苯酚_硫酸比色法测定多糖含量
多糖含量测定实验报告
一、实验目的1. 掌握多糖含量测定的原理和方法。
2. 熟悉实验仪器的操作。
3. 培养实验操作技能和数据分析能力。
二、实验原理多糖是一类由多个单糖分子通过糖苷键连接而成的生物大分子。
多糖含量测定常用的方法有苯酚-硫酸法、蒽酮-硫酸法等。
本实验采用苯酚-硫酸法测定多糖含量，其原理是：在酸性条件下，多糖与苯酚发生缩合反应，生成紫色化合物，通过比色法测定其吸光度，从而计算出多糖含量。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 标准葡萄糖溶液（浓度已知）- 标准多糖溶液（浓度已知）- 待测多糖样品- 苯酚、硫酸、盐酸等试剂2. 实验仪器：- 紫外可见分光光度计- 电子天平- 恒温水浴锅- 移液器- 离心机- 烧杯、试管、容量瓶等四、实验步骤1. 准备标准曲线：- 取7支试管，分别加入0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6mL标准葡萄糖溶液，用蒸馏水定容至1mL。
- 每支试管加入0.5mL苯酚-硫酸混合液，混匀，置于恒温水浴锅中加热10分钟。
- 取出冷却，加入5mL蒸馏水，混匀。
- 以蒸馏水为空白，在波长620nm处测定吸光度，绘制标准曲线。
2. 测定待测多糖样品：- 取3支试管，分别加入0.1mL待测多糖样品、0.1mL标准多糖溶液和0.1mL 蒸馏水，用蒸馏水定容至1mL。
- 每支试管加入0.5mL苯酚-硫酸混合液，混匀，置于恒温水浴锅中加热10分钟。
- 取出冷却，加入5mL蒸馏水，混匀。
- 以蒸馏水为空白，在波长620nm处测定吸光度。
3. 计算待测多糖含量：- 根据待测多糖样品的吸光度，从标准曲线中查得相应的葡萄糖浓度。
- 根据待测多糖样品的体积和浓度，计算待测多糖含量。
五、实验结果与分析1. 标准曲线的绘制：- 标准曲线呈线性关系，相关系数R²=0.999。
2. 待测多糖含量的测定：- 待测多糖样品的吸光度为0.632，查得相应的葡萄糖浓度为0.5mg/mL。
3. 待测多糖含量的计算：- 待测多糖含量为0.5mg/mL。
苯酚硫酸法测多糖
采用硫酸-苯酚法测定多糖含量[10-11]。
标准曲线的制作：精确称取经干燥至恒重的标准葡萄糖10mg，用蒸馏水定容至100mL，分别吸取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8mL，各以蒸馏水补至2mL，然后加入6%苯酚水溶液1.0mL，再迅速加入浓硫酸5.0mL，水浴15分钟后显色彻底，在冷水中冷却，至室温后在波长490nm处测定吸光度，以水代替糖溶液作空白对照，以吸光度为纵坐标，葡萄糖含量为横坐标制作标准曲线。
样品测定：取定容液1mL于试管中，稀释10倍即加入蒸馏水9mL得样品液，吸取该多糖样品溶液1mL按标准曲线制作步骤操作，测吸光度，以标准曲线计算多糖含量。
表2 葡萄糖标准曲线设计方案
根据以上表格数据作葡萄糖标准曲线，如下：。
苯酚-硫酸比色法测定多糖含量
苯酚-硫酸比色法测定多糖含量
苯酚-硫酸法是常用的多糖含量测定方法之一。
该方法基于多糖在硫酸的作用下，与苯酚产生颜色反应的原理，利用光度计测定反应产物的吸收值，从而计算出多糖的含量。
步骤如下：
1. 取样品0.1g，在50ml锥形瓶中加入5ml去离子水，振荡
20min溶解。
2. 加入2ml 5%苯酚水溶液，振荡均匀。
3. 加入5ml浓硫酸，使用磁力搅拌器搅拌1-2min。
4. 将混合物放置在冷水中冷却10min。
5. 用紫外分光光度计在490nm处测定吸光度A，同时以含有相同试验液体积的去离子水为对照。
6. 计算样品中多糖含量。
该方法测定简便，精度高，适用于多糖含量较高的样品。
但此法不能区分多糖的种类及其组成，不能应用于含非多糖的样品中。
改良的苯酚_硫酸法测定多糖和寡糖含量的研究
了几种单糖对葡萄糖的吸光度校正系数 k′i, 并用它们计算寡糖或多糖的 含量。结 果: 对 4 种寡糖和 4 种多糖 ( 包括
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Chin P harm J , 1996 Sep tember , Vol . 31 No. 9 中国药学杂志 1996 年 9 月第 31 卷第 9 期
速, 用于甘草酸的定量研究更为准确, 有较高准
确度及精密度, 能准确地反映制剂中甘草酸的
含量, 可用于质量控制。 3. 3 实验结果表明: x- 为 99. 7% , s 为1. 97% ,
RSD 为 1. 8% , 实验精密度 高, 符合统计 学原
理。
同时, 根据药品质量及生物测定的要求, 在
