谷氨酸棒杆菌S9114摇瓶发酵产γ-氨基丁酸的研究

谷氨酸棒杆菌S9114摇瓶发酵产γ-氨基丁酸的研究
斯晗;史锋
【摘要】为实现谷氨酸棒杆菌工业化生产γ-氨基丁酸(GABA),对L-谷氨酸工业生产菌S9114进行代谢途径改造.通过构建一株工程菌株S9114/pJYW-4-gadB 1-gadB2,将来源于短乳杆菌Lb85菌株的谷氨酸脱羧酶编码基因gadB1和gadB2进行共表达,实现发酵72 h后发酵液中GABA含量达到32.8 g/L,GABA糖酸转化率达到47.3％.通过敲除该菌株的谷丙转氨酶编码基因alaT,使工程菌株
S9114△ala T/pJYW-4-gadB1-gadB2发酵液中L-丙氨酸浓度降低5.5％,进一步降低了发酵副产物的含量.研究结果为利用谷氨酸棒杆菌实现工业化生产γ-氨基丁酸提供了有价值的参考.%In order to produce gamma-aminobutyric acid (GABA) by Corynebacterium glutamicum,metabolic engineering of GABA in reconmbinant C.glutamicum S9114 was investigated.By expressing exogenous gad genes (gadB1 and gadB2) from Lactobacillus brevis Lb85 which encoded glutamic acid decarboxylase (GAD),S9114/pJYW-4-gadBl-gadB2 was constructed.After fermented for 72 h,GABA production was 32.8 g/L and the conversion rate of glucose to GABA was 46.3％.By deleting alaT which encoded alanine aminotransferase,S9114△alaT/pJYW-4-gadB1-gadB2 was constructed.Fermentation results showed that the L-alanine production in S9114△alaT/pJYW-4-gadB1-gadB2 was 5.5％ lower than that in S9114/pJYW-4-gadB1-gadB2,which further reduced the content of the by-products.This study provided a valuable basis for the industrialized production of GABA by C.glutamicum.
【期刊名称】《工业微生物》
【年(卷),期】2017(047)001
【总页数】6页(P31-36)
【关键词】GABA;谷氨酸棒杆菌;S9114;alaT
【作者】斯晗;史锋
【作者单位】江南大学食品科学与技术国家重点实验室,无锡214122;江南大学食品科学与技术国家重点实验室,无锡214122;江南大学生物工程学院工业生物技术教育部重点实验室,无锡214122
【正文语种】中文
γ-氨基丁酸(γ-Aminobutyric acid，简称GABA)是一种天然的非蛋白质氨基酸，广泛存在于各种动物、植物和微生物体内[1]。

它是由谷氨酸脱羧酶(Glutamate decarboxylase，简称GAD)催化L-谷氨酸发生α-脱羧反应生成的。

1950年，Roberts[2]等人第一次在哺乳动物的脑萃取液中发现了GABA的存在，但没有对其主要功能进行研究。

随着研究的不断深入，发现GABA是哺乳动物中枢神经系统中一种重要的抑制性神经递质，具有抗焦虑、降血压、镇痛等多种功能[3]。

2009年，国家卫生部将其定为新资源食品。

近几年，GABA已经进入工业化生产阶段，并被广泛的应用于食品、医药和化工等行业中[4]。

目前，GABA的生产方法主要分为化学合成法、植物富集法和微生物发酵法。

其中，微生物发酵法由于其反应温和，能够大量合成GABA，适合工业化生产，并且使用GRAS菌株(Generally Recognized as Safe)生产的GABA可应用于食品和医药行业，因此成为研究的热点。

以乳酸菌等为出发菌生产GABA需要外源添
加前体物质L-谷氨酸或L-谷氨酸钠盐。

谷氨酸棒杆菌作为氨基酸的工业生产菌，
自身能够大量合成GABA的前体物质L-谷氨酸，通过转入外源gad基因能够实现从葡萄糖到GABA的“一步转化”，有利于工业化生产。

