液相色谱定量方法指导原则42页PPT
【精品课件】高效液相色谱定性定量分析方法
定量分析基本要求
• 要有纯物质做标准 • 被定量组分峰要与其他组分达到基线分离 • 符合定性参数要求 • 选择合适定量方法
定量分析基本公式
• 在某些限定条件下，被测组分的浓度与检测器的 响应值成正比的关系。（蒸发光散射检测器浓度 与峰面积不成线性，分别取对数后呈线性。）
两谱联用技术
1 如果标准物质缺乏或难以获得；或由于结构、理 化性质相似，很多物质具有十分接近，甚至相同 的保留值，则保留值定性准确度存在疑问。
2 可以运用红外光谱、紫外光谱、核磁共振光谱和 质谱对化合物进行定性，目前两用技术有： HPLC-紫外光谱，HPLC-红外光谱，HPLC-MS, HPLC-NMR等。
高效液相色谱定性定量分析方法
色谱分析的目的：
对未知组分进行定性分析 对已知组分进行定量分析
根据色谱图上某个色谱峰的保留时间和该色谱峰 在检测器上的响应信号强度，对该谱峰进行初步定性 定量分析。
液相色谱定性分析 液相色谱定量分析 影响定量分析的因素
色谱峰的定性鉴别：
通过保留值（通常指保留时间）进行定性 需要制定保留时间误差范围
• 相关系数—用来表示线性关系的好坏程度；
• 相关系数越接近1，说明线性关系越好；
• 绘制标准工作曲线时一般选取3-6个不同浓度 的标准样品，相关系数起码应在0.95以上。
如达不到要求，可பைடு நூலகம்存在以下原因：
1 所选浓度范围使检测器的响应值超出了该检测器
2
响应值的线性范围；
2 实验数据的精密度太差，过于分散。
3 无论何种原因，都应重新绘制标准工作曲线 。
经典液相色谱法 ppt课件
和薄层色谱。
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3
1.2 吸附色谱法的依据
吸附过程的两个规律： 1）吸附过程是可逆的，存在着吸附 平衡,存在一个吸附平衡常数 解附的动态
K=Cs/Cm
2）吸附剂对不同物质的吸附行为有差异
ppt课件 4
吸附机理
流动相通过固定相时，吸附剂表面的活性中心吸附流
动相分子，当组分分子进入柱子时，会赶走流动相分 子而占据吸附剂的活性中心位，即组分被吸附；反之， 溶剂分子也可把溶质分子赶走，即解吸。
SO3H CH CH2 CH
SO 3H CH2 CH
SO3H CH2 CH
SO3H CH2 CH
SO3H
SO3H
SO3H
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SO3H
SO3H
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交换反应： R-SO3-H+ + Na+ + ClR-SO3- Na+ + H+ + Cl-
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1.2 阴离子交换树脂
根据可交换的离子的不同
低交联度树脂－网状结构疏松，网眼大，具有较好的渗 透性，但存在着易变形和耐压差等缺点。
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根据分离对象选择树脂交联度：
分离小分子物质（氨基酸） ——选择8%树脂为宜
分离分子量较大的物质（多肽）
——选择2－4%树脂为宜
保留：极性越小的组分保留越强
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3. 载体
作用：负载固定液 要求：化学惰性，粒度小而均匀，纯净，与固定液间
有较大的分子间作用力。
常用载体：硅胶 、硅藻土 、纤维素
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4. 固定液相与流动液相
HPLC定量原理及方法ppt
