TUNEL检测方法
tunel细胞凋亡率计算
TUNEL（TdT-mediated dUTP nick end labeling）是一种常用于检测凋亡细胞的方法。
TUNEL检测法通过标记凋亡细胞DNA末端的dUTP，可以检测出凋亡细胞的数量和分布。
TUNEL细胞凋亡率的计算方法如下：
1. 计算TUNEL阳性细胞数：在显微镜下观察到的凋亡细胞，通过染色后在光学显微镜下进行计数。
2. 计算总细胞数：通过显微镜下观察，在与TUNEL阳性细胞所在的组织切片中，对所有细胞进行计数。
3. 计算凋亡细胞率：凋亡细胞率= TUNEL阳性细胞数÷总细胞数×100%。
例如，如果在一个组织切片中，TUNEL阳性细胞数为100个，总细胞数为1000个，则凋亡细胞率为：
凋亡细胞率= 100 ÷1000 ×100% = 10%
需要注意的是，TUNEL法只能检测凋亡细胞的存在，不能区分凋亡细胞的类型（如程序性细胞凋亡或坏死），也不能确定凋亡细胞的数量。
因此，在使用TUNEL法进行凋亡细胞检测时，需要结合其他方法和技术进行综合分析。
TUNEL检测
TUNEL检测中文名称：TUNEL检测英文名称：terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-biotin nick end labeling assay;TUNEL assay定义：即原位末端转移酶标记技术。
凋亡细胞的DNA双链断裂或一条链出现缺口，产生一系列3′-OH末端，在脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdT)作用下，将脱氧核糖核苷酸和生物素所形成的衍生物标记到DNA的3′末端，从而进行凋亡细胞的检测。
原理细胞在发生凋亡时，会激活一些DNA内切酶，这些内切酶会切断核小体间的基因组DNA。
细胞凋亡时抽提DNA进行电泳检测，可以发现180-200bp的DNA ladder。
基因组DNA断裂时，暴露的3’-OH可以在末端脱氧核苷酸转移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT) 的催化下加上荧光素 (FITC) 标记的dUTP (fluorescein-dUTP) ，从而可以通过荧光显微镜或流式细胞仪进行检测，这就是TUNEL (TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling) 法检测细胞凋亡的原理。
实验方法1. 对于贴壁细胞或细胞涂片a. PBS或HBSS洗涤一次。
b. 如果细胞贴得不牢，可以干燥样品使细胞贴得更牢。
c. 用4%多聚甲醛或碧云天生产的免疫染色固定液(P0098)固定细胞30-60分钟。
d. 用PBS或HBSS洗涤一次。
e. 加入含0.1％Triton X-100的PBS或碧云天生产的免疫染色洗涤液(P0106)，冰浴孵育2分钟。
f. 转步骤5。
2. 对于悬浮细胞或细胞悬液a. 收集细胞(不超过200万细胞)，PBS或HBSS洗涤一次。
b. 用4%多聚甲醛固定细胞30-60分钟。
为防止细胞聚集成团，宜在侧摆摇床或水平摇床上缓慢摇动的同时进行固定。
c. 用PBS或HBSS洗涤一次。
TUNEL法检测细胞凋亡实验原理和方法
检测晚期凋亡.基本原理：对不同组织切片先增加细胞膜通透性，然后让和标记地进入细胞内，在地辅助下与核断裂地’结合，再用标记地链霉亲和素与上结合（每个链霉亲和素至少可以再结合个分子），最后用、过氧化氢与上地辣根过氧化物酶发生氧化、环化反应，形成苯乙肼聚合物而呈现棕褐色，最终通过计数每张切片上不同视野中阳性细胞地比例来判断细胞凋亡发生情况.罗氏试剂盒一、试剂、酶浓缩溶液×μ——末端脱氧核糖核酸转移酶（×）试剂、标记溶液×μ——含有核苷酸混合液地反应液（×）试剂、转化剂——酶标记抗荧光素抗体（即用型，融后℃保存）二、所需地溶液和仪器（）、配制、、饭盒、吹风机、甲醇溶液、、盖玻片、中性树胶、苏木素、二甲苯和无水乙醇（用量多）、双蒸水（用以配梯度酒精）, 充分脱蜡和水化.脱蜡可以先度，石蜡切片于染色缸中，二甲苯浸洗次共、、、、乙醇浸洗×；②过氧化氢甲醇中浸洗，抑制内源性过氧化氢酶.③用蛋白酶（μ溶于中，）室温孵育分钟.④洗约*次，擦干样品周围地水.此阶段配制反应混合物——从试剂中取出μ标记溶液作为两个阴性对照；将试剂中取μ试剂中μ标记液中，配成μ 反应混合物混匀（即配即用，℃避光！）⑤标记反应：滴加μ地反应混合液，在湿盒中℃孵育分钟（为防蒸发和保证反应混合物均匀分布，可以在孵育过程中加盖盖玻片）.洗*次，至此样品可在荧光镜下（绿色）分析结果.⑥信号转化和分析：擦干样品周围地水分，加入转化剂，湿盒中℃孵育分钟（可以在孵育过程中加盖盖玻片）.洗*次⑦加入μ 底物溶液，室温（℃）孵育，洗*次.（苏木素染秒，以免视野全染，需要摸索条件）⑧中性树胶或者甘油封片（在封片前可以复染），光镜下分析结果.•稳定性：反应混合物需在使用前立即制备，不能储存，配好地此液体必须将放入冰浴中.个人收集整理勿做商业用途、转化剂（即用型）：一旦融化此液体，需在℃保存（最多保存个月），并且不能反复冻存. 蛋白酶一般工作液浓度为,但浓缩液可配制，可用配制，也可用蛋白酶缓冲液（）；注意：)蛋白酶可以帮助渗透组织，但延长孵育时间可能导致切片脱落（）,所以要最优化孵育时间长短.时间一般为，左右地片子可以用，但左右地可用，最终通过摸索最佳时间.