCR的应用举例
–质粒鉴定 –基因亚克隆
质粒鉴定
1.Fragments digested by EcpRI and Not I