实验室前期在谷氨酸棒杆菌ATCC13032中共表达来源于短乳杆菌Lb85菌株的两个GAD编码基因(gadB1和gadB2)使菌株自身合成的L-谷氨酸在外源表达的GAD蛋白催化下生成GABA，并且通过调整玉米浆浓度、氮源添加量和添加方式
等发酵条件优化手段提高GABA产量，发酵72 h终产量为(18.7±2.1) g/L[5]。

本文选取一株工厂来源的谷氨酸棒杆菌S9114作为出发菌株，该菌为L-谷氨酸高产菌，以此为对象构建基因工程菌株，并对其发酵产GABA的效能进行研究。

同
时敲除该菌的谷丙转氨酶编码基因alaT，以减少发酵副产物L-丙氨酸，为利用谷
氨酸棒杆菌进行GABA工业化生产提供有价值的参考。

1.1 材料
1.1.1 菌株、质粒和引物
文中所用菌株和质粒均列于表1中，所用引物均列于表2中。

1.1.2 酶和试剂
工具酶：Ex-Taq DNA聚合酶和Taq DNA聚合酶购买于大连宝生物公司；DNA
限制性内切酶和T4 DNA连接酶购买于Fermentas公司。

试剂：脑心浸液、酵母膏和蛋白胨购买于英国OXOID公司；D-山梨醇、卡那霉
素和琼脂糖购买于上海捷瑞生物工程有限公司；高效液相用色谱纯乙腈和甲醇购买于上海安普科学仪器有限公司；其它试剂都购买于国药集团上海化学试剂有限公司。

试剂盒：质粒提取试剂盒和细菌基因组DNA提取试剂盒都购买于天根生化科技有限公司；PCR产物纯化试剂盒和琼脂糖凝胶回收试剂盒都购买于上海生物工程有
限公司；总RNA提取试剂盒和cDNA反转录试剂盒都购买于BioFlux试剂公司。

1.1.3 主要仪器
文中所用仪器列于表3中。

1.1.4 培养基
发酵种子培养基[8](g/L)：葡萄糖25，玉米浆30，尿素8，K2HPO4·3H2O 1，MgSO4 0.2，pH 7.2，重组菌培养时加入终浓度为30 μg/mL的卡那霉素。

摇瓶发酵培养基(g/L)：葡萄糖100，玉米浆2，K2HPO4·3H2O 2，MgSO4 0.4，MnSO4·H2O 0.002，FeSO4·7H2O0.002，pH 7.2，接种前加尿素4(单独灭菌)，发酵10 h～24 h间隔补加尿素6次，每次2.4 g/L，重组菌发酵时加入终浓度为30 μg/mL的卡那霉素。

1.2 方法
1.2.1 敲除菌株的构建
谷氨酸棒杆菌中基因敲除采用谭延振[9]等报道的方法，即同源重组和位点特异性
重组敲除系统。

以谷氨酸棒杆菌S9114基因组为模板，分别以alaTU-F/alaTU-R
和alaTD-F/alaTD-R为引物，PCR扩增得到alaT基因的上下游同源臂片段alaTU 和alaTD。

然后以质粒pDTW202为模板扩增得到两端带有lox位点的kan基因
片段。

最后将alaT基因的上下游片段、kan片段和pBluescript II SK质粒酶切纯化后进行连接，得到alaT基因敲除质粒pBS-ΔalaT。

将构建好的alaT敲除质粒电转入S9114菌株中，经过同源重组使目的基因片段和kan片段发生替换后，再将携带cre基因的pDTW109质粒电转入其中，使Cre
酶与kan两端lox位点发生特异性重组从而去除kan片段，最后提高温度去除温
敏性pDTW109质粒，得到的新菌株即为alaT基因敲除菌株S9114ΔalaT，构建
图如图1。