过长易脱片、过短起不到通透效果.)对于比较困难地组织，可以选用地枸橼酸盐缓冲液进行修复（石蜡切片无必要用），需修复)对照：阴性对照：经过固定和通透地细胞样品加入μ试剂以代替反应混合物，从标记步骤以下同上.阳性对照：经过固定和通透地细胞样品用细球菌地核酸酶或使之产生链缺口，从标记步骤以下同上.)操作流程：常规脱蜡、脱水处理——冲洗样品——滴加反应混合物，℃孵育分钟——冲洗样品——选择：荧光镜下观察分析——滴加转化剂，℃孵育分钟——洗样品——滴加底物溶液，室温孵育分钟——光镜下分析结果)假阳性多地原因有很多：封闭不全、显色时间过长等原因假阳性严重，可能原因应该是孵育时间过长，建议首先排除之，同时加强浸洗)显色时间:（）显色时间不是固定地，主要由显微镜下控制显色时间，到出现浅棕色本底时即可冲洗；（）显色时间很短（如几秒或几十秒）就出现很深地棕褐色，这很可能说明你地抗体浓度过高或抗体孵育时间过长，需要下调抗体浓度或缩短你地抗体孵育时间；（）此外，若很短时间就出现背景很深，还有可能你前面地封闭非特异性蛋白不全，需要延长封闭时间；（）显色时间很长（如超过十几分钟）才出现阳性染色，一方面可能说明你地抗体浓度过低或孵育时间过短（最好一抗度过夜）；另一方面就是封闭时间过长.)脱片产生地原因和如何防止脱片:（）多聚赖氨酸玻片质量地问题.我原先是买地，迈新按说也是不错地，可是都脱成什么样子了.后面补做第二批时用地病理科老师自己做地片子，要好一点.（）组织切地不好，切片机地问题例如比较老地旧地机器切地厚或者不均匀，或者切片者手法不好等.（）组织地问题，越是有坏死之类越容易脱.（）没烤好，时间短温度不够之类.（）操作地时候甩地太猛了，有脱片嫌疑地片子最好不甩或轻轻甩，用卫生纸从边缘上慢慢吸水.（）此外，一旦见到有组织漂起来操作就更加要谨慎，用地时候尽量用泡地，不要冲.个人收集整理勿做商业用途。
细胞凋亡的六种检查方法
细胞凋亡的六种检查方法一、引言细胞凋亡是一种重要的细胞死亡方式，它在生物体的正常发育和疾病的发生中都起到了重要作用。
因此，对于细胞凋亡的检测方法也成为了科学家们关注的焦点之一。
本文将介绍六种常见的细胞凋亡检测方法。
二、TUNEL法TUNEL法是一种常见的检测DNA断裂和凋亡细胞数量的方法。
它利用末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)标记DNA断裂末端，并通过荧光或酶标记来检测。
操作步骤如下：1. 取出样品，并将其固定在载玻片上；2. 用缓冲液进行处理，使得DNA断裂末端暴露出来；3. 加入TdT和dUTP标记物，使得dUTP与DNA断裂末端连接；4. 洗涤样品，并加入抗dUTP抗体标记物；5. 洗涤样品，并观察荧光或颜色变化。
三、Annexin V染色法Annexin V染色法可以同时检测早期和晚期凋亡细胞。
它利用细胞表面磷脂酰肌醇二磷酸(PIP2)的变化，通过Annexin V结合检测细胞凋亡。
操作步骤如下：1. 取出样品，并将其固定在载玻片上；2. 加入Annexin V标记物，使得其与PIP2结合；3. 加入PI染色剂，使得细胞核染色；4. 观察荧光或颜色变化。
四、Caspase活性检测法Caspase活性检测法可以检测细胞内Caspase的活性水平，从而判断凋亡的程度。
操作步骤如下：1. 取出样品，并将其固定在载玻片上；2. 加入Caspase底物和缓冲液，使得Caspase底物被水解；3. 观察荧光或颜色变化。
五、DNA Ladder分析法DNA Ladder分析法可以检测DNA的断裂情况，从而判断凋亡的程度。
操作步骤如下：1. 取出样品，并提取其中的DNA；2. 用琼脂糖凝胶电泳分离DNA，并观察条带形态。
六、电子显微镜观察法电子显微镜观察法可以直接观察细胞的形态和结构变化，从而判断凋亡的程度。
操作步骤如下：1. 取出样品，并进行适当处理；2. 用电子显微镜观察细胞形态和结构变化。
七、总结以上六种方法是常见的细胞凋亡检测方法，每种方法都有其特点和优缺点。
鉴定细胞凋亡的常用方法
鉴定细胞凋亡的常用方法细胞凋亡是细胞程序性死亡的一种形式，是维持生物体正常生长发育和组织修复的重要机制。
凋亡与疾病的关系密切，如肿瘤、神经退行性疾病、心血管疾病等。
因此，鉴定细胞凋亡的常用方法对于疾病的诊断和治疗具有重要的意义。
本文将介绍几种常用的细胞凋亡鉴定方法。
一、TUNEL法TUNEL法是一种基于末端脱氧核苷酸转移酶(dUTP-nick end labeling，TUNEL)技术的细胞凋亡检测方法。
该方法通过在细胞凋亡时，末端脱氧核苷酸转移酶(dUTP-nick end labeling，TUNEL)将标记物dUTP标记在DNA的3'末端，然后使用荧光显微镜观察标记物的荧光强度。
该方法的优点是操作简便，结果准确可靠，适用于多种样本类型的细胞凋亡检测。
二、Annexin V-FITC/PI双染法Annexin V-FITC/PI双染法是一种流式细胞术检测细胞凋亡的方法。
该方法通过Annexin V结合细胞膜上的磷脂酰胆碱(PS)和PI结合细胞核DNA，将细胞分为四个区域：Annexin V-FITC(-)/PI(-)区域表示正常细胞；Annexin V-FITC(+)/PI(-)区域表示早期凋亡细胞；Annexin V-FITC(+)/PI(+)区域表示晚期凋亡细胞；AnnexinV-FITC(-)/PI(+)区域表示坏死细胞。
该方法的优点是高灵敏度和高特异性，可以同时检测细胞凋亡和坏死。