概率( P = 0. 95) [ 4] 下, 可信度及可 信限率分别
浓度呈线性关系, 从而可用比色法测定其含量。 copyranose) 为 Sigma 产品。可溶性淀粉( 中国
对于匀多糖, 可直接以其组成糖作标准曲 线[ 4] 。但对于由不同糖残基构成的杂多糖, 情况
医药公司) , 经 Sephadex G-200 凝胶过滤柱层 析进一步纯化。香菇多糖( lent inan) 、酵母甘露
RSD (% )
0. 8 0. 6 1. 3 1. 2 1. 1 0. 9 0. 7
3 结果与讨论 3. 1 甘草制剂是一种多组分的复合制剂, 在本 文实验条件下, 其它组分不干扰甘草酸的分离 与测定。 3. 2 甘草酸有效成分的提取是利用甘草酸的 溶解性, 即甘草酸易溶解于热醇、热水溶液, 加 之利用超声波而提取。处理方法简单, 测定迅
酸的含量, 用对照品加入量计算回收率, 平均回 收率 99. 7% , RSD 为 1. 8% 。 2. 2. 4 精 密度 实 验: 取不 同 浓 度 8, 12, 18 mg/ 10 ml 的标准溶液, 各进样 10 次, 测得日内 RS D。取不同浓度 8, 12, 18 mg/ 10 ml 的标准溶 液, 样品每天测定 1 次, 进样 10 Ll, 连续 5 d, 求 得日间 RS D。结果见表 1。
硫酸苯酚法测多糖原理
硫酸苯酚法测多糖原理
硫酸苯酚法测多糖是一种常用的多糖测定方法，其原理基于多糖与硫酸苯酚反应产生显色化合物的特性。
在测定中，首先将待测样品中的多糖加入到试管中。
然后，向试管中逐渐加入浓硫酸，并快速而彻底地混合。
硫酸的加入会引发多糖与硫酸之间的酸水解反应，生成大量的醛基。
随后，加入苯酚试剂，苯酚与醛基反应生成的有色化合物会根据多糖的种类和含量而呈现出不同的颜色。
颜色的深浅可以通过分光光度计进行测量，从而得到多糖样品中多糖含量的定量结果。
该方法的优点是简单、快速，且对多糖具有较好的选择性。
然而，需要注意的是，在进行测定时应严格控制硫酸和苯酚试剂的加入量和混合程度，以避免反应过程中的误差产生。
总结起来，硫酸苯酚法是一种常用的测定多糖含量的方法，通过多糖与硫酸和苯酚的反应生成有色化合物来实现多糖的测量。
苯酚_硫酸比色法测定多糖含量
随着对生物药物、天然药物和保健食品研究的深入，多糖的研究进展很快。
目前多糖含量的测定方法尚无统一标准，广泛应用的是苯酚－硫酸比色法。
该法具有简单、快速、无需多糖纯品和贵重仪器等优点，且对水溶性样品和非水溶性样品均可测定。
１ 苯酚－硫酸比色法原理苯酚－硫酸比色法测定多糖含量是由Ｄｕｂｏｉｓ等［１，２］提出的。
其原理是：多糖或寡糖被浓硫酸在适当高温下水解，产生单糖，并迅速脱水成糠醛衍生物，该衍生物在强酸条件下与苯酚起显色反应，生成橙黄色物质，在波长４９０ｎｍ处和一定浓度范围内，其吸光度Ａ值与糖浓度Ｃ呈线性关系，从而可用比色法测定其含量。
２ 实验方法２．１ 标准溶液的配制精密称取１０５℃下干燥至恒重的葡萄糖约１００．０ｍｇ，置１００ｍＬ量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，配得葡萄糖标准溶液。
２．２ 供试品贮备液的配制将样品进行适当处理（如真空干燥、回流提取等，根据各品种不同而有差异），取适量，按一定比例稀释，配制供试品贮备液。
２．３ 苯酚溶液的配制称取苯酚１００ｇ，加铝片０．１ｇ和碳酸氢钠０．０５ｇ，常压蒸馏，收集（１８０±２）℃馏分。
精密称取该馏分约１０．０ｇ置于２００ｍＬ量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀后转置于棕色试剂瓶中，即得苯酚溶液，将其置于冰箱中备用。
２．４ 测定条件选择２．４．１ 反应温度选择 精密吸取供试品贮备液、葡萄糖标准液各１．０ｍＬ于１００ｍＬ量瓶中，用水稀释至刻度，分别作为供试品溶液和对照品溶液。
分别吸取供试品溶液１．０ｍＬ于两个具塞试管中，各加苯酚液１．０ｍＬ，并分别迅速滴加浓硫酸５．０ｍＬ。
一份于水浴中煮沸１５ｍｉｎ，另一份于４０℃水浴中恒温３０ｍｉｎ。
另取两份对照品溶液１．０ｍＬ同上操作。
取出，冷却至室温，１５ｍｉｎ后于４９０ｎｍ处测其Ａ值，选取Ａ较高的作为实验温度。
２．４．２ 苯酚及硫酸用量选择 分别吸取供试品液和对照品液１．０ｍＬ５份，各加入苯酚液０．２，０．４，０．６，０．８，１．０ｍＬ，加水至２．０ｍＬ，再各滴加浓硫酸５．０ｍＬ，４０℃恒温３０ｍｉｎ后，测其Ａ值，从苯酚液加入量达到某一值开始，Ａ值基本保持不变，说明苯酚液量达到该值以上时，反应都能完成。
实验一硫酸苯酚法测多糖含量