液相色谱实用技术(一) HPLC定量原理及方法液相色谱定量分析的基本原理❀在定性的基础上定量,需有纯物质作为标准物❀液相色谱定量是相对定量的方法:即由已知量的纯被测物标样推算混合物中被测物的量❀液相色谱法定量的依据是:✎被测组分的量与响应值(峰高或峰面积)成正比✎由已知量的标样可求得定量校正因子✎定量校正因子:是定量计算公式中的比例常数,其物理意义是单位响应值(峰面积)所代表的被测组分的量✎测定未知组分的响应值,通过定量校正因子即可求得其含量液相色谱定量分析的基本步骤❀开发一个适合定量分析的色谱方法:确认被检测组分峰,并达到分离度(R)大于1.5确定被测组分色谱峰的一致性确定方法的检测限及定量限;灵敏度及线性范围❀用不同浓度的标准样品建立校正曲线❀考查定量方法的准确度及精密度❀用M32色谱管理系统实施样品采集,数据处理及报告结果鉴别需定量的色谱峰(定性)❀定性鉴别每个要定量的色谱峰✎通过比较保留值(通常是保留时间)的方法,找到各色谱峰所对应的组份✎大多数情况下用与标样比较保留时间来定性❀即所谓：➀保留时间相同，可能是同样的组份➁保留时间不同，肯定不是同样的组份用保留时间定性❀用“标样”的保留值定出被测组份的位置0.000.050.100.150.200.250.300.350.400.000.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50 6.00 6.507.00AUMinutesUracilEthylparabenPropylparaben进一步的确认(定性)❀标准加入❀同时用其他方法✎其他色谱方法（改变机理，如：用不同的色谱柱）✎其他检测器➠PDA，光谱图比较、谱库检索➠MS，质谱图解析、谱库检索✎其他仪器方法标准加入法举例❀废水样品中五氯苯（PCP）的分析梯度曲线梯度曲线PCP 4 ppm 3 ppm 2 ppm 1 ppm确认定量峰的一致性❀确认色谱峰的纯度✎保证每个色谱峰下只有一个被测的组份✎检查是否有共流出的物质（杂质）干扰❀色谱峰纯度确认的方法✎用光电二极管矩阵(PDA)检测器比较光谱图✎峰纯度鉴定,2487双波长RatioPlot✎996的纯度角理论色谱峰定性中常见问题❀鉴定色谱峰(定性)时常见问题如下:✎被鉴定峰丢失✎色谱图中出峰比预想的少✎色谱图中出峰比预想的多(鬼峰)色谱峰定性中常见问题分析❀被鉴定峰丢失✎保留时间改变✎数据处理系统中输入值不正确❀色谱图中出峰比预想的少✎样品分解✎色谱柱分辨率丧失✎用错流动相✎梯度洗脱时平衡不足(例如,过早将手动进样器扳至(Load)位置色谱峰定性中常见问题分析(续)❀色谱图中出峰比预想的多(鬼峰):✎样品分解或制样时导入了杂质✎流动相被污染,或用错流动相✎流动相中含有稳定剂或稳定剂发生变化✎前次进样的后流出物(某些RT值特大的组分)✎进样器被污染,洗针系统出问题或注射器脏✎未充分平衡进样器Loop管✎保护柱脏,色谱柱被污染,分辨率下降HPLC定量分析的常用术语(1)❀样品(Sample):含有待测物,供色谱分析的溶液❀样品类型(Sample Type)分为标样和未知两种:标样(Standard) : 浓度已知的纯品;未知样(Unknow):浓度待测的混合物❀样品量(Sample Weight):待测样品的原始称样量❀稀释度(Dilution):未知样品的稀释倍数❀组分(Componance):欲做定量分析的色谱峰,即含量未知的被测物❀组分的量(Amount):被测物质的含量(或浓度)HPLC定量分析的常用术语(2)❀积分(Integrity):由计算机对色谱峰进行峰面积测量的计算过程❀定量限:可以准确定量的样品最低量,一般要求色谱峰的S/N＞10:1❀校正曲线(Calibration Curve):组分含量对响应值的线性曲线,由已知量的标准物建立,用于测定待测物的未知含量常用的定量方法❀标准曲线法,分为外标法和内标法:❀外标法✎在液相色谱中用得最多❀内标法✎准确，但是麻烦✎在标准方法中用得最多外标法定量❀配制一系列已知浓度的标样储存标样工作标样01234增加溶质的浓度外标法定量（二）❀采集不同浓度标样的色谱图❀积分,按外标法定量计算,建立标准曲线05010015020025001,0002,0003,0004,0005,000样样样样响应值峰面积()标准曲线0.000.050.100.150.200.250.300.000.501.001.502.002.503.003.504.004.505.005.506.006.507.00M