三、DNA Ladder检测DNA Ladder检测是一种检测细胞凋亡的传统方法。
该方法通过电泳分离DNA，检测DNA的大小和形态是否发生变化，如出现约180bp 的DNA片段，则提示细胞凋亡。
该方法的缺点是需要较多的细胞样本，且不能区分细胞凋亡的早期和晚期。
四、Caspase活性检测Caspase是细胞凋亡的重要调节因子，Caspase活性检测是一种检测细胞凋亡的方法。
该方法通过检测Caspase活性的改变来判断细胞凋亡的程度，如Caspase-3活性增加，则提示细胞凋亡。
罗氏TUNEL使用说明书(中文)
罗氏公司TUNEL细胞凋亡检测程序（In situ cell death detection kit-POD法）一、原理：TUNEL（TdT-mediated dUTP nick end labeling）细胞凋亡检测试剂盒是用来检测组织细胞在凋亡早期过程中细胞核DNA的断裂情况。
其原理是荧光素（fluorescein）标记的dUTP在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT Enzyme）的作用下，可以连接到凋亡细胞中断裂DNA的3’-OH末端，并与连接辣根过氧化酶（HRP，horse-radish peroxidase）的荧光素抗体特异性结合，后者又与HRP底物二氨基联苯胺（DAB）反应产生很强的颜色反应（呈深棕色），特异准确地定位正在凋亡的细胞，因而在光学显微镜下即可观察凋亡细胞；由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA断裂，因而没有3'-OH形成，很少能够被染色。
本试剂盒适用于组织样本（石蜡包埋、冰冻和超薄切片）和细胞样本（细胞涂片）在单细胞水平上的凋亡原位检测。
还可应用于抗肿瘤药的药效评价，以及通过双色法确定细胞死亡类型和分化阶段。
二、器材与试剂器材：光学显微镜及其成像系统、小型染色缸、湿盒（塑料饭盒与纱布）、塑料盖玻片或封口膜、吸管、各种规格的加样器及枪头等；试剂：试剂盒含TdT 10×、荧光素标记的dUTP 1×、标记荧光素抗体的HRP；自备试剂：PBS、双蒸水、二甲苯、梯度乙醇（100、95、90、80、70％）、DAB工作液（临用前配制，5 µl 20×DAB＋1μL30％H2O2＋94 µl PBS）、Proteinase K工作液（10-20 μg/ml in 10 mM Tris/HCl, pH 7.4-8）或细胞通透液（0.1% Triton X-100 in 0.1% sodium citrate，临用前配制）、苏木素或甲基绿、DNase 1（3000 U/ml– 3 U/ml in 50 mM Tris-HCl，pH 7.5, 10 mM MgCl2，1 mg/ml BSA）等。
TUNEL细胞凋亡检测(荧光标记)操作流程
一、TUNEL实验试剂(1)DeadEnd™Fluorometric TUNEL System试剂盒购自Promega公司(产品编号G3250)(2)二甲苯购自国药集团化学试剂有限公司（产品编号80139118，CAS号108-38-3，500ml）(3)无水乙醇购自中国上海生工生物有限公司（产品编号ET0737-500ml）(4) 过氧化氢购自上海生工生物有限公司(产品编号H1976-500ml)(5) Proteinase K购自上海生工生物工程技术服务公司(产品编号BSP169-2ml)(6)多聚甲醛购自上海生工生物有限公司（产品编号PB0684-500g）(7) Propidium iodide购自Sigma（产品编号P4170-10MG）(8) SlowFade® Gold antifade reagent购自Life Technologies（产品编号36936）二、具体实验步骤A. 石蜡包埋组织预处理：1.二甲苯5min (500ml二甲苯)2.二甲苯5min（500ml二甲苯）3.无水乙醇5min（500ml无水乙醇）4.无水乙醇5min（500ml无水乙醇）5.80%乙醇5min（500x0.8=400ml无水乙醇）6.70%乙醇5min（500x0.7=350ml无水乙醇）7.PBS 5min（500ml）8.PBS 5min（500ml）9.PBS 5min（500ml）10.4%多聚甲醛in PBS，15min11.PBS 5min（500ml）12.PBS 5min（500ml）13.Proteinase K in PBS (100ul每个样品，共6ml), 8-10min14.PBS 5min（500ml）15.PBS 5min（500ml）16.4%多聚甲醛in PBS，5min17.PBS 5min18.PBS 5min共105分钟，实际约2个小时B. 凋亡检测1.每个样品，100ul平衡缓冲液覆盖细胞，室温5-10分钟2.在平衡细胞的同时，在冰上解冻核苷混合物，并且依照表1，准备足够量的用于所有实验的和可选阳性对照反应（见4.E节）的rTdT孵育缓冲液。
罗氏TUNEL使用说明书中文
罗氏公司TUNEL细胞凋亡检测程序（In situ cell death detection kit-POD法）一、原理：TUNEL（TdT-mediated dUTP nick end labeling）细胞凋亡检测试剂盒是用来检测组织细胞在凋亡早期过程中细胞核DNA的断裂情况。