实验一硫酸苯酚法测多糖含量The pony was revised in January 2021实验一硫酸－苯酚法测多糖含量1．目的要求? 测量蒽酮硫酸法不能测量的血清型的过程样品中的多糖含量2．2．方法原理3．糖在浓硫酸作用下，水解生成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，然后与苯酚缩合成橙黄色化合物，且颜色稳定，在波长490 nm处和一定的浓度范围内，其吸光度与多糖含量呈线性关系正比，从而可以利用分光度计测定其吸光度，并利用标准曲线定量测定样品的多糖含量，本方法可用于多糖、单糖含量的测定。
4．3．主要实验仪器及材料5．浓硫酸，苯酚，蒸馏装置，分光光度计，电子天平，坐标纸或电脑等。
6．４．掌握要点7．硫酸显色的安全、准确操作，单糖到多糖的转换系数。
8．５．试剂配制9．1）葡萄糖标准液的配制10．准确称取干燥恒重的葡萄糖100 mg，蒸馏水准确定容至100 mL的1 mg/L的葡萄糖液，摇匀后准确吸取10 mL该溶液，蒸馏水稀释定容至100 mL,即得100 ug/mL的葡萄糖标准液。
11．2）90%苯酚液的配制12．?准确移取苯酚90mL，蒸馏水定容至100 mL，即得90％苯酚液，棕色瓶中避光保存3）6%苯酚液的配制将90%苯酚液稀释至6%，即一体积储存液对应十四体积纯水，临用现配。
6.实验步骤表1 标准曲线的制作步骤7.管号 0? 1 2 3 4 5 6 78.葡萄糖9.10.苯酚液11.浓硫酸?12.取8支干净的具塞试管按表2方法在操作，先在冰水浴中加入的苯酚溶液，震荡摇匀后缓慢逐滴加入纯硫酸，以不放热或微量放热为宜，摇匀后恒温加塞沸水放置20min,取出凉水冷却10min,以0号作为空白调零,在最大吸收波长处（490nm）测定吸光度。
以葡萄糖浓度X为横坐标（ug/mL），吸光度Y为纵坐标，从而来绘制标准曲线。
用exceL 软件求得回归方程13.2）待测样品多糖的测定与计算14.将提取得到的待测多糖用蒸馏水溶解，定容至100 mL,取溶解后的溶液，按标准曲线中的测定方法，以样液为参比液，测定溶液的吸光值，按回归方程计算待测溶液的多糖浓度，注意乘换算系数。
苯酚-硫酸法测多糖含量
苯酚-硫酸法测多糖含量原理多糖在硫酸的作用下先水解成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，然后与苯酚生成橙黄色化合物。
再以比色法测定。
试剂1．浓硫酸：分析纯，95.5%2． 80%苯酚：80克苯酚（分析纯重蒸馏试剂）加20克水使之溶解，可置冰箱中避光长期储存。
3． 6%苯酚：临用前以80%苯酚配制。
（每次测定均需现配）4．标准葡聚糖（Dextran,瑞典Pharmacia）,或分析纯葡萄糖。
5． 15%三氯乙酸（15%TCA）：15克TCA加85克水使之溶解，可置冰箱中长期储存。
6． 5%三氯乙酸（5%TCA）：25克TCA加475克水使之溶解，可置冰箱中长期储存。
7． 6mol/L 氢氧化钠：120克分析纯氢氧化钠溶于500ml水。
8． 6mol/L 盐酸操作1．制作标准曲线：准确称取标准葡聚糖（或葡萄糖）20mg于500ml容量瓶中，加水至刻度，分别吸取0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6及1.8ml,各以蒸馏水补至2.0ml，然后加入6%苯酚1.0ml及浓硫酸5.0ml,摇匀冷却，室温放置20分钟以后于490nm测光密度，以2.0ml水按同样显色操作为空白，横坐标为多糖微克数，纵坐标为光密度值，得标准曲线。
2．样品含量测定：①取样品1克（湿样）加1ml 15%TCA溶液研磨，再加少许5％TCA溶液研磨，倒上清液于10毫升离心管中，再加少许5％TCA溶液研磨，倒上清液，重复3次。
最后一次将残渣一起到入离心管。
注意：总的溶液不要超出10毫升。
（既不要超出离心管的容量）。
②离心，转速3000转/分钟，共三次。
第一次15分钟，取上清液。
后两次各5分钟取上清液到25毫升锥形比色管中。
最后滤液保持18毫升左右。
（测肝胰腺样品时，每次取上清液时应过滤。
因为其脂肪含量大容易夹带残渣。
）③水浴，在向比色管中加入2毫升6mol/L 盐酸之后摇匀，在96℃水浴锅中水浴2小时。
④定容取样。
水浴后，用流水冷却后加入2毫升6mol/L 氢氧化钠摇匀。
实验一、硫酸苯酚法测多糖含量
实验一硫酸-苯酚法测多糖含量1. 目的要求测量蒽酮硫酸法不能测量的血清型的过程样品中的多糖含量2•方法原理糖在浓硫酸作用下，水解生成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，然后与苯酚缩合成橙黄色化合物，且颜色稳定，在波长490 nm处和一定的浓度范围内，其吸光度与多糖含量呈线性关系正比，从而可以利用分光度计测定其吸光度，并利用标准曲线定量测定样品的多糖含量，本方法可用于多糖、单糖含量的测定。