in u t e s0.000.050.100.150.200.250.300.000.501.001.502.002.503.003.504.004.505.005.506.006.507.00M in u te s 0.000.050.100.150.200.250.300.000.501.001.502.002.503.003.504.004.505.005.506.006.507.00M in u t e s外标法定量（三）❀计算公式❀特点✎无需各组份都被检出、洗脱✎需要标样✎标样及样品测定的条件要一致✎进样体积要准确iX i i i X A RF C X R X C RF i i 样品响应值未知组分的浓度∶标样响应值标样浓度校正因子∶×==)()()()(内标法定量（一）❀配制一系列浓度的标样，其中加有内标样储存标样+ 储存内标样工作标样01234增加溶质的浓度内标样浓度不变内标法定量（二）❀采集不同浓度标样的色谱图❀积分,按内标法定量计算,建立标准曲线0.000.200.400.600.801.001.201.401.601.80 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50 6.00v o lts M in u te sM e th ylP a ra b e n E th y lP a ra b e n P ro p y lP a ra b e n B u ty lP a ra b e n 05010015020025001020304050样样样样标样峰面积内标样峰面积标准曲线内标法定量（三）❀计算公式：❀特点：✎无需各组份都被检出、洗脱✎需要标样，需要内标样✎结果与进样体积无关..)()()()().(s i i X i i i X A A RF C X C X R S I R RF i i 内标峰面积样品峰面积未知组分的浓度∶标样浓度标样响应值内标样响应值校正因子∶×=×=内标法定量（四）❀对内标物的要求✎化学结构与待测组分相似(同系物、异构体)✎在样品中不存在✎不与样品中组份发生任何化学反应✎保留值与待测组分接近✎浓度（响应值）与待测组分相当✎其色谱峰与其它色谱峰分离好定量分析的数据处理方法❀Millennium 32包含外标和内标法计算的程序❀处理结果自动存贮至Project 的Result 中❀M 32定量处理的程序如下:✎调用标样(Standard Standard)的色谱图,在“向导”(Wizard Wizard)的指引下建立一个处理方法(Processing Method Processing Method),将欲定量的峰填入组分表中✎在Project 的Channal 菜单中,选中欲进行定量计算的有关数据文件(按标准standard 在前,未知Unknown 在后的顺序),给标样组分表中的各组分填入Amount 值并存贮Save 之✎按动工具条中的Process 处理器,则软件自动处理并保存结果定量分析的数据处理方法(续)打开一个最低浓度的标样(类型为Standard)色谱图,建立处理方法(Processing Method)定量分析的数据处理方法(续)用建立的处理方法计算欲定量的样品定量分析的数据处理方法(续)在Project的Result标签下,观察并报告定量结果液相色谱定量的精密度❀测量的精密度好的精度不好的精度精密度的衡量❀ 测量精密度的计算)100(X%12)(X σσ=−å−=å=CV N X i X Ni X 变异系数∶标准偏差∶平均值∶液相色谱定量的准确度❀误差∶✎E = O - T➠O∶观测到的值➠T∶真值准确度的衡量❀色谱方法是相对定量方法，如不考虑损失及杂质干扰等因素，其结果同“标样”的准确程度密切相关❀一般的衡量方法是做回收率实验或不同方法之间的比较：相关系数❀相关系数：➠其中，X 及Y 分别代表不同方法的实验值及平均值åå−−−−=22)()())((Y Y X X Y Y X X r i i i