其原理是荧光素（fluorescein）标记的dUTP在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT Enzyme）的作用下，可以连接到凋亡细胞中断裂DNA的3’-OH末端，并与连接辣根过氧化酶（HRP，horse-radish peroxidase）的荧光素抗体特异性结合，后者又与HRP底物二氨基联苯胺（DAB）反应产生很强的颜色反应（呈深棕色），特异准确地定位正在凋亡的细胞，因而在光学显微镜下即可观察凋亡细胞；由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA断裂，因而没有3'-OH形成，很少能够被染色。
本试剂盒适用于组织样本（石蜡包埋、冰冻和超薄切片）和细胞样本（细胞涂片）在单细胞水平上的凋亡原位检测。
还可应用于抗肿瘤药的药效评价，以及通过双色法确定细胞死亡类型和分化阶段。
二、器材与试剂器材：光学显微镜及其成像系统、小型染色缸、湿盒（塑料饭盒与纱布）、塑料盖玻片或封口膜、吸管、各种规格的加样器及枪头等；试剂：试剂盒含TdT 10×、荧光素标记的dUTP 1×、标记荧光素抗体的HRP；自备试剂：PBS、双蒸水、二甲苯、梯度乙醇（100、95、90、80、70％）、DAB工作液（临用前配制，5 µl 20×DAB＋1μL30％H2O2＋94 µl PBS）、Proteinase K工作液（10-20 μg/ml in 10 mM Tris/HCl, pH 7.4-8）或细胞通透液（0.1% Triton X-100 in 0.1% sodium citrate，临用前配制）、苏木素或甲基绿、DNase 1（3000 U/ml– 3 U/ml in 50 mM Tris-HCl，pH 7.5, 10 mM MgCl2，1 mg/ml BSA）等。
tunel检测说明书
一、TUNEL试剂盒说明凯基一步法TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(One Step TUNEL Apoptosis Assay Kit)为您提供了一种高灵敏度又快速简便的细胞凋亡检测方法，可检测细胞在凋亡过程中细胞核DNA的断裂情况，其原理是绿色荧光素（fluorescein）标记的dUTP在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT Enzyme）的作用下,可以连接到凋亡细胞中断裂的DNA的3'－OH末端，可用荧光显微镜检测。
由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3'-OH形成，很少能够被标记。
本试剂盒适用于组织样本（石蜡包埋、冰冻和超薄切片）和细胞样本（细胞涂片）的凋亡原位检测。
对于经过固定和洗涤的细胞或组织，只要经过一步染色反应，洗涤后就可以通过荧光显微镜检测到凋亡细胞。
本试剂盒特点●操作简便：使用Ready-to-Use型试剂，只需一步染色反应，洗涤后即可观察。
●高灵敏度：可以单一检出初期的凋亡细胞。
●高特异性：能特异性染色凋亡细胞。
●快速操作：仅需约1-2个小时即可完成整体操作。
●方便观察：可使用荧光显微镜观察实验结果。
●高正确性：有阳性对照片的制备方法，可以确认试剂盒的有效性●应用范围广：可以用于冷冻或石蜡切片中的组织细胞凋亡检测，也可检测培养的贴壁细胞或悬浮细胞的凋亡情况。
二、TUNEL试剂盒组分注意事项1．使用前请认真阅读本说明书，提前准备好相关试剂。
2．因本试剂盒中组分均为微量，使用前请离心集液。
3．为避免试验误差、降低试剂的损耗，建议使用精密度高的进口微量移液枪及枪头。
4． TdT 酶反应液最好在使用前根椐样本数量集中配制，再分别滴加于各样本片上，避免每个样本单独配制而产生的试剂损耗。
5. 用户自备：二甲苯、多聚甲醛、PBS、H2O2、TritonX-100、柠檬酸钠、盖玻片、载玻片、染色缸。
三、操作流程概览细胞涂片、贴壁细胞爬片等细胞样本四、检测样本的预处理TUNEL检测时样本的预处理是试验的关键所在，本说明书推荐的条件仅为普遍情况，用户需根椐自已的样本材料及首次试验结果来调整各个条件（参照Page 10），如处理时间、处理浓度等，来优化出适合自身样本的试验条件，从而做出客观的试验结果。
TUNEL法检测细胞凋亡实验原理和方法
TUNEL法检测细胞凋亡实验原理和方法细胞凋亡中染色体DNA的断裂是个渐进的分阶段的过程，染色体DNA首先在内源性的核酸水解酶的作用下降解为50-300kb的大片段。
然后大约30 ﹪的染色体DNA在Ca ²和Mg²依赖的核酸内切酶作用下，在核小体单位之间被随机切断，形成180～200bp 核小体DNA多聚体。
DNA双链断裂或只要一条链上出现缺口而产生的一系列DNA的3’-OH末端可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）的作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸化酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3’-末端，从而可进行凋亡细胞的检测，这类方法一般称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（TUNEL）。
由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3’-OH形成，很少能够被染色。