3•主要实验仪器及材料浓硫酸，苯酚，蒸馏装置，分光光度计，电子天平，坐标纸或电脑等。
4.掌握要点硫酸显色的安全、准确操作，单糖到多糖的转换系数。
5 .试剂配制1）葡萄糖标准液的配制准确称取干燥恒重的葡萄糖100 mg,蒸馏水准确定容至100 mL的1 mg/L的葡萄糖液，摇匀后准确吸取10 mL该溶液，蒸馏水稀释定容至100 mL,即得100 ug/mL的葡萄糖标准液。
2）90%苯酚液的配制准确移取苯酚90mL，蒸馏水定容至100 mL,即得90 %苯酚液，棕色瓶中避光保存3）6%苯酚液的配制将90%苯酚液稀释至6%，即一体积储存液对应十四体积纯水，临用现配。
6.实验步骤表1标准曲线的制作步骤AvV 口吕号0 1 2 3 4 5 6葡萄糖0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.6 0.8 1.0苯酚液0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5浓硫酸 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0取8支干净的具塞试管按表 2方法在操作，先在冰水浴中加入 0.5ml的苯酚溶液，震荡摇匀后缓慢逐滴加入纯硫酸，以不放热或微量放热为宜，摇匀后恒温加塞沸水放置20mi n, 取出凉水冷却10min,以0号作为空白调零，在最大吸收波长处（490nm）测定吸光度。
以葡萄糖浓度X为横坐标（ug/mL），吸光度Y为纵坐标，从而来绘制标准曲线。
用 exceL软件求得回归方程2）待测样品多糖的测定与计算将提取得到的待测多糖用蒸馏水溶解，定容至100 mL,取溶解后的溶液，按标准曲线中的测定方法，以样液为参比液，测定溶液的吸光值，按回归方程计算待测溶液的多糖浓度，注意乘换算系数。
糖含量测定-苯酚硫酸法
1．1原理
多糖可以被浓硫酸在适当高温下水解，产生单糖，并迅速脱水成糠醛衍生物，该衍生物在强酸条件下与苯酚起显色反应，生成橙黄色物质，在波长490nm处和一定浓度范围内，其吸光度值与糖含量呈线性关系，从而可用比色法测定其含量。
1．2实验步骤
1．2．1100μg/ml D-葡萄糖对照品溶液制备
精密称取10mg D-葡萄糖，加纯化水充分溶解，定容至100ml，作为对照品溶液。
1．2．26%苯酚溶液配制
称取6g苯酚，加入纯化水充分溶解，定容至100ml，备用。
1．2．3对照品管制备
取8支试管，按下表按下表加入100μg/ml D-葡萄糖对照品溶液：
1．2．4供试品管制备
将供试品采用纯化水稀释至D-葡萄糖标准曲线范围内，每步稀释应不超过10倍。
10倍及以内的稀释直接在玻璃试管中进行。
10倍稀释用移液器量取供试品100μl，加纯化水900μl，振荡混匀。
原倍稀释直接取供试品1.0ml加入玻璃试管中。
10倍以内稀释操作按下表在试管中加入相应溶液。
大于10倍的稀释需按下表操作在离心管中先做10倍或100倍稀释（2步10倍稀释）后，再在玻璃试管中按照下表量取稀释。
更高稀释倍数也按照上述原则进行。
1．2．5试验操作
向含有1ml标对照品和供试品的试管中加入0.6ml 6%苯酚溶液，混匀，迅速加入3ml浓硫酸，混匀，置沸水浴反应20分钟。
显色后，冷却至室温，依据紫外-可见分光光度计标准操。
苯酚硫酸法测多糖含量
一、硫酸苯酚法测多糖含量 1、试剂配制1. 浓硫酸：分析纯，95.5%2. 5%苯酚：取苯酚5 g ，置100 ml 容量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀后，置棕色试剂瓶中，冰箱中冷藏储存备用。
3. 标准葡聚糖（Dextr a n,瑞典Pharm a cia ）或分析纯葡萄糖。
准确称取20m g 经105℃干燥至恒重的葡萄糖标准品于500ml 容量瓶中，蒸馏水溶解定容。
2、制作标准曲线准确称取标准葡聚糖（或葡萄糖）10mg 于250ml 容量瓶中，加水至刻度，分别吸取0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8及0.9ml ，各以蒸馏水补至1.0ml ，然后加入5%苯酚1ml 及浓硫酸5.0ml,摇匀冷却，室温放置20min 以后于490n m 测光密度，以1.0ml 水按同样显色操作为空白，横坐标为多糖微克数，纵坐标为光密度值，得标准曲线。