分别制备S9114和S9114ΔalaT菌株感受态细胞，将pJYW-4-gadB1-gadB2质粒电转入感受态细胞中，挑取转化子验证正确，得到新菌株S9114/pJYW-4-gadB1-gadB2和S9114ΔalaT/pJYW-4-gadB1-gadB2。

1.2.2 谷氨酸棒杆菌摇瓶发酵
谷氨酸棒杆菌摇瓶发酵方法参照江君君[5]等，具体操作如下：
菌种活化：将冻存管保存的谷氨酸棒杆菌重组菌在具有卡那霉素抗性的LBG平板
上划线活化，30 ℃培养约36 h。

种子培养：将活化好的菌种转接到谷氨酸棒杆菌种子培养基中，30 ℃，110
r/min(往复式摇床)培养约8 h。

摇瓶发酵：将种子液按终OD=1.9转接到发酵培养基中，30 ℃，110 r/min(往复式摇床)进行发酵，10 h～24 h分次补加尿素，每次补加2.4 g/L。

定点取样，HPLC测定氨基酸含量变化。

1.2.3 发酵参数测定
残糖测定：样品12 000 r/min离心2 min，取上清，ddH2O稀释，用生物传感
器即时测定葡萄糖含量。

氨基酸含量测定：使用HPLC测定样品中各氨基酸含量，使用方法为邻苯二甲醛(OPA)自动柱前衍生化法[10]。

1.2.4 基因转录水平分析
针对摇瓶发酵结果取24 h发酵液菌体对相关基因进行了荧光定量PCR(RT-PCR)
分析[11]，具体操作见RNA提取试剂盒说明书、cDNA反转录试剂盒说明书。

反应结束通过Ct值来比较基因转录水平的差异，以16sRNA作为内参以减少误差，具体算法使用Livak[12]等的2-ΔΔCt法。

2.1 S9114/pJYW-4-gadB1-gadB2菌株产GABA研究
首先用菌株S9114进行L-谷氨酸发酵，发酵36 h 发酵液中L-谷氨酸浓度达到(36.7±3.8) g/L，糖酸转化率达到48%。

HPLC分析结果显示，发酵液中除目的产物L-谷氨酸外，只有L-丙氨酸一种氨基酸副产物，发酵36 h L-丙氨酸浓度为3.0 g/L。

随后对菌株S9114/pJYW-4-gadB1-gadB2产GABA的能力进行考察，对10 h～24 h补加尿素5次(总补加量12 g/L)和6次(总补加量14.4 g/L)进行对比，发酵24 h补加葡萄糖30 g/L。

发酵结果如图2所示。

由图2可知，尿素补加12 g/L组72 h OD为33.2，尿素补加14.4 g/L组72 h OD为31.2，说明尿素补加量没有对菌株生长产生明显影响。

尿素补加12 g/L组的总糖耗比尿素补加14.4 g/L组低16.6 g/L。

发酵结束时尿素补加12 g/L组L-谷氨酸含量为7.1 g/L，GABA含量为26.3 g/L，GABA摩尔转化率为84.0%；尿素补加14.4 g/L组L-谷氨酸含量为6.9 g/L，GABA含量为32.8 g/L，GABA摩尔转化率为87.1%。

因此尿素补加14.4 g/L组的GABA终产量要高于尿素补加12 g/L组，且GABA糖酸转化率达到47.3%，说明菌株S9114/pJYW-4-gadB1-gadB2具有较好的GABA生产能力。

2.2 alaT敲除质粒及菌株的构建
由于L-丙氨酸是菌株S9114发酵产物中唯一的杂质氨基酸，减少L-丙氨酸的产生有助于提高发酵产物的纯度。

L-丙氨酸在生物体内可由丙酮酸在谷丙转氨酶的催化下发生转氨反应生成，因此本文尝试敲除谷丙转氨酶的编码基因alaT。

alaT敲除质粒及菌株的构建电泳验证图如3，以alaTU-F/alaTD-R为引物，泳道1为S9114ΔalaT，扩增得到片段大小为2 199 bp，泳道2为含有完整alaT基因的S9114，扩增片段大小为3 082 bp，说明S9114ΔalaT构建成功。