低分子量的DNA分离后，也可使用DNA聚合酶进行缺口翻译（nick translation），使低分子量的DNA标记或染色，然后分析凋亡细胞。
TUNEL或缺口翻译法实际上是分子生物学与形态学相结合的研究方法，对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色，能准确的反应细胞凋亡最典型的生物化学和形态特征，可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、培养的细胞和从组织中分离的细胞的细胞凋亡测定，并可检测出极少量的凋亡细胞，灵敏度远比一般的组织化学和生物化学测定法要高，因而在细胞凋亡的研究中已被广泛采用。
一、过氧化物酶标记测定法原理：脱氧核糖核苷酸衍生物地高辛[（digoxigenin）-11-dUTP]在TdT酶的作用下，可以掺入到凋亡细胞双链或单链DNA的3-OH末端，与dATP形成异多聚体，并可与连接了报告酶（过氧化物酶或碱性磷酸酶）的抗地高辛抗体结合。
在适合底物存在下，过氧化物酶可产生很强的颜色反应，特异准确的定位出正在凋亡的细胞，因而可在普通光学显微镜下进行观察。
毛地黄植物是地高辛的唯一来源。
tunel检测步骤
tunel检测步骤
摘要：
一、Tunel检测简介
1.Tunel检测的定义
2.Tunel检测的应用场景
二、Tunel检测步骤
1.样本准备
2.固定细胞
3.通透细胞
4.标记荧光探针
5.孵育
6.检测
7.数据分析
正文：
Tunel检测是一种用于检测细胞凋亡的分子生物学方法，它通过检测细胞核内的DNA片段，来判断细胞是否发生了凋亡。
Tunel检测的应用场景广泛，包括细胞凋亡研究、药物筛选、肿瘤诊断等。
Tunel检测的具体步骤如下：
首先，进行样本准备。
这一步包括收集细胞、处理细胞、以及将细胞固定在载玻片上。
其次，对固定好的细胞进行通透处理。
这一步是为了让荧光探针能够进入
细胞内，与DNA结合。
然后，标记荧光探针。
这一步中，荧光探针会与DNA结合，从而使发生凋亡的细胞核发出荧光信号。
接着，进行孵育。
孵育的目的是让荧光探针与DNA结合得更紧密，从而提高检测的准确性。
然后，进行检测。
这一步中，使用荧光显微镜观察细胞核，看是否有荧光信号。
最后，进行数据分析。
通过统计发出荧光信号的细胞数量，可以得出细胞凋亡的比例。
TUNEL实验建议
TUNEL（TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling）检测细胞凋亡1. 切片制备1.1 材料脱水包埋步骤基本上与普通石蜡切片材料处理方法一致，需注意以下几点：(1)脱水处理应全程在冰上进行。
(2)在3/4二甲苯1/4乙醇这一级处理中，不得使用番红染色。
(3)包埋好将蜡块放在4℃冰箱保存。
1.2载玻片处理在进行切片之前准备两种玻片。
一种为普通载玻片，无需处理。
另一种需要涂粘连剂，处理方法如下：(1)将玻片排列放置在玻片架上，在洗洁精溶液中浸泡一段时间。
(2)自来水冲洗干净。
(3)去离子水冲洗至玻片洁净无污，水滴无凝集现象。
(4)45℃烘箱烤干玻片。
(5)每片玻片均匀涂布4μL poly-L-lysine，晾干后45℃烘箱烘烤过夜。
1.3 切片切片时将要切的蜡块放在4℃预冷10min，并将其他要切的蜡块一直保持在4℃。
对每一个蜡块进行编号，如9522-1，9522-2等。
切片时要注意经常观察切到的部位，因为没有番红染色，观察比较困难。
每一个蜡块切出来的蜡带要在普通玻片和处理过的玻片上各放一些，并对玻片分别编号，如9522-1-1，9522-1-2等。
1.4 切片挑选将普通玻片进行脱蜡染色等步骤处理，观察其发育时期和制片质量。
将时期合适以及质量良好的蜡块编号记下，找到对应的处理过的玻片，准备进行TUNEL实验。
2. 石蜡切片预处理（室温下在染色缸中进行）2.1 试剂准备（以处理10片以内计算）1×PBS（pH 7.4）1L，灭菌NaCl 137mMKCl 268mMKH2PO4 1.47mMNa2HPO48.1mM去离子水 1L，灭菌甲醛溶液(37.0%-40.0%) 20mLNaCl溶液(8.5%) 10mL，灭菌2.2 切片预处理(1)切片脱蜡。
将切片浸入新鲜100%二甲苯5min，重复一次。
(2)100%乙醇洗涤5min。
(3)乙醇梯度脱水，100%、95%、85%、70%、50%各级3min。
tunel实验方法部分
(1)心肌组织固定：选取实验组心肌组织，切下心脏相同位置的绿豆粒大小一块心肌，展开放入包埋筐，将包埋筐浸没于4%多聚甲醛中24h~48h。
(2)脱水处理：根据心肌组织大小，选取合适的时间。
将包埋筐按照顺序分别浸没于75%乙醇1小时，80%乙醇1小时，95%乙醇1小时，无水乙醇Ⅰ1小时，无水乙醇Ⅱ1小时，二甲苯与无水乙醇1：1配制溶液30分钟，二甲苯Ⅰ30分钟，二甲苯Ⅱ30分钟。
(3)浸蜡处理：将经过脱水处理后的组织按照顺序分别浸没于石蜡Ⅰ45分钟，石蜡Ⅱ45分钟，石蜡Ⅲ1小时30分钟，取出包埋筐此时组织呈深褐色，坚固有光泽。
(4)组织包埋：采用徕卡包埋机（机器型号有待确认），将组织从包埋筐中取出，放置于铁质包埋盒底部，滴加液体石蜡，浸没组织，待液体石蜡液面离包埋盒顶部2-3毫米时停止滴加，放置到4度冰箱过夜。