12 3 4 5 6 7 8 0 标准葡萄糖溶液（mL ） 0.20.30.40.50.60.70.80.9蒸馏水（mL ） 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 1.0 5%苯酚（mL ） 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 浓硫酸（mL ） 2.52.52.52.52.52.52.52.52.5葡萄糖标准曲线y = 54.353x + 0.0018R 2 = 0.999400.10.20.300.0010.0020.0030.0040.0050.006葡萄糖浓度（mg/ml）吸光值3 注意事项（1）此法简单、快速、灵敏、重复性好，对每种糖仅制作一条标准曲线，颜色持久。
（2）制作标准线宜用相应的标准多糖，如用葡萄糖，应以校正系数0.9校正μg 数。
（3）对杂多糖，分析结果可根据各单糖的组成比及主要组分单糖的标准曲线的校正系数加以校正计算（4）测定时根据光密度值确定取样的量。
苯酚-硫酸法测定胞外多糖含量 标准作业指导书
产品质量胞外多糖的测定
1 目的
依据有关方法和标准，建立公司测量土壤中胞外多糖的标准方法。
2 适用范围
本文件规定了测定胞外多糖含量的苯酚-硫酸法。
本实验采用苯酚-硫酸法，该实原理是：浓硫酸水合产生的高温快速分解多糖产生单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，生成的糖醛衍生物又与苯酚反应生成橙黄色化合物，再以比色法测定
本标准适用于蓝藻门、绿藻等藻类胞外多糖的测定。
3 参考文件
无
4 定义
胞外多糖(Exopolysaccharides, EPS)：是一些特殊微生物在生长代谢过程中分泌到细胞壁外、易与菌体分离、分泌到环境中的水溶性多糖，属于微生物的次级代谢产物。
5 职责
5.1 测试工程师依照国家标准的更新、或者方法的改良，不定期更新本文件。
5.2 测试工程师应当对测试人员进行培训、考核、上岗认定和定期技能查验，对于技能不达标的人员予以相关处理。
5.3 测试人员应当严格依照本文件方法测定相关样品的胞外多糖含量，保证安全的情况下，认真仔细地完成实验。
6 程序
6.1 试剂和材料
表1 准备试剂和材料清单
表2 混合材料和溶液配置清单
6.2 仪器设备
表3 仪器设备清单
6.3 操作流程表
6.4 具体操作流程
7 附件
附件1《实验室测试报告》。
苯酚—硫酸法测多糖
苯酚-硫酸法测多糖
实验结果
CL菌株在发酵过程中并不产胞外多糖，可以断定 抗菌物质不是多糖。 但是利用 Bradford 法测蛋白质，发酵前后蛋白质 含量有明显变化，但是并不能断定抗菌物质是蛋 白质类，有可能是 CL菌株产的胞外蛋白酶类，使 蛋白质含量发生变化。为探索其物质可能还需要 进一步验证
实验步骤
苯酚—硫酸法测多糖
试剂：
（1）90%的苯酚溶液：
称取90克苯酚，加蒸馏水10ml，在室温下可保存数月
（2）9%苯酚溶液： 取3ml 90%苯酚溶液，加蒸馏水30ml，现配现用 （3）浓硫酸
实验步骤
苯酚—硫酸法测多糖
2ml（水、空白培养基、无菌发酵液）+1ml 9% 苯酚+5mFra bibliotek 浓硫酸 =8ml
恒温条件下，30min后测A485nm
实验步骤
Bradford法测蛋白
试剂：
Bradford储存液 100ml 95%乙醇 200ml 88%磷酸 350mg Serva G蓝 Bradford 工作液 425ml 双蒸水 15ml 95%乙醇 30ml 88%磷酸 30ml Bradford贮存液 Whatman 1号滤纸过滤，保温 与室温棕色瓶中，可使用数周， 但使用前需要过滤
2min测A595 1h内完成
室温下长期保持稳定
100µl蛋白质溶液+1ml 工作液
实验步骤
培养温度与初始pH对抑菌效果的影响:
1. 取 OD=0.4 的 CL 菌株 1ml 分别接入初始 pH 为 4.0 、 5.5 、 7.0 、 8.5 的 100ml 海水牛肉膏蛋白胨培养基 中，25℃ 170r/min振荡培养4d
实验结果
苯酚-硫酸法测定当归提取物中的多糖含量
苯酚-硫酸法测定当归提取物中的多糖含量【摘要】目的测定当归提取物中的多糖含量。
方法采用苯酚—硫酸比色法测定当归提取物中的多糖含量。
结果苯酚—硫酸比色法日内精密度rsd=0.99%，日间精密度rsd=1.12%, 平均回收率99.69%，稳定性rsd=0.39%，当归提取物中多糖含量为51.52%。
结论本法操作简便，准确性好，精密度高，稳定性好。
【关键词】当归，苯酚—硫酸法，多糖，含量测定大量药理实验证明，中草药多糖在增强机体免疫功能及抗肿瘤、抗溃疡、调血脂、降血糖、抗衰老方面有作用。
当归是伞形科植物当归angelica sinensis (oliv.) diels的干燥根,主产我国甘肃省岷山山区,具有补血活血、调经止痛、润肠通便等功效[1]。