2.3 S9114ΔalaT/pJYW-4-gadB1-gadB2菌株发酵产GABA研究
首先用菌株S9114ΔalaT进行L-谷氨酸发酵，发酵36 h 发酵液中L-丙氨酸浓度为2.0 g/L，比对照菌S9114的L-丙氨酸产量减少了11.4%。

随后对菌株S9114ΔalaT/pJYW-4-gadB1-gadB2发酵产GABA过程中的杂酸生成情况进行考察，结果如图4所示。

从图4(a)可看出，S9114ΔalaT/pJYW-4-gadB1-gadB2和S9114/pJYW-4-
gadB1-gadB2发酵72 h后的OD值相近(分别为31.0和29.2)，而两菌发酵产
L-谷氨酸和GABA总含量相当，为0.26 M(图4(b))。

菌株S9114/pJYW-4-
gadB1-gadB2发酵72 h 产L-丙氨酸4.1 g/L，敲除alaT基因后L-丙氨酸产生量为3.8 g/L，减少了5.5%(图4(c))，说明敲除alaT基因确实可以减少菌株
S9114/pJYW-4-gadB1-gadB2在发酵过程中的丙氨酸产生量，但降低不明显。

2.4 S9114ΔalaT/pJYW-4-gadB1-gadB2菌株的RT-PCR分析
文献报道[13]表明，谷氨酸棒杆菌中的谷丙转氨酶AlaT和缬氨酸转氨酶AvtA是
与L-丙氨酸合成相关的两个转氨酶，分别敲除它们的编码基因alaT或avtA后都
能够使L-丙氨酸含量减少，而ΔalaT菌株相较于ΔavtA菌株L-丙氨酸合成量较低，两株敲除菌都能够在基本培养基上生长。

由于使用S9114ΔalaT/pJYW-4-gadB1-gadB2发酵未能达到显著减少副产物L-
丙氨酸的预期效果，用RT-PCR对重组菌的缬氨酸转氨酶编码基因avtA的转录水平进行分析，结果发现该菌的avtA基因转录水平相比对照菌S9114/pJYW-4-gadB1-gadB2提高了1.82倍，考虑原本发酵液中L-丙氨酸浓度较低，敲除alaT 基因后avtA基因的转录水平上调，结果导致发酵液中L-丙氨酸浓度未发生明显下降。

本文选取一株L-谷氨酸工业生产菌S9114作为出发菌株，首次以谷氨酸棒杆菌工业生产菌株为目标，考察外源GAD表达后菌株发酵产GABA的能力。

文中所构建的菌株S9114/pJYW-4-gadB1-gadB2摇瓶发酵72 h，GABA产量可达32.8 g/L，糖酸转化率为47.3%。

与实验室前期构建的菌株ATCC13032/pJYW-4-gadB1-gadB2相比，同条件下发酵产 GABA的能力提高了64%，说明S9114/pJYW-4-gadB1-gadB2可以作为工业生产GABA的优良候选菌株。

随后构建了alaT基因敲除菌株S9114ΔalaT/pJYW-4-gadB1-gadB2，但发酵副
产物L-丙氨酸浓度比同条件下使用对照菌S9114/pJYW-4-gadB1-gadB2降低了
5.5%。

经RT-PCR分析发现，L-丙氨酸浓度未发生显著减少的主要原因是
S9114ΔalaT/pJYW-4-gadB1-gadB2中avtA基因的转录水平上调所致。

后继可考虑采用继续敲除avtA基因及外源添加少量L-丙氨酸的策略来控制发酵液中L-丙氨酸的浓度，从而进一步提高目标产物的纯度。

并可使用发酵发大来进一步提高GABA的产量。

本文为实现利用谷氨酸棒杆菌“一步法”生产GABA的工业化提供有价值的参考。

*通信作者：史锋(1970～)，女，副教授，硕士研究生导师。

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【相关文献】
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