(5)组织切片：将含组织的蜡块与包埋盒分离，采用徕卡切片机（机器型号有待确认），将蜡块底部有组织区域切成较小的正方形，放置于切片机固定蜡块处，将组织切成5微米的组织切片。
(6)展片，捞片和烤片：将组织切片放置于40度水浴锅中，用镊子轻轻将组织展开没有重叠区域，3-5min后用多聚赖氨酸处理过的带有正电荷的切片将组织捞起，放置于常温下将其沥干，然后放置于56度的烤箱中烤片2小时（增强组织的牢固性），取出将切片放入4度冰箱储存。
(7)(8)采用promega公司提供的DeadEnd™ Colorimetric TUNEL System试剂盒(9)1.常规脱蜡(10)将石蜡切片放置于60摄氏度水浴30min（增强组织的牢固性），将切片置于染色缸中，用二甲苯洗两次，每次10分钟（尽可能将石蜡完全脱掉，防止对后续实验影响），用无水乙醇洗两次，每次4min。
用 95%乙醇，80%乙醇和75%酒精各洗一次，每次4min。
用0.85%的NaCl溶液洗5min，再用PBS溶液洗5min。
(11)2凋亡检测(12)将组织切片放入盛有4%多聚甲醛的染色缸中洗15min，再用PBS洗5min。
tunel法检测细胞凋亡原理
tunel法检测细胞凋亡原理一、介绍细胞凋亡是细胞程序性死亡的一种形式，它在多种生理和病理过程中发挥重要作用。
tunel法（Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling）是一种常用的检测细胞凋亡的方法，它利用细胞凋亡时DNA断裂产生的末端暴露的3’-OH末端为基础，通过连接dUTP标记的核苷酸，再经过酶促反应形成标记物，最终通过染色和显微镜观察来检测细胞凋亡。
本文将深入探讨tunel法检测细胞凋亡的原理、步骤以及其优缺点和应用。
二、tunel法的原理1.细胞凋亡的DNA断裂细胞凋亡在DNA断裂的过程中，导致DNA链上产生单链和双链断裂，这些断裂可暴露3’-OH末端。
这些断裂的末端会暴露出来，为tunel法提供了基础。
2.核苷酸连接在tunel法中，细胞内的3’-OH末端与dUTP（脱氧尿嘧啶核苷酸）结合，形成连接的核苷酸。
3.核酸标记连接的核苷酸可以通过酶促反应来标记。
一般使用terminaldeoxynucleotidyl transferase（TdT）酶，它能够将标记物连接到核苷酸的3’-OH末端。
4.核酸染色标记后的核酸可以通过荧光染色或者抗体染色来可视化。
tunel法通常使用具有荧光标记的抗体，这样可以直接观察细胞凋亡的情况。
三、tunel法的步骤tunel法的主要步骤包括样品的处理、反应体系的建立、酶促反应和染色。
下面是一个通常的tunel法的实验步骤：1.样品的制备将要研究的细胞或组织制备成切片或细胞悬液的形式。
对于固定的组织样品，可以通过切片的方式得到。
2.反应体系的建立根据实验的需要，建立适当的反应体系。
通常使用含有一定浓度TdT酶和dUTP的反应缓冲液，其中还包括辅酶和其他必要的试剂。
3.酶促反应将反应体系与样品共同处理，保持一定的反应时间，以便TdT酶能够与3’-OH末端发生连接作用。
4.染色完成酶促反应后，使用荧光标记的抗体或者其他染料染色，以便观察细胞凋亡的情况。
TUNEL法检测细胞凋亡实验原理和方法tunel完成
TUNEL的原理 TUNEL的操作步骤 结果及注意事项
主要试剂
1. 缓冲液(Labeling Buffer)：
用于维持一定的反应条件，含有以下成分：500mmol/L二甲胂酸钾、 pH7.2 10mmol/L CoCl2 (氯化钴)、1mmol/L DTT(二硫苏糖醇)。
2.末端脱氧核糖核酸转移酶(TdT) ：
TUNEL的原理是：用荧光素（fluorescein）标记的脱 氧核糖核苷酸，在TdT 的作用下连接到凋亡细胞中 断裂DNA的3’-OH末端，用荧光显微镜即可观察结 果。在此基础上连接辣根过氧化酶标记的荧光素抗 体，可进一步放大检测信号，并且普通显微镜观察 实验结果。由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有 DNA的断裂，因而没有3’-OH形成，很少能够被染 色。
TUNEL原理
标 ’-OH末端 dUTP反应的关键酶
3.荧光素-dUTP ：
TdT的底物和本实验的标记物
4.蛋白酶K：
消化组织，增加细胞通透性
TUNEL的原理
凋亡细胞的特征是:内源性核酸内切酶被激活，细胞 自身的染色质DNA被切割，出现单链或双链缺口， 并产生与DNA断点数目相同的 3’-OH末端 。末端 脱氧核糖核酸转移酶(Terminal deoxynucleotidyl Transferase TdT)能将脱氧核糖核苷酸连接到DNA 的3’-末端。
TUNEL 法测凋亡操作步骤
TUNEL 法测凋亡操作步骤一、TUNEL检测原理TUNEL 细胞凋亡检测试剂盒是采用非同位素方法来检测细胞在凋亡过程中DNA 的断裂情况，可在原位快速准确地检测单个凋亡细胞。
本试剂盒适用于组织样本（石蜡包埋、冰冻和超薄切片）和细胞样本（细胞涂片）的凋亡原位检测。