i准确度的影响因素❀峰面积的测量精度(积分误差)❀校正因子的测量精度(标准曲线的r2)❀样品的稳定性和代表性,均匀性(样品是否溶于流动相)❀进样器的准确度,进样技术❀色谱方法的可靠性(保留时间的重现性)❀色谱泵的精确度（GPC的影响更大）❀检测器的灵敏度,线性范围,检测限进样技术对定量结果的影响❀固定体积定量管（loop）的进样器精度最好，其准确度取决于进样器的结构❀可变体积进样器的精度取决于操作者的技术，准确度通常更高，因为进样用的注射器结构的准确度高，操作者的技术水平也有影响，但不大❀717及2690自动进样器精确度及准确度都可达到定量管进样器的水平，因为其每一微升分27步以上。
二十章经典液相色谱法-PPT精品
第一节 吸附色谱法
(一)吸附与吸附平衡 吸附是吸附剂、溶质、溶剂分子三者之间的复
杂相互作用。 吸附平衡常数K
K 溶 溶质 质在 在流 固动 定相 相中 中的 的浓 浓CC度 度 ms
不同的溶质有不同的K值，一个组分的色谱特性 完全由吸附平衡常数K决定。
第一节 吸附色谱法
K值大说明该物质被吸附得牢，在固定相中 停留时间长，在柱中移动速度慢；
Rst值可以大于1
第一节 吸附色谱法
1．间接定量法 (洗脱测定法) 薄层展开后，将被测物
斑点或区带捕集，用溶剂洗 脱，然后再用适当的分析方 法(比色法、分光光度法、 气相色谱、荧光分析法等)
2．薄层扫描法 该法快速、简便，结果灵敏、准确，适用于多
组分物质和微量组分的定量。 （1）薄层扫描仪
薄层扫描仪光学 系统结构示意图
量，至少要点在同一薄层板上二种不同浓度的对照 品溶液(或一种浓度两种点样量) 。
CF1AF2
F1 和F2都是通过测量随行的对照品溶液的浓度（C1和C2）和 峰面积（A1和A2）求出，所以这种方法又叫随行标准法。
第一节 吸附色谱法
②内标法 本法与外标法的主要区别，在于用内标法时面
积累计值为被测样品和内际物的面积之比。由于内 标物与被测物的测定是在同—通道上，因此要求内 标物的吸收波长接近被测物质的吸收波长，并与被 测物质的斑点要完全分开。因而，内标物的选择比 较困难。
透射法测定时，SX值越大，吸光度越大；反射法测 定时，SX值越大，反射度越小。
SX值取决于薄层吸附剂的性能、粒度和分布情况。 SX值要预先测定，通过仪器的线性补偿器，用电路系统 将弯曲的曲线校正为直线后用于定量。
线形校正 1-校正前的标准曲线 2-校正后的标准曲线
《液相色谱法S》课件
调试仪器参数
根据实验条件，调整仪器参数，如流速、检测波 长等。
液相色谱法的实验操作
泵压设置
根据流动相的特性，设置 合适的泵压，确保流动相 稳定流动。
进样操作
将处理好的样品注入色谱 柱，开始进行分析。
数据采集
实时监测色谱图，记录所 需数据。
数据处理与分析
兽药残留检测
液相色谱法可检测动物性食品中兽药残留，防止兽药过量使用对人 体造成危害。
在环境监测中的应用
水质检测
01
液相色谱法可用于检测水体中的有机污染物、重金属离子等有
害物质。
大气污染监测
02
液相色谱法可分析空气中的挥发性有机物、气态污染物等，评
估大气环境质量。
土壤污染检测
03
液相色谱法可检测土壤中的农药残留、重金属等有害物质，为
固定相的粒径和装填密度也会影响分离效果，粒 径越小，装填密度越高，分离效果越好。
检测器
检测器用于检测色谱柱流出的组 分。
常用的检测器有紫外可见吸收光 谱、荧光光谱、质谱等，根据不 同检测需求选择合适的检测，需要选择 高灵敏度和宽线性范围的检测器
。
食品工业
用于检测食品中的添加剂、农药残留和营养 成分等。
CHAPTER 02
液相色谱法的基本构成
色谱柱
色谱柱是液相色谱法的核心部件，用于分离样品中的不同组分。
常用的色谱柱材料有硅胶、氧化铝、活性炭等，根据不同分离需求选择合适的色谱 柱。
色谱柱的粒径和长度也会影响分离效果，粒径越小，长度越长，分离效果越好。
流动相
流动相是携带样品通过色谱柱 的介质，其性质会影响分离效 果。
液相色谱定量方法指导原则课件-PPT
标准曲线的绘制 ① 将一系列已知量待测物分别加入到几等份的样品中，配制成浓度为(cx+0), (cx+c1), (cx+c2), (cx+c3)…….
