实验四 根系活力的测定

实验四根系活力的测定

一、意义

根系是植物对水分和矿质营养的主要吸收器官，同时又是植物体中重要物质如氨基酸、激素等物质合成、同化、转化的器官，因此根的生长情况和活动能力直接影响植物个体的生长情况、营养水平和产量水平等具有重要的实际意义。

在科学研究中常把根系的呼吸强度、阳离子代还量（CEC）、对有色物质的吸附量和ATP酶的活性等作为作物根系活力的指标。

二、测定原理

TTC（2，3，5－氯化三苯基四氮唑）的氧化态是无色的，可被氢还原成不溶性的红色三苯基甲月朁（TTF）。具有活力的组织和细胞在呼吸作用中，脱氢酶催化底物氧化脱氢产生NADH、NADPH 等还原性物质，当TTC渗入组织或细胞时呼吸过程产生的还原物质可将其还原成TTF（红色），组织或细胞被染成红色。死细胞无呼吸，不发生这样的氧化还原反应。应用这一原理，可根据组织或细胞染色情况来检测种子、花粉、根系等的活力。

植物根引起的TTC还原，可因加入琥珀酸、延胡索酸、苹果酸得到加强；而被丙二酸、碘乙酸所严重抑制。还原强度（即根系活力强弱）可用TTF的生成量来表示。TTF在485 nm 处有吸收峰，用乙酸乙酯提取后测定OD485，通过标准曲线计算TTF的生成量，用单位时间

内单位根重产生的TTF表示根系的活力。

三、仪器设备

1.分光光度计；

2.分析天平（感量0.1mg）；

3.托盘天平（感量0.1 g）；

4.温箱；

5.研钵：1套；

6．4 cm漏斗：2 个；

7.量筒10 mL：1 个；

8.刻度移液管：0.5 mL、2 mL、5 mL；

9．10 mL容量瓶（或10 mL具塞刻度试管）：8个；

10．试管架：1 个；

11.石英砂适量；

12.高型称量瓶（30×60 mm）：2 个。

四、试剂

1.乙酸乙酯（分析纯）；

2.连二亚硫酸钠（Na2S2O4），分析纯，粉末；

3．1 %TTC溶液：准确称取TTC 1.0000 g，溶于少量水中，定容到100 mL，用时稀释至需要浓度；

4．0.1 mol ·L -1 pH 7.5磷酸缓冲液；

5．1 mol ·L -1 硫酸：用量筒取比重1.84的浓硫酸55 mL，边搅拌边加入盛有500 mL蒸馏水的烧杯中，冷却后稀释至1000 mL；

6．0.4 mol ·L -1琥珀酸：称取琥珀酸4.72 g，溶于水中，定容至100 mL。

五、材料

种子萌发后用Hoagland营养液进行培养，采用水培或砂培的方法培养植物材料。生长一定时间后取根系作为实验材料。

六、方法步骤

1.定性测定

（1）配制反应液：把1 %的TTC溶液，0.4％mol ·L -1的琥珀酸和0.1 mol ·L -1 pH 7.5磷酸缓冲液按1∶5∶4的比例混合。

（2）将根仔细洗净，把地上部分从茎基切除。然后将根放入带盖的称量瓶中，倒入反应液，以浸没根为度。置37 ℃暗箱中1 h，以观察着色情况。新根尖端几毫米以及侧根部分明显地变成红色，表明该处具有活跃的脱氢酶存在。

2.定量测定

（1）TTC标准曲线的制作：吸取0.1 mLTTC标准液（含TTC 10 mg ·mL -1）放入10 mL容量瓶，加少许Na2S2O4粉末，摇匀后即产生红色的甲月朁。再用乙酸乙酯定容至刻度，摇匀。然后分别取此液0.25、0.50、1.00、1.50、2.00 mL置10 mL容量瓶中，以乙酸乙酯定容至刻度，即得到含甲月朁0.025、0.05、0.10、0.15、0.20 mg的标准比色系列。以空白作参比，在485 nm 波长下测定吸光度（OD485），以甲月朁浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。

（2）取根尖1cm切段0.5 g，放入称量瓶，加入1 % TTC溶液和0.1 mol ·L -1磷酸缓冲液的等量混合液10 mL，把根充分浸没在溶液内，在37 ℃下保温1 h。加入1 mol ·L-1硫酸2 mL，以终止反应。

（3）取出根尖，擦干水分后与3～5 mL乙酸乙酯和少量石英砂一起在研钵内研碎，以提取甲月朁。把红色浸提液滤入试管，并用少量乙酸乙酯把残渣洗涤2～3次，滤入试管，最后

用乙酸乙酯定容10 mL。在波长485 nm下比色，以空白试验（先加入硫酸再加入根样品，其他步骤同上）作参比读取吸光度。

七、结果计算

查标准曲线，即可求出TTC还原量。

TTC还原强度＝

TTC还原量（g）根重（g） 时间（h）

八、注意事项

在对材料根系的操作中切忌对根的损伤，以免对实验结果带来影响。

九、思考题

试分析活力测定中根系着色深浅不同的原因。