生物化学实验

实验一1、糖类的颜色反应

1. α-萘酚反应

糖在浓无机酸（硫酸或盐酸）作用下，脱水生成糠醛及糠醛衍生物，后者能与α-萘酚生成紫红色物质。

注意：因糠醛及糠醛衍生物对此反应均呈阳性，不是糖类的特异反应。

2. 间苯二酚反应

在酸作用下，酮糖脱水生成羟甲基糠醛，后者再与间苯二酚作用生成红色物质。

此反应是酮糖的特异反应。因为醛糖在同样条件下呈色反应缓慢，只有在糖浓度较高或煮沸时间较长时，才呈微弱的阳性反应。

2、还原作用

许多糖类由于其分子中含有自由的或潜在的醛基或酮基，因此在碱性溶液中能将铜、铁、银等金属离子还原，同时糖类本身被氧化成糖酸及其他产物。糖类这种性质常被利用于检测糖的还原性及还原糖的定量测定。本实验所用的试剂为斐林试剂和本尼迪克特试剂。它们都是Cu2＋的碱性溶液，能使还原糖氧化而本身被还原成红色（颗粒大）或黄色（颗粒小）的Cu2O沉淀。

实验二脂肪碘值的测定

碘值（价）是指100g脂肪在一定条件下吸收碘的克数。碘值是鉴别脂肪的一个重要常数，可用以判断脂肪所含脂肪酸的不饱和程度。

脂肪中常含有不饱和脂肪酸，不饱和脂肪酸具有一个或多个双键，能与卤素起加成作用而吸收卤素。

常用碘与脂肪中不饱和脂肪酸的双键起加成作用。脂肪的不饱和程度越高，所含的不饱和脂肪酸越多，与其双键起加成作用的碘量就越多，碘值就越高。故可用碘值表示脂肪的不饱和度。I2+－CH=CH－－CHI－CHI－

本实验用溴化碘(Hanus试剂)代替碘。用一定量(必须过量)溴化碘和待测的脂肪作用后，用硫代硫酸钠滴定的方法测定溴化碘的剩余量，然后计算出待测脂肪吸收的碘量，求得脂肪的碘值。

加成作用：IBr+－CH=CH－－CHI－CHBr－

剩余溴化碘中碘的释放：IBr + KI KBr + I2

再用硫代硫酸钠滴定释放出来的碘：I2 +2Na2S2O3 2Na2S4O6+2NaI

思考题：何谓空白溶液和空白实验？空白实验有何意义？

在各种分析方法中，为消除干扰，用与测定试样时完全一致的条件进行测定的溶液。

意义：去除一些杂质的影响，使实验结果更有说服力

实验三氨基酸的分离鉴定--纸层析法

纸层析原理：在纸上，水被吸附在纤维素的纤维之间形成固定相，由于纤维素与水的氢键作用，使水不易扩散，并能与跟水混合的溶剂(有机相)形成类似不相混合的两相。当有机相沿纸流动经过层析点时，层析点上的溶质就在水相和有机相之间进行分配，有一部分溶质离开原点随有机相移动而进入无溶质的区域，这时又重新进行分配，一部分溶质从有机相进入水相。当有机相不断流动时，溶质就沿着有机相流动的方向移动，不断进行分配。溶质中各组分的分配系数不同，移动速率也不同，因而可以彼此分开。

物质被分离后在纸层析图谱上的位置是用Rf值（比移值）来表示的：

原点到层析点中心的距离

Rf＝____________________

原点到溶剂前沿的距离

在一定的条件下某种物质的Rf值是常数，Rf值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量、展层方式、层析温度和pH等因素有关。本实验利用纸层析法分离氨基酸。思考题

1．何谓纸层析法？

2．何谓Rf值？影响Rf值的主要因素是什么？

3．怎样制备扩展剂？

将20ml正丁醇和5ml冰醋酸放入分液漏斗中，与15ml水混合充分振荡静置后分层，放出下层水层，上层即为扩展剂

实验四蛋白质及氨基酸的呈色反应

（一）双缩脲反应

双缩脲反应:尿素加热至180℃左右，生成双缩脲并放出一分子氨。双缩脲在碱性环境中能与Cu2+结合生成紫红色化合物。

蛋白质分子中有肽键，其结构与双缩脲相似，能发生双缩脲反应。这可用于蛋白质的定性或定量测定。

注意:①双缩脲反应不仅为含有两个以上肽键的物质所特有，许多含有一个肽键和一个氨基的物质也能发生此反应如–CS-NH2，-CH2-NH2，O=C C=O 等。

NH2 NH2

②NH3也干扰此反应，因为NH3与Cu2+可生成暗蓝色的络离子( Cu(NH3)42+ ，四氨合铜)。因此，一切蛋白质或二肽以上的多肽都有双缩脲反应，但有双缩脲反应的物质不一定都是蛋白质或多肽。

（二）茚三酮反应

除脯氨酸，羟脯氨酸和茚三酮反应产生黄色物质外，所有α-氨基酸及一切蛋白质都能和茚三酮反应生成蓝紫色物质。β-丙氨酸、氨和许多一级胺都呈正反应(尿素、马尿酸和肽键上的亚氨基不呈现此反应。)因此，虽然蛋白质和氨基酸均有茚三酮反应，但能与茚三酮呈阳性反应的不一定是蛋白质或氨基酸。在定性定量测定中，应严防干扰物存在。

该反应十分灵敏，1：1500000浓度的氨基酸水溶液即能给出反应，是一种常用的氨基酸定量测定方法。茚三酮反应分为两步：

第一步是氨基酸被氧化形成二氧化碳，氨和醛，水合茚三酮被还原成还原型茚三酮。

第二步是所形成的还原型茚三酮同另一个水合茚三酮分子和氨缩合生成有色物质。

(此反应的适宜pH为5-7，同一浓度的蛋白质或氨基酸在不同的pH条件下的颜色深浅不同，酸度过大时甚至不显色。)

（三）黄色反应

含有苯环结构的氨基酸，如酪氨酸和色氨酸，遇硝酸后，可被硝化成黄色物质，该化合物在碱性溶液中进一步形成深橙色的硝醌酸钠。(多数蛋白质分子含有带苯环的氨基酸，所以有黄色反应，注意苯丙氨酸不易硝化，需加入少量的浓硫酸才有黄色反应，该反应非常灵敏。) （四）考马斯亮蓝反应

考马斯亮蓝G250具有红色和蓝色两种色调。在酸性溶液中，其以游离态存在呈棕红色；当它与蛋白质通过疏水作用结合后变为蓝色。(它染色灵敏度高，比氨基黑高3倍，反应速度快，约在2分钟达到平衡，在室温1小时内稳定，常用来定量测定蛋白质含量)

通过本实验你掌握了几种鉴定蛋白质和氨基酸的方法？它们的原理是什么？

实验五蛋白质的等电点测定和沉淀反应

（一）蛋白质的等电点(pI)：蛋白质分子的解离状态和解离程度受溶液酸碱度的影响，当溶液的pH达到一定数值时，蛋白质颗粒上正负电荷的数目相等，在电场中，蛋白质既不向