转基因技术及其在植物育种中的应用

转基因技术及其在植物育种中的应用

一、概述

从70年代重组DNA技术创建，到1983年第一株转基因烟草获得以来，国际上对转基因作物就存在着截然不同的观点：接受？抵制？随着技术日趋成熟，转基因作物由实验室进人大田中试，不少作物已向商品化发展。与此同时，转基因作物的生态风险，可能带来的环境问题、转基因产品作为食品对人体健康问题、产品贴标签问题、运输问题、国际贸易问题、知识产权问题等已引起世界性的所谓“生物安全”的论战。转基因技术实际上已由学术观点分歧，发展到知识产权问题、环境问题、经济问题甚至政治问题

二、什么是转基因技术

转基因技术是将人工分离和修饰过的基因导入到生物体基因组中，由于导入基因的表达，引起生物体的性状的可遗传的修饰，这一技术称之为转基因技术（Transgene technology）。又名"遗传工程"、"基因工程"、"遗传转化"。

三、几种常用的植物转基因方法

遗传转化的方法按其是否需要通过组织培养、再生植株可分成两大类，第一类需要通过组织培养再生植株，常用的方法有农杆菌介导转化法、基因枪法；另一类方法不需要通过组织培养，目前比较成熟的主要有花粉管通道法，花粉管通道法是中国科学家提出的。

1．农杆菌介导转化法

农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，它能在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤或发状根。根癌农杆菌和发根农杆菌中细胞中分别含有Ti质粒和Ri质粒，其上有一段T-DNA，农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将T-DNA插入到植物基因组中。因此，农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系。人们将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然后通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。

农杆菌介导法起初只被用于双子叶植物中，自从技术瓶颈被打破之后，农杆菌介导转化在单子叶植物中也得到了广泛应用，其中水稻已经被当作模式植物进行研究。

2．花粉管通道法

在授粉后向子房注射含目的基因的DNA溶液，利用植物在开花、受精过程中形成的花粉管通道，将外源DNA导入受精卵细胞，并进一步地被整合到受体细胞的基因组中，随着受精卵的发育而成为带转基因的新个体。该方法于80年代初期由中国学者周光宇提出，中国目前推广面积最大的转基因抗虫棉就是用花粉管通道法培育出来的。该法的最大优点是不依赖组织培养人工再生植株，技术简单，不需要装备精良的实验室，常规育种工作者易于掌握。

3. 基因枪法

利用火药爆炸或高压气体加速（这一加速设备被称为基因枪），将包裹了带目的基因的DNA溶液的高速微弹直接送入完整的植物组织和细胞中，然后通过细胞和组织培养技术，再生出植株，选出其中转基因阳性植株即为转基因植株。与农杆菌转化相比，基因枪法转化的一个主要优点是不受受体植物范围的限制。而且其载体质粒的构建也相对简单，因此也是目前转基因研究中应用较为广泛的一种方法。

四、转基因植株的检测

标记基因(包括选择标记基因及报告基因)用于帮助在植物遗传转化中筛选和鉴定转化

的细胞、组织和再生植株。在选择压力下，不含标记基因及其产物的非转化细胞和组织死亡，转化细胞由于有抗性，可继续成活、分裂并分化成植株。选择标记基因包括抗生素抗性基因及除草剂抗性基因等，其中用得最多的是抗生素抗性标记基因。报告基因包括葡糖醛酸苷酶(gus)、荧光素酶(1uc)、氯霉素乙酰转移酶(cat)、以及绿色荧光蛋白(gfp)基因等。标记基因通常与目的基因构建在同一植物表达载体上，一起转人植物，但标记基因本身有时也可作为目的基因，如除草剂抗性基因提供除草荆抗性。

（一）报告基因的捡测

报告基因是具有明显区别于受体细胞遗传背景的选择标记，因而易于进行转化后的筛选。利用酶法分析、通过同位索放射性自显影技术及底物的颜色反应可以快速鉴定报告基因的表达，从而有效地检测出重组细胞或组织。根据报告基因编码特点，大致分为两类：抗性基因和编码催化人工底物产生颜色变化的酶基因。

1 抗性基因的酶活性检洲（新霉索磷酸转移酶(NIT—II)、氯霉索乙酰转移酶(CAT)、PPT乙酰转移酶(PAT)是常用的3种抗性酶，因其易于检测，编码基因常用作报告基因。）

2 腑脂碱和章鱼碱的测定

3 荧光素晦活性检洲检

4 GUS晦活性检测

（二）PCR法检测转化植株

PCR是在体外快速特异地扩增目的基因DNA片段的有效方法。能在几小时内使pg水平的起始物达到ng乃至旭水平，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，谟化乙锭染色后很容易观察，不通过杂交分析就可以鉴定出基因组中的一些顺序。

（三）点杂交和Southern杂交

点杂交是将提取DNA或RNA不经酶切，直接点到硝酸纤维膜或尼龙膜上与探针进行杂交的技术。利用点杂交，可以初步鉴定转化体中是否有整和的外源基因。罗云渡等Ⅲ用DNA、RNA 的点杂交技术对转基田植株进行鉴定。取得与田间表现一致的结果。但点杂交的特异性差，阳性植株譬进一步作Southern杂交验证。

Southern杂交是将经酶切DNA转移到杂交膜上与探针杂交的技术

（四） Northern杂交

Northern杂交是将试材RNA与探针杂交的技术，用于检测基因在转录水平上的表达。Northern杂交的主要原理是把变性RNA转移和固定在特定的薄膜上，用特定的DNA探针来检测RNA

（五） Western杂交

Western{缸交技术是将蛋白质从SDS-PAGE胶中电转移至固相支持体上，彝}；后对固定化蛋白质进行免疫学测定的方法。Western杂交灵敏度极高．髂达到标准的固定相放射免疫水平

Western杂交检测目的基因在翻译水平的表达结果．髂直接显示目的基因在转化体中是否经过转录、翻译最终合成蛋白而影响植株的性状表现

四、转基因作物研究进展

（一）国际转基因作物的研究进展

自1996年首例转基因农作物产业化应用以来，全球转基因技术研究与产业应用快速发展。

中国是国际上第一个商品化种植抗黄瓜花叶病毒(CMv)和抗烟草花叶病毒(TMv)双价转基因烟草的国家，但后劲不足。美国发展很快。

发展态势：

1是品种培育速度加快。随着生命科学、基因组学、信息学等学科的发展，转基因技术研究日新月异，研究手段、装备水平不断提高，基因克隆技术突飞猛进，一些新基因、新性状和新产品不断涌现。品种培育呈代际特征，目前全球转基因生物新品