其原理是细胞凋亡发生时，内源性核酸酶激活，使DNA的双链断裂或一条链出现缺口，产生一系列3’-OH末端，在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）作用下，组织细胞原位DNA切口可被标记上生物素-dUTP，即TUNEL（Terminal deoxynucleotidyl TransferaseBiotin-dUTP Nick End Labeling），可与连接了的辣根过氧化酶的链霉亲和素（Streptavidin-HRP）特异结合，在辣根过氧化酶底物二氨基联苯胺（DAB）的存在下，显示为棕色（过氧化物酶活性），特异准确地定位正在凋亡的细胞，在普通显微镜下即可观察和计数凋亡细胞；由于正的或正在增殖的细胞几乎没有DNA 的断裂，因而没有3'-OH 形成，很少能够被染色。
二、试剂盒组份组份10 assays25 assays 储存条件A：Equilibration Buffer 1.0 mL 2.5 mL -20 ℃B：Biotinylated Nucleotide Mix 10 μL 25 μL -20 ℃C：TdT Enzyme 10 μL 25 μL -20 ℃D：500×Proteinase K 10 μL 25 μL -20 ℃20×SSC 15 mL 38mL 4 ℃E：Streptavidin-HRP 10 μL 25 μL 4 ℃F：20×DAB Substrate Buffer 50 μL 125 μL 4 ℃G：20×DAB Chromogen 50 μL 125 μL 4 ℃H：20×Hydrogen Peroxide 50 μL 125 μL4 ℃三、操作流程1.操作流程概览2.细胞样本制备准备：● PBS：8.0g NaCl， 0.2 g KCl， 1.44g Na2HPO4，0.24g KH2PO4，溶于800ml去离子水中，HCl调pH至7.4，加水定容至1L。
TUNEL 法检测细胞凋亡的具体方法及详细步骤
TUNEL 法检测细胞凋亡的具体方法及详细步骤用了许多方法检测小鼠的肝脏、脑部、睾丸等组织的细胞凋亡，其中TUNEL 法做的最多，我购买的试剂盒主要是roche、promega 公司，结果大多数成功，偶尔也有失败。
TUNEL 法的实验原理基本原理：对不同组织切片先增加细胞膜通透性，然后让rTDT 和生物标记的dTUTP 进入细胞内，在rTDT 的辅助下dTUTP 与核断裂的 DNA 3』-OH 结合，再用HRP 标记的链霉亲和素与dTUTP 上的biotin 结合（每个链霉亲和素至少可以再结合3 个biotin 分子），最后用DAB、过氧化氢与SP 上的辣根过氧化物酶HRP 发生氧化、环化反应，形成苯乙肼聚合物而呈现棕褐色，最终通过计数每张切片上不同视野中TUNEL 阳性细胞的比例来判断细胞凋亡发生情况。
（小编碎碎念：掌握原理是做好实验的先决条件，不少人还以为是抗体抗原反应呢）TUNEL 实验中关键步骤1. 充分脱蜡和水化。
脱蜡可以先60ºC 20 min，再用使用二甲苯两次5-10 min；而水化用梯度乙醇从高浓度到低浓度浸洗，这些以便后面的结合反应充分、均匀；2. 把握好细胞通透的时间。
一般根据切片的厚薄，选择蛋白酶k 的孵育时间，常用10-30 min，几μm 切片用短时间；几十μm 切片用长时间，通过摸索达到既不脱片，有能够使后面的酶和抗体进入胞内。
3. 适当延长TUNEL 反应液的时间。
一般是37ºC 1 h，你也可以根据你的凋亡损伤程度，选择更长的时间，可长至2 h，但要结合你最终的背景着色。
4.DAB 显色条件的选择。
一般DAB 反应10 min 左右，结合镜下控制背景颜色，最长不超过30 min；promega 公司提供的DAB 液（桃红色），不利于辨认棕褐色，我不太喜欢。
5.PBS 的充分清洗。
我个人认为，在TUNEL 反应后和酶标反应后的清洗应十分严格，可增加次数达5 次，因为这些清洗直接决定最后切片的非特异性着色。
tunel法检测流程
tunel法检测流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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TUNEL检测方法
——DeadEndColorimetricTUNEL System试剂盒法检测原理：
细胞凋亡时，其DNA会产生3′-OH末端，而正常细胞则几乎没有。
使用末端脱氧核苷转移酶(TdT酶)将生物素标记的核苷酸连接到DNA的3′-OH末端。
再将辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素(StreptavidinHRP)结合在此核苷酸上。
StreptavidinHRP可与过氧化物酶的底物——过氧化氢和稳定的显色剂氨基联苯胺(DAB)产生深棕色反应。
即可通过光学显微镜观察到凋亡细胞。
材料
试剂盒（G7130）内容：
储存条件:
平衡缓冲液,TdT酶,生物素标记的核苷酸混合物，蛋白酶K：–20°C StreptavidinHRP,DAB20XChromogen,20XDAB底物缓冲液，20X过氧化氢：4°C 20XSSC，塑料盖玻片：室温保存
需自备：
PBS缓冲液
%过氧化氢溶液（用以抑制内源性过氧化氢酶）
固定液（例如：10%缓冲的福尔马林，4%多聚甲醛，4%无甲醇甲醛）
封固剂
用于组织的检测方法
由试剂盒内容制备：
20μg/ml 蛋白酶K工作液：
10mg蛋白酶K＋1ml 蛋白酶K 缓冲液r→10mg/ml 蛋白酶K 储备液→ 20μg/ml 蛋白酶K 工作液TdT酶反应液（使用时制备）：
2X SSC：
用去离子水1：10稀释20XSSC
StreptavidinHRP工作液：
以PBS500：1稀释StreptavidinHRP.