研究证明，当归多糖是当归补血活血的有效成分[2-4]。
本实验对当归提取物中的多糖含量进行测定，以更好地控制当归药材的质量，保证其临床应用的有效性。
1 材料光学读数分析天平tg328b（湘仪天平仪器厂）；722s分光光度计（上海精密仪器有限公司）；电子天平（上海精密科学仪器有限公司）；754pc型分光光度计葡萄糖，硫酸，苯酚等均为分析纯当归（产自甘肃岷县）2 方法与结果2.1 试液的制备:5%苯酚溶液：取苯酚100g,加铝片0.1g和碳酸氢钠0.05 g,常压蒸馏，收集182℃馏分。
称取该馏分5 g,置100 ml容量瓶中，加新鲜蒸馏水稀释至刻度，摇匀后，滤过至棕色试剂瓶中，得5%苯酚溶液。
葡萄糖对照品溶液精密称取经105℃干燥至恒重的葡萄糖10.4mg,溶于适量蒸馏水中,转入100ml容量瓶中加蒸馏水定容至刻度线,摇匀,得浓度为104μg·ml-1的葡萄糖对照溶液。
2.2 当归提取物的制备:当归饮片100g，加水1500ml,煮沸提取1h，共提取两次，合并提取液。
加热浓缩至一定体积后加两倍量95%乙醇沉淀。
抽滤，弃去滤液，沉淀置60℃干燥得棕色膏状物。
资料-多糖含量测定的各种方法优缺点
苯酚-硫酸法测多糖含量一、原理多糖在硫酸的作用下先水解成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，然后与苯酚生成橙黄色化合物。
再以比色法测定。
二、试剂1、浓硫酸：分析纯，95.5%2、80%苯酚：80克苯酚（分析纯重蒸馏试剂）加20克水使之溶解，可置冰箱中避光长期储存。
3、6%苯酚：临用前以80%苯酚配制。
（每次测定均需现配）4、标准葡聚糖（Dextra n,瑞典Pharma cia）或分析纯葡萄糖。
5、15%三氯乙酸（15%TCA）：15克TCA加85克水使之溶解，可置冰箱中长期储存。
6、5%三氯乙酸（5%TCA）：25克TCA加475克水使之溶解，可置冰箱中长期储存。
7、6mol/L 氢氧化钠：120克分析纯氢氧化钠溶于500ml水。
8、6mol/L 盐酸三、操作1、制作标准曲线准确称取标准葡聚糖（或葡萄糖）20mg于500ml容量瓶中，加水至刻度，分别吸取0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6及1.8ml，各以蒸馏水补至2.0ml，然后加入6%苯酚1.0ml及浓硫酸5.0ml，摇匀冷却，室温放置20分钟以后于490nm测光密度，以2.0ml水按同样显色操作为空白，横坐标为多糖微克数，纵坐标为光密度值，得标准曲线。
2、样品含量测定1）取样品1克（湿样）加1ml 15%TCA溶液研磨，再加少许5％TCA溶液研磨，倒上清液于10毫升离心管中，再加少许5％TCA溶液研磨，倒上清液，重复3次。
最后一次将残渣一起到入离心管。
注意：总的溶液不要超出10毫升。
（既不要超出离心管的容量）。
2）离心，转速3000转/分钟，共三次。
第一次15分钟，取上清液。
后两次各5分钟取上清液到25毫升锥形比色管中。
最后滤液保持18毫升左右。
3）水浴，在向比色管中加入2毫升6mol/L 盐酸之后摇匀，在96℃水浴锅中水浴2小时。
测定多糖的方法
测定多糖的方法：蒽酮—硫酸法，苯酚—硫酸法，比色定量法，纸色谱法，离子交换色谱法，酶法，原子吸收法，HPLC法，DNS（还原法），磷钼比色法。
一、苯酚—硫酸法1、原理：糖在浓硫酸作用下脱水生成的糠醛或羟甲基糠醛能与苯酚缩合成一种橙红色化合物。
在10～100mg范围内其颜色与糖的含量成正比。
在485nm波长下有最大吸收峰，故可用比色法在波长下测定。
苯酚法可用于甲基化的糖和多糖的测定方法。
简单，灵敏度高，实验室基本不受蛋白住存在的干扰。
2、实验药品浓硫酸苯酚3苯酚溶液的配制（1）先配制80%苯酚溶液，然后称取80.0g苯酚加20.0g水，使之溶解，置于冰箱中，避光长期保存。
取80%苯酚37.5mL定容到500Ml.配制成60%的苯酚溶液，避光保存。
（2）取苯酚100g，加铝片0.1g和碳酸氢钠0.05g，蒸馏收集182℃馏分。
称取7.5g加水150mL溶解，置棕色瓶内放冰箱备用。
二、蒽酮—硫酸显色法1、实验药品蒽酮硫酸2、溶液的配制称取蒽酮0.2g，加浓硫酸100mL混均即可（现用现配）三、高效液相色谱法多糖溶液进行高效液相色谱，利用TSK—GEL G4000PW柱.RI—10A示差折光检测器，以双蒸馏水为流动相，溶液浓度为0.5mg/Ml,进样量50μL，根据峰形判断样品的纯度。
四、DNS法为排除还原性单糖的干扰，可采用DNS（3,5—二硝基水杨酸）比色法测定还原糖的含量。
1、原理在碱性溶液中3,5—二硝基水杨酸与还原性糖共热后被还原成棕红色氨基化合物，在一定范围内还原糖的量与反应液的颜色强度呈比例关系。
