ABO血型全自动微板检测法

本站最近研究开发了ABO血型全自动微板检测法，并对2857名献血者进行ABO血型鉴定，一次判读准确率达到99.83%。该法的应用大大地降低了实验者的工作强度，避免了人为因素导致的错判血型，确保了临床输血的安全。笔者着重对该方法的可靠性和干扰因素进行

研究，结果报告如下。

1 材料和方法

1.1 材料2857份献血者血液标本（

2.5mgEDTANa 2/ml抗凝全血）；Genesis RSP-100型全自动样本处理系统，SLT自动扫描酶标仪及随机购置的支持软件Soft2000(瑞士TECAN 公司产品)；T.S温控孵育振荡仪（奥地利Anthos公司）；KUBOTA Ks-5000平板式离心机（日本久保田公司）；9 6孔硬质U型板（丹麦）；单克隆抗-A、抗-B血清（长春生物制品研究所）；5% 3 人份以上混合试剂红细胞（自制）；A2亚型红细胞（Ortho公司产品），

经盐水洗涤2次配成5 %的盐水悬液。

1.2 全自动微板检测法（简称微板法）用96孔U型微量反应板，通过全自动加样器处理样本和试剂。正定型中，分别加入标准抗血清30μl和5%样本红细胞30μl，反定型中，分别加入样本血浆50μl和5%标准红细胞30μl。经孵育、离心、悬浮和静止，再用自动酶标仪取 620nm波长对反应板进行扫描、判读，随后在电脑中进行正反定型结果配对比较，确认无误后，将最终正确结果经站电脑网络与相应献血者资料存放在一起。经多次正交试验检测和各参数指标间的对比试验，优化得出ABO正反定型检测最终试验条件为，孵育：3min，500r/min，2level；离心：400g，90s；悬浮：3min，900r/min，3 level；静止：正定型1～2min，反定型5～6min；判读：620nm波长，40点扫描，Tc＞15%为凝集反应，Tc＜10为非凝集反应，10≤Tc≤15为可疑，需手工法重新鉴定。依据Soft20 00支持软件结构，微凝板经扫描后每孔都可获得一最小透光率（minimum transmission, Tn）和最大透光率(maximum transmission,Tm)，非凝集孔Tm与Tn的差值（contrast transmission,Tc）较小，凝集孔Tc值较大；当Tc值超过一特定值时，提示细胞凝集，结果判为阳性；反之，Tc值较小时表明细胞不凝集，结果判为阴性。根据ABO正反定型原则

［3］，确定其血型。

1.3 试管法，平板法见文献［3］方法。

2 结果

2.1 方法的可靠性

2.1.1 可重复性取8份样本，连续进行20次反定型，每次得阳性Tc 值9个，阴性Tc值7个，分别算出它们的平均Tc值，然后对20份阳性和阴性的平均Tc值分别进行数理统计，依次得标准差(s)为2.091、0.295和变异系数(cv)为2.91%、8.03%，均＜10%，

说明该试验具有良好的可重复性。

2.1.2 稳定性取48份标本，连续进行3次正反定型，每次间隔11 d,显示：正定型凝集试验中均为4+，无任何变化;而对反定型凝集试验中的Tc值按配对资料的两两比较进行数理统计，无显著性差别、(t＝0.387，n=62，经查表，t0.05 =2.000,故P＞0.05)。

2.1.3 准确率通过2857份献血者样品的正反定型，得出正反定型试验1次判读准确率为99.83%，证明该试验方法完全可靠。异常结果主要出现在反定型中，其中3份样本

为严重脂血，2份为血型抗体极弱。

2.1.4 敏感性将单克隆-抗A血型试剂倍比稀释，每种稀释度加样30 μl，再分别加入5%A型和A2亚型红细胞悬液30μl，按上述3种方法进行操作，分别测得其结果（表1）。用B型血浆代替上述单克隆抗-A，加样量改为50μl，其余不变，分别测得其结果

（表2）。

表1 A和A2亚型红细胞在3种方法中测得单克隆抗-A效价

表2 分别用A和A2亚型红细胞在3种方法中测B型血浆中抗-A效价

2.2 干扰因素主要从溶血、脂血和黄疸对该试验结果的影响程度来研究该试验是否存在假阳性和假阴性情况。将市售血红蛋白、三油酸甘油酯和胆红素用A或B型血浆配成系列浓度，然后分别吸取50ml加入96孔U型微量板中，每种浓度做8孔，作微板法（表3～

5）。表3 溶血(血红蛋白)对TC值的影响

表4 脂质(三油酸甘油酯)对Tc值的影响

表5 黄疸(胆红素)对Tc值的影响

3讨论

全自动微板法具有很好的重复性和稳定性，经28 57名献血者ABO血型鉴定，一次判

读准确率达到99.83%，与国外文献报道的98.8%（用Kemble ，BG15系统检测）［8］和98.5%

（PK7200分析系统检测）［6］相似。

单克隆抗-A试剂呈兰色，对620nm波长有吸收干扰作用，在本实验(表1) 中得到了证实。但在对献血者样本用单克隆抗-A原液进行正定型时，发现凝集试验的Tc值全部在35 以上，且Tc值在45以上占99.82%。针对该方法的Cut off＞15为凝集反应来说，其实际影响程度并不大，只要保证单克隆抗体的效价在128以上且亲和力＜10s即可。

微板法中测定单克隆抗-A效价，不论是用A型还是A2亚型红细胞，都比试管法或平板法高一个滴度，此说明正定型中微板法的灵敏度优于试管、平板法；在反定型中微板法对A细胞的灵敏度优于试管、平板法，而对A2亚型3种方法无差异(表1，2)。

从表3～5中可见，脂质、溶血对该试验判读有一定的干扰，而胆红质对该试验没有任何影响。在对2857份献血者样本反定型中就发现有3 份脂血和2份弱抗体样本产生假阴性结果（表3～5），故在实际工作中除了尽量避免脂血和溶血样本的发生，还要保证5%的3人份以上混合而成的试剂红细胞悬液的新鲜。

如果碰到ABO正反定型不符时，应该由经典的常规方法确认，以考虑是否有亚型、弱

抗体和假凝集等因素存在。