DAB混合液（使用时制备，避光，<30mins）：
950ul去离子水＋50ul20XDAB底物缓冲液＋50ulDAB20X色原体＋50ul20X过氧化氢
步骤：
1.%氯化钠溶液浸洗5mins（室温）
2.PBS浸洗5mins（室温）
3.4%多聚甲醛溶液或含10%福尔马林的PBS溶液中固定15mins（室温）
4.PBS浸洗二次，每次5mins（室温）
5.除去多余液体，滴加100μL 20μg/ml蛋白酶K工作液，覆盖组织。
置于平面，
孵育10--30mins（室温）。
6.染色缸内PBS浸洗5mins。
（室温）
7.4%多聚甲醛溶液或含10%福尔马林的PBS溶液固定5mins。
（室温）
8.PBS浸洗二次，每次5mins。
（室温）
9.除去多余液体，滴加100μL平衡缓冲液，覆盖组织。
置于平面，平衡5～10mins
（室温）。
10.置于冰上，除去多余液体，添加100μLTdT酶反应液，防止干燥。
37℃，湿盒
中孵育60min，（以使末端标记反应发生）。
（过程中应防止干燥）。
11.染色缸内2X SSC浸洗15mins（用于终止反应）。
（室温）
12.PBS浸洗三次，每次5min，（用于移去未结合的生物素标记的核苷酸）。
（室温）
13.%过氧化氢的PBS中浸洗3-5min（用以抑制内源性过氧化氢酶）。
（室温）
14.PBS浸洗三次，每次5min。
（室温）
15.加100μLStreptavidinHRP工作液，反应30min。
（室温）
16.PBS浸洗三次，每次5min。
（室温）
17.加100μLDAB混合液，直到呈现浅棕色背景，但背景不可太深。
18.去离子水漂洗若干次。
19.用水或永久的封片剂封片，水封片剂周围用指甲膏封住，显微镜下观察染色。
用于细胞的检测方法
需自备：
Poly-L-Lysine覆盖的切片：
在干净的载玻片表面铺poly-L-lysine（可以Sigma Cat.# P 892010倍稀释于水制得），在所需区域铺一薄层。
待干后，迅速以去离子水冲洗，空气干燥30--60mins。
4℃可储存7天。
% Triton X-100 溶液：
Triton X-100 溶于 PBS
TdT酶反应液（使用时制备）：
2X SSC：
用去离子水1：10稀释20XSSC
StreptavidinHRP工作液：
以PBS500：1稀释StreptavidinHRP.
DAB混合液（使用时制备，避光，<30mins）：
950ul去离子水＋50ul20XDAB底物缓冲液＋50ulDAB20X色原体＋50ul20X过氧化氢
步骤：
1.将细胞以PBS清洗，重悬后铺于Poly-L-Lysine覆盖的切片上，组织培养罩内
空气干燥约15mins
2.PBS清洗2次。
（室温）
3.4%多聚甲醛溶液或含10%福尔马林的PBS溶液，或10%福尔马林浸泡细胞
25mins。
（室温）
4.PBS浸洗二次，每次5mins。
（室温）
5.% Triton X-100 溶液浸洗5mins。
（室温）
6.PBS浸洗二次，每次5mins。
（室温）
7.除去多余液体，滴加100μL平衡缓冲液，覆盖组织。
置于平面，室温平衡5～
10mins。
8.置于冰上，除去多余液体，添加100μLTdT酶反应液，防止干燥。
37℃，湿盒
中孵育60min，（以使末端标记反应发生）。
（过程中应防止干燥）。
9.染色缸内2X SSC浸洗15mins（用于终止反应）。
（室温）
10.PBS浸洗三次，每次5min，（用于移去未结合的生物素标记的核苷酸）。
（室温）
11.%过氧化氢的PBS中浸洗3-5min（用以抑制内源性过氧化氢酶）。
（室温）
12.PBS浸洗三次，每次5min。
（室温）
13.加100μLStreptavidinHRP工作液，反应30min。
（室温）
14.PBS浸洗三次，每次5min。
（室温）
15. 加100μLDAB 混合液，直到呈现浅棕色背景，但背景不可太深。
16. 去离子水漂洗若干次。
17. 用水或永久的封片剂封片，水封片剂周围用指甲膏封住，显微镜下观察染色。
附：用于细胞的检测方法
——非试剂盒法
TUNEL 法检测SK-N-SH 细胞的凋亡
1. SK-N-SH 细胞于激光共聚焦专用玻璃培养皿中，PBS 洗涤，用4%的多聚甲醛（以
mol/L 42PO NaH 为溶剂 ，pH=固定细胞15 min ；
2. PBS 洗涤3次，每次5 min
3. 含有%Tween-20和%BSA 的PBS 室温孵育15 min
4. PBS 洗涤2 min
5. 每孔加入50μL TdT 混合物(TdT 缓冲液∶Biotin-dUTP ∶TdT 为90∶5∶5，体
积比，现配现用)室温孵育60 min
6. 吸弃TdT 混合物，加入1×TB 室温作用5 min
7. PBS 洗涤4次，每次2 min ；每孔滴加50 μL 的封闭液室温处理20 min
8. 现配的avidin-FITC 溶液 (用封闭液稀释)室温避光处理 30 min
9. PBS 洗涤3次，每次5 min ；
10. 200μL 的DAPI 室温作用6 min ，
11. PBS 洗涤3次，每次5 min 。
12. 激光共聚焦显微镜下观察，于高倍显微镜下(×400)每组随机选取视野，计数
凋亡细胞数和细胞总数(每组不少于200个)。