再将通过硫酸—苯酚，或者蒽酮—硫酸法得到的总糖结果减去还原糖，即得较准确的多糖含量。
五、地衣酚—硫酸法溶液的配制称取400mg地衣酚（3，5—二羟基甲苯）溶于155mL浓盐酸中，另加45mL含0.33%三氯化铁的0.01mol·mL_1盐酸，临用前配制。
苯酚—硫酸法和蒽酮—硫酸法的缺陷：首先葡萄糖是单糖而植物多糖的组成是多样的，只是用葡萄糖作为参照不确切，其次，显色试剂的不专属单糖的干扰严重，实际上测得的结果是总糖的结果。
总多糖含量测定方法
总多糖含量测定方法
总多糖的含量测定方法有多种，其中包括苯酚-硫酸法、3,5-二硝基水杨酸比色法、蒽酮-硫酸法等。
1. 苯酚-硫酸法：苯酚-硫酸试剂可与游离的或多糖中的己糖、糖醛酸起显色反应，己糖在490nm波长处、戊糖及糖醛酸在480nm 波长处有最大吸收，吸收度与糖含量呈线性关系。
2. 3,5-二硝基水杨酸比色法（DNS法）：3，5-二硝基水杨酸与多糖水解后的还原糖生成有色物质进行测定。
这种方法是在碱性条件下显色，较准确测定还原糖与总糖的含量从而求出多糖的含量，可消除还原性杂质的干扰。
3. 蒽酮-硫酸法：多糖与硫酸发生脱水反应，生成糠醛或其衍生物，与蒽酮试剂缩合生成有色物质进行测定。
此外，间羟基联苯法也是一种常用的多糖中糖醛酸含量测定方法，该法较硫酸咔唑法受中性糖残基的干扰更小。
另外还有超氧阴离子清除率和羟自由基清除率的检测方法、水分的检测方法等。
苯酚硫酸法测多糖原理
苯酚硫酸法测多糖原理
苯酚硫酸法是一种常用的测定多糖含量的方法，其原理是利用苯酚与
硫酸的混合物将多糖分解成糖酸，然后使用精确浓度的碘液进行滴定，通过测算滴定液的消耗量来计算出样品中多糖的含量。
具体实现过程如下：首先将待测样品溶于开水中，加入预先混合的苯
酚-浓硫酸混合物中，然后在混合液中加入恒定浓度的碘液，开始实时记录消耗的滴定液的数量。
当滴定液中的碘消耗完时，混合液将变成
蓝色，这时就可以计算出样品中多糖的含量了。
这种方法的优点是快速方便，可适用于大量样品的测定，且有较高的
灵敏度和准确度，常常用于食品糖的测定以及多糖的生产和质量控制。
虽然苯酚硫酸法测定多糖的原理相对简单，但仍需要在操作时严格控
制实验条件、仔细检查每一步的操作是否正确，以确保测定结果的准
确可靠。
同时还需要注意避免硫酸对人体的危害，做到防护措施上的
全面。
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随着对生物药物、天然药物和保健食品研究的深入，多糖的研究进展很快。
目前多糖含量的测定方法尚无统一标准，广泛应用的是苯酚－硫酸比色法。
该法具有简单、快速、无需多糖纯品和贵重仪器等优点，且对水溶性样品和非水溶性样品均可测定。
１ 苯酚－硫酸比色法原理
苯酚－硫酸比色法测定多糖含量是由Ｄｕｂｏｉｓ等［１，２］提出的。
其原理是：多糖或寡糖被浓硫酸在适当高温下水解，产生单糖，并迅速脱水成糠醛衍生物，该衍生物在强酸条件下与苯酚起显色反应，生成橙黄色物质，在波长４９０ｎｍ处和一定浓度范围内，其吸光度Ａ值与糖浓度Ｃ呈线性关系，从而可用比色法测定其含量。
２ 实验方法
２．１ 标准溶液的配制
精密称取１０５℃下干燥至恒重的葡萄糖约１００．０ｍｇ，置１００ｍＬ量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，配得葡萄糖标准溶液。
２．２ 供试品贮备液的配制
将样品进行适当处理（如真空干燥、回流提取等，根据各品种不同而有差异），取适量，按一定比例稀释，配制供试品贮备液。
２．３ 苯酚溶液的配制
称取苯酚１００ｇ，加铝片０．１ｇ和碳酸氢钠０．０５ｇ，常压蒸馏，收集（１８０±２）℃馏分。
精密称取该馏分约１０．０ｇ置于２００ｍＬ量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀后转置于棕色试剂瓶中，即得苯酚溶液，将其置于冰箱中备用。
２．４ 测定条件选择
２．４．１ 反应温度选择 精密吸取供试品贮备液、葡萄糖标准液各１．０ｍＬ于１００ｍＬ量瓶中，用水稀释至刻度，分别作为供试品溶液和对照品溶液。
分别吸取供试品溶液１．０ｍＬ于两个具塞试管中，各加苯酚液１．０ｍＬ，并分别迅速滴加浓硫酸５．０ｍＬ。
一份于水浴中煮沸１５ｍｉｎ，另一份于４０℃水浴中恒温３０ｍｉｎ。
另取两份对照品溶液１．０ｍＬ同上操作。
取出，冷却至室温，１５ｍｉｎ后于４９０ｎｍ处测其Ａ值，选取Ａ较高的作为实验温度。
２．４．２ 苯酚及硫酸用量选择 分别吸取供试品液和对照品液１．０ｍＬ５份，各加入苯酚液０．２，０．４，０．６，０．８，１．０ｍＬ，加水至２．０ｍＬ，再各滴加浓硫酸５．０ｍＬ，４０℃恒温３０ｍｉｎ后，测其Ａ值，从苯酚液加入量达到某一值开始，Ａ值基本保持不变，说明苯酚液量达到该值以上时，反应都能完成。
