TUNEL检测方法
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TUNEL检测方法
——DeadEndColorimetricTUNEL System试剂盒法检测原理：
细胞凋亡时，其DNA会产生3′-OH末端，而正常细胞则几乎没有。使用末端脱氧核苷转移酶(TdT酶)将生物素标记的核苷酸连接到DNA的3′-OH末端。再将辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素(StreptavidinHRP)结合在此核苷酸上。StreptavidinHRP可与过氧化物酶的底物——过氧化氢和稳定的显色剂氨基联苯胺(DAB)产生深棕色反应。即可通过光学显微镜观察到凋亡细胞。
材料
试剂盒（G7130）内容：
储存条件:
平衡缓冲液,TdT酶,生物素标记的核苷酸混合物，蛋白酶K：–20°C StreptavidinHRP,DAB20XChromogen,20XDAB底物缓冲液，20X过氧化氢：4°C 20XSSC，塑料盖玻片：室温保存
需自备：
PBS缓冲液
%过氧化氢溶液（用以抑制内源性过氧化氢酶）
固定液（例如：10%缓冲的福尔马林，4%多聚甲醛，4%无甲醇甲醛）
封固剂
用于组织的检测方法
由试剂盒内容制备：
20μg/ml 蛋白酶K工作液：
10mg蛋白酶K＋1ml 蛋白酶K 缓冲液r→10mg/ml 蛋白酶K 储备液→ 20μg/ml 蛋白酶K 工作液TdT酶反应液（使用时制备）：
2X SSC：
用去离子水1：10稀释20XSSC
StreptavidinHRP工作液：
以PBS500：1稀释StreptavidinHRP.
DAB混合液（使用时制备，避光，<30mins）：
950ul去离子水＋50ul20XDAB底物缓冲液＋50ulDAB20X色原体＋50ul20X过氧化氢
步骤：
1.%氯化钠溶液浸洗5mins（室温）
2.PBS浸洗5mins（室温）
3.4%多聚甲醛溶液或含10%福尔马林的PBS溶液中固定15mins（室温）
4.PBS浸洗二次，每次5mins（室温）
5.除去多余液体，滴加100μL 20μg/ml蛋白酶K工作液，覆盖组织。置于平面，
孵育10--30mins（室温）。
6.染色缸内PBS浸洗5mins。（室温）
7.4%多聚甲醛溶液或含10%福尔马林的PBS溶液固定5mins。（室温）
8.PBS浸洗二次，每次5mins。（室温）
9.除去多余液体，滴加100μL平衡缓冲液，覆盖组织。置于平面，平衡5～10mins
（室温）。
10.置于冰上，除去多余液体，添加100μLTdT酶反应液，防止干燥。37℃，湿盒
中孵育60min，（以使末端标记反应发生）。（过程中应防止干燥）。
11.染色缸内2X SSC浸洗15mins（用于终止反应）。（室温）
12.PBS浸洗三次，每次5min，（用于移去未结合的生物素标记的核苷酸）。（室温）
13.%过氧化氢的PBS中浸洗3-5min（用以抑制内源性过氧化氢酶）。（室温）
14.PBS浸洗三次，每次5min。（室温）
15.加100μLStreptavidinHRP工作液，反应30min。（室温）
16.PBS浸洗三次，每次5min。（室温）
17.加100μLDAB混合液，直到呈现浅棕色背景，但背景不可太深。
18.去离子水漂洗若干次。
19.用水或永久的封片剂封片，水封片剂周围用指甲膏封住，显微镜下观察染色。
用于细胞的检测方法
需自备：
Poly-L-Lysine覆盖的切片：
在干净的载玻片表面铺poly-L-lysine（可以Sigma Cat.# P 892010倍稀释于水制得），在所需区域铺一薄层。待干后，迅速以去离子水冲洗，空气干燥30--60mins。4℃可储存7天。
% Triton X-100 溶液：
Triton X-100 溶于 PBS
TdT酶反应液（使用时制备）：
2X SSC：
用去离子水1：10稀释20XSSC
StreptavidinHRP工作液：
以PBS500：1稀释StreptavidinHRP.
DAB混合液（使用时制备，避光，<30mins）：
950ul去离子水＋50ul20XDAB底物缓冲液＋50ulDAB20X色原体＋50ul20X过氧化氢
步骤：
1.将细胞以PBS清洗，重悬后铺于Poly-L-Lysine覆盖的切片上，组织培养罩内
空气干燥约15mins
2.PBS清洗2次。（室温）
3.4%多聚甲醛溶液或含10%福尔马林的PBS溶液，或10%福尔马林浸泡细胞
25mins。（室温）
4.PBS浸洗二次，每次5mins。（室温）
5.% Triton X-100 溶液浸洗5mins。（室温）
6.PBS浸洗二次，每次5mins。（室温）
7.除去多余液体，滴加100μL平衡缓冲液，覆盖组织。置于平面，室温平衡5～
10mins。
8.置于冰上，除去多余液体，添加100μLTdT酶反应液，防止干燥。37℃，湿盒
中孵育60min，（以使末端标记反应发生）。（过程中应防止干燥）。
9.染色缸内2X SSC浸洗15mins（用于终止反应）。（室温）
10.PBS浸洗三次，每次5min，（用于移去未结合的生物素标记的核苷酸）。（室温）
11.%过氧化氢的PBS中浸洗3-5min（用以抑制内源性过氧化氢酶）。（室温）
12.PBS浸洗三次，每次5min。（室温）
13.加100μLStreptavidinHRP工作液，反应30min。（室温）
14.PBS浸洗三次，每次5min。（室温）