峰宽(KL):在峰两侧拐点处所作切线与峰底相交两点之间的距离 对于不对称或分离不完全的峰，可将峰剪下，以质量代其面积，使用较少。 94倍，故实际面积应为：（适合于对称峰）
式中：mi－组分的量 fi－比例常数 这就是色谱法定量的依据。
5 峰面积 A 的测量方法（一）
（1）峰高 h 乘半峰宽 w1/2 法
将色谱峰视为等腰三角形，得到的面积为 实际面积的0.94倍，故实际面积应为：（适合 于对称峰）
A ＝ 1.065 h ×w1/2（相对计算可略去前面系 数） （2）峰高乘平均峰宽法
液相色谱定量方法指导原则
液相色谱定量方法指导原则
1 有关色谱峰的基本概念（一）
• 峰底(CD):峰的起点与终点之间连接的直线 • 峰高(h):峰最大值到峰底的距离 • 峰宽(KL):在峰两侧拐点处所作切线与峰底相交两点之间的距离 • 半侧相高交峰两宽点(W之1/2间):通的过距峰离高的中点作平行于峰底的直线，其与峰两 • 峰面积（A）:峰与峰底之间的面积,又称响应值 • 拖尾峰（Tailing peak）:后沿较前沿平缓的不对称峰 • 前伸峰（Leading peak）:前沿较后沿平缓的不对称峰 • 基线（Baseline):在正常操作条件下，仅由流动相所产生的响应信
i 1
（可以为质量百分含量或摩尔百分含量）
7 常用的几种定量测定方法（二）
归一法的特殊情况
分析化学 液相色谱法PPT课件
RN(CH3 )3+ OH- + X- == RN(CH3)3+X-+ OH-
2021年5月
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树脂的再生
• 阳离子交换树脂用HCl溶液处理 •
• R阴离子-交S换O树3-脂M用N+aO+HH溶液+处C理l- == R - SO3-H + + M+Cl-
RN(CH
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（六）操作方法
• 1.装柱 • 2.加样 • 3.洗脱
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二、 液－液分配柱色谱法
• （一）分离机理 • 利用混合物中不同组分在两相溶剂中溶解性不同(分配系数不同)，当流动相携 带样品流经固定相时，各组分在两相间不断进行溶解、萃取，再溶解、再萃取。 样品在色谱柱内经过无数次分配之后，而使分配系数稍有差异的组分得到分离。 • 正相色谱：流动相的极性比固定相的极性弱 • 反相色谱：流动相的极性比固定相的极性强
第十二章 液相色谱法
• 第一节 概述 • 第二节 柱色谱法 • 第三节 平面色谱法 • 思考与练习
2021年5月
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第一节 概述
色谱法(chromatography)又称层析法，是一种依据物质的物理化学性质的不同(如溶解性、极性、离子 交换能力、分子大小等)而进行的分离分析方法。
• 一、 色谱法的产生和发展
•
原理:硅醇基(吸附中心)与极性基团形成氢键(吸附性),组分与硅醇基形成氢键(被吸附)的能力不同而
分离。
•
应用:酸性和中性物质的分离，如有机酸、酚类、醛类.
液相色谱定量方法指导原则共42页
3、最大限度地行使权力总是令人反感 ；权力 不易确 定之处 始终存 在着危 险。— —塞·约翰逊 4、权力会奴化一切。——塔西佗
5、虽然权力是一头固执的熊，可是金 子可以 拉着它 的鼻子 走。— —莎士 比
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71、既然我已经踏上这条道路，那么，任何东西都不应妨碍我沿着这条路走下去。——康德 72、家庭成为快乐的种子在外也不致成为障碍物但在旅行之际却是夜间的伴侣。——西塞罗 73、坚持意志伟大的事业需要始终不渝的精神。——伏尔泰 74、路漫漫其修道远，吾将上下而求索。——屈原 75、内外相应，言行相称。——韩非
《液相色谱法》课件
DATE
ANALYSIS
SUMMAR Y
REPORT
CATALOG
DATE
ANALYSIS
SUMMAR Y
05
液相色谱法的优化与注 意事项
实验条件的优化
1 2
流动相的选择
根据分析物的性质选择合适的流动相，如有机溶 剂、缓冲液等，以达到最佳分离效果。
流速的优化
流速对色谱分离效果有重要影响，需根据实际情 况调整流速，以达到最佳分离效果。
3
柱温的优化
柱温会影响物质的吸附和扩散速度，适当提高柱 温可以加快分析速度，但过高的温度可能导致柱 效降低。
液相色谱柱的维护与保养
使用前清洗
新柱子使用前需进行彻底清洗，以去除残留物和 污染物。
使用中维护
使用过程中应定期清洗和再生色谱柱，以保持其 性能和寿命。
储存条件
色谱柱应存放在干燥、避光的地方，避免直接阳 光照射和高温。
反相色谱法
总结词
反相色谱法是利用非极性固定相和极性流动相之间的相互作用来分离物质的分离 模式。
详细描述
反相色谱法中，固定相通常是烷基键合硅胶，流动相则是极性的溶剂，如水、甲 醇等。在分离过程中，非极性或弱极性的组分更容易被固定相吸附，因此会先被 洗脱出来。
离子交换色谱法
总结词
离子交换色谱法是利用离子交换剂与溶液中的离子之间的相互作用来分离物质的分离模 式。
动相。
流动相的流速和组成对分离效果 也有影响，需根据实际情况调整
。
固定相
固定相是色谱柱中的填料，用于吸附样品中的组分。
常见的固定相有硅胶、氧化铝、活性炭等，根据不同分离需求选择合适的固定相。
固定相的粒径和性质对分离效果有影响，粒径越小，性质越均匀，分离效果越好。