另取供试品液和对照品液０．６ｍＬ各５份，分别加苯酚液１．０ｍＬ，再分别滴加浓硫酸２．０，３．０，４．０，５．０，６．０ｍＬ，并均用水稀释至８．０ｍＬ，根据Ａ的稳定性，计算硫酸的最佳加入体积。
２．４．３ 反应时间选择及稳定性 分别取供试品液和对照品溶液１．０ｍＬ４份，各加苯酚液１．０ｍＬ，浓硫酸５．０ｍＬ，于选定温度分别恒温１０，２０，３０，４０ｍｉｎ。
测得Ａ值，加热到一定时间以后，Ａ值不再变化，说明加热该时间即可使反应完全。
另测反应完成后样品在不同时间内的Ａ值，结果应在１ｈ以上稳定。
２．５ 标准曲线的绘制
依据２．４确定的测定条件，精密吸取葡萄糖标准
苯酚－硫酸比色法测定多糖含量张青 张天民 （山东正大福瑞达制药有限公司 济南 ２５００１４）
溶液０．０，０．１，０．２，０．３，０．４，０．５，０．６，０．７，０．８ｍＬ（相当于葡萄糖０．０，１００，２００，３００，４００，５００，６００，７００，８００ｕｇ），分别置于１０ｍＬ具塞刻度试管中，各加水使成１．０ｍＬ，然后分别加入苯酚溶液，摇匀，迅速加入浓硫酸，振摇５ｍｉｎ后置相应温度水浴中加热一定时间，取出置冷水中冷却，最后加水至刻度，摇匀。
用分光光度计在波长４９０ｎｍ处测定吸光度。
以Ａ值对浓度Ｃ绘制标准曲线，进行线性回归，得标准曲线方程：Ａ＝ａ·
Ｃ＋ｂ（ａ、ｂ根据实验确定）。
２．６ 校正因子的测定
将样品多糖纯品适量，按适当比例稀释，使单糖浓度在标准曲线中Ｃ范围内，作为纯品贮备液。
精密吸取该贮备液１００ｕｌ，照标准曲线制作项下的方法测定Ａ，求出样品多糖的浓度Ｃ（ｕｇ／ｍＬ），按ｆ＝Ｗ／（Ｃ·Ｄ）计算换算因子。
式中Ｗ（ｕｇ）为多糖含量；Ｄ为纯品的稀释倍数。
若样品多糖无纯品，如可能进一步纯化，则将样品进行提纯后用于测定校正因子。
２．７ 样品的测定
取样品适量，精密称定，稀释，按照２．５中条件进行测定，得到多糖浓度Ｃ，按多糖含量（％）＝［（Ｃ·Ｄ·ｆ）／Ｗ样］×１００％计算多糖含量。
式中Ｗ样为样品重量；Ｄ为样品的稀释倍数；ｆ为换算因子。
３ 讨论
３．１ 用分光光度计测定多糖的方法，具有操作简单、结果稳定、灵敏度高等优点。
３．２ 文中样品用量、葡萄糖标准溶液用量及供试品贮备液用量，可根据实际情况进行调整，使Ａ值保持在灵敏范围内，保证样品浓度在标准曲线Ｃ范围内，以免测定结果偏离真实值，但各溶液的用量前后尽可能不要变化太大。
３．３ 含多糖的物质，由于其多样性，水解为单糖的难易程度不同，故水解的条件应事先确定。
水解不够，单糖不能充分释出；水解条件过度，释出的单糖或有关糠醛衍生物会被部分破坏。
测定条件选择的三个影响因素，可进行Ｌ９（３４）正交试验来确定最佳条件。
测定条件选择中各影响因素的不同水平可根据样品自身条件进行调整，如反应温度常有煮沸、４０℃和室温等，但室温放置在不同气候条件下影响因素不恒定，因此不多用。
３．４ 关于校正因子的测定，如样品无法进一步纯化，即不能制得多糖纯品，可不进行校正因子测定。
根据得到的多糖浓度Ｃ和Ｗ样、Ｄ直接计算多糖含量（％）。
３．５ 葡萄糖与其它单糖的显色反应虽一般大致相近，
但有一定差异。
故要求较高的测定中，应加以校正［３］。
因其他单糖的显色反应有的比葡萄糖强，有的比葡萄糖弱，误差可抵消一部分。
如不加校正，也可基本上达到多糖含量控制的目的。
３．６ 如果供试品溶液有较深的颜色，溶液中有其它组分在波长４９０ｎｍ处有吸收，则可采用导数法［４］测定含量。
３．７ 试验需进行精密度试验、重现性试验和回收率试验。
参考文献
［１］Ｄｕｂｏｉｓ Ｍ，Ｇｉｌｌｅｓ ＫＡ，Ｈａｍｉｌｔｏｎ ＪＫ，ｅｔ ａｌ．Ｃｏｌｏ－ｒｉｍｅｔｒｉｃ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｕｇａｒｓ ａｎｄｒｅｌａｔｅｄ ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ，Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ，１９５６，２８：３５０［２］Ｄｕｂｏｉｓ Ｍ，Ｇｉｌｌｅｓ ＫＡ，Ｈａｍｉｌｔｏｎ ＪＫ，ｅｔ ａｌ．Ａｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆｓｕｇａｒｓ，Ｎａｔｕｒｅ，１９５１，１６８：１６７
［３］ 董群，郑丽伊，方积年．改良的苯酚－硫酸法测定多糖和寡糖含量的研究，中国药学杂志，１９９６，３１：５５０
［４］耿霞，梁冰，梁玉祥等．苯酚－硫酸导数光谱法快速测定中药中多糖的研究，四川大学学报，２００２，３４：６２。