自噬研究方法工具汇总---BIO-RAD
自噬研究方法工具汇总---BIO-RAD
自噬研究方法工具汇总---BIO-RAD细胞自噬细胞自噬（autophagy）是依赖溶酶体途径对胞质蛋白和细胞器进行降解的一种过程。
这个过程可以清除功能异常的细胞器、细胞内病原体以及再循环细胞组分。
尽管自噬最早被发现是应答饥饿，现在发现自噬受到各种胁迫信号的诱导，基础水平的自噬有利于细胞内稳态的维持.很多因素包括激素刺激的天然免疫信号及能量耗尽或高温等引起的物理胁迫会诱导自噬上调。
相反，很多疾病如癌症、传染性疾病和神经退行性疾病及衰老和自噬的下调都有关联。
自噬主要有三种信号通路:●Microautophagy小自噬通过溶酶体的膜内陷“吞入”目标分子，起到降解细胞质中小体积物质的作用.这个过程研究得不是很清楚,膜内陷相关的GTPaseVps1p蛋白和自噬相关蛋白(Atg)参与其中。
● 分子伴侣介导的自噬（chaperone-mediatedautophagy,CMA）直接将细胞质蛋白带到溶酶体。
带KFERQ—序列的蛋白质和热休克蛋白Hsc70及其它分子伴侣相互作用形成的复合体和溶酶体膜上的Lamp-2A受体结合后，导致Lamp—2A 聚合引发复合体中的底物易位穿越溶酶体膜.● Macroautophagy大自噬被研究得最多,可以降解更大量的胞浆物质，由特殊的细胞器自噬小体介导。
大自噬起始于吞噬泡装配点(PAS）的形成和Unc51—likekinase (Ulk)复合体的组装,这启动了自噬小体的形成(图1）。
接着是成核阶段，Ulk复合物与由beclin—1、Vps15、Vps34、Atg14组成classIII PI3K 复合物相互作用形成吞噬泡。
接着吞噬泡膜扩展形成自噬小体，在这个过程中Atg12/5/16复合物促成了磷脂酰乙醇胺（PE）和LC3(酵母中是Atg8）的偶联，这是自噬小体膜唯一已知的标志物。
PE-LC3偶联物在几个关键步骤中起作用：自噬泡膜的扩展、自噬体的识别及自噬溶酶体的形成。
整个过程涉及30多个自噬相关基因（Atg蛋白），包括Beclin-1、溶酶体相关膜蛋白(Lamp—1 and Lamp—2)和微管相关蛋白1A/1Blight chains 3A/B （MAP1LC3A/B 或简称LC3)，这些都是自噬常见的标志物.最后一步，完全形成的自噬小体与溶酶体融合释放内含的物质被降解。
自噬的金牌研究工具
①主流定位示踪工具- LC3LC3是用来标记定位自噬小体到自噬溶酶体的动态变化，特别是利用mRFP-GFP-LC3差异化标记酸性和中性LC3阳性的囊泡，用颜色变化来指示自噬的不同阶段（由于GFP 荧光蛋白对酸性敏感，当自噬体与溶酶体融合后GFP 荧光发生淬灭,此时只能检测到红色荧光），可以在活细胞水平动态监测自噬流的强弱，满足定性和定量分析的要求。
GFP-LC3和RFP-LC3单标探针可以监测LC3蛋白参与自噬起始过程：自噬较少时，GFP-LC3和RFP-LC3融合蛋白主要弥散在胞浆中；自噬增加时，GFP-LC3和RFP-LC3融合蛋白转位至自噬体膜，在荧光显微镜下形成多个明亮的荧光斑点，一个斑点相当于一个自噬体，可以通过计数来评价自噬活性的高低。
我们可以在不同的药物处理时间点上采样进行静态分析，综合一起形成自噬流的动态分析；但RFP-LC3与mRFP-GFP-LC3的还可以对细胞进行活细胞成像，从而对自噬流进行动态监测。
比如对同一个视野每隔5 min采集一次数据等。
对于单标探针（GFP-LC3或RFP-LC3）与双标探针（mRFP-GFP-LC3）的主要区别需要作进一步的说明：GFP-LC3和RFP-LC3单标探针对于监测自噬体的形成特别有用，但这两种单标探针不利于自噬流的整个过程进行动态检测，比如无法精确监测溶酶体是否参与，也无法示踪自噬体的成熟过程等。
因此，单标探针往往需要联合其他探针，比如溶酶体探针（Lamp1-RFP、Lamp1-GFP）一起使用，根据共定位的信息来更加精细的示踪自噬体的成熟过程。
而mRFP-GFP-LC3串联双标记探针则可以解决这个问题，比如从自噬小体到自噬溶酶体的动态变化等（图4）。
进一步的，若联合红外标记的溶酶体探针（LysoTracker® Deep Red ，Thermo，L12492)则可以进一步研究自噬小体/自噬溶酶体/溶酶体三者的动态变化。
需要注意的是：外源过表达的LC3如果过量，会导致LC3非特异性的自发聚集，为了区分自发聚集与自噬诱导的聚集，我们提供了不能参与自噬的LC3突变体（G120A）来作为对照。
细胞自噬检测
细胞自噬检测引言细胞自噬（Autophagy）是一种维持细胞内稳态的重要细胞生理过程。
它通过将细胞内的有害垃圾物质、受损蛋白质和细胞器通过包裹成双层膜体而将其降解和回收。
细胞自噬不仅对于维持细胞内环境的平衡，也在细胞营养不足、应激等情况下发挥至关重要的作用。
为了研究细胞自噬的机制、功能以及其在疾病中的作用，科研人员常常需要进行细胞自噬的检测。
本文将介绍一些常用的细胞自噬检测方法，旨在帮助科研人员更好地开展相关研究。
方法一：免疫组化检测免疫组化检测是常用的细胞自噬检测方法之一，它利用特异性抗体识别和定位自噬相关的蛋白质标记。
以下是免疫组化检测的步骤：1.固定和透化：将细胞样品固定在载玻片上，并通过透化剂处理，以便抗体能够穿透细胞膜进入细胞内。
2.抗体反应：加入特异性的抗体，使其与目标自噬蛋白结合。
3.洗涤：进行多次洗涤，以除去未结合的抗体。
4.二抗结合：加入与第一抗体来源不同种类的第二抗体，它能连接到第一抗体上，使得目标蛋白能够被可见光或荧光染料标记。
5.洗涤：进行多次洗涤，以除去未结合的第二抗体。
6.显色或荧光检测：加入适当的显色剂或荧光标记物，观察细胞自噬标记的结果。
免疫组化检测方法适用于观察细胞内特定蛋白质的表达和定位情况，从而间接地了解细胞自噬的活性。
方法二：转染自噬标记基因为了直接观察细胞内自噬相关的蛋白质的表达情况，科研人员可以利用转染自噬标记基因的方法。
以下是一种常用的自噬标记基因：mRFP-GFP-LC3。
mRFP-GFP-LC3是一种融合蛋白，其中GFP（绿色荧光蛋白）和mRFP（红色荧光蛋白）与自噬相关的蛋白LC3融合在一起。
GFP能够在细胞自噬过程中被降解，而mRFP则能够在自噬过程中保持稳定。
转染mRFP-GFP-LC3基因后，科研人员可以通过观察细胞中的荧光信号来确定细胞的自噬活性。
当细胞自噬活性较低时，绿色和红色荧光都很强；而当细胞自噬活性增加时，绿色荧光减弱而红色荧光增强。
自噬及其的研究方法
⾃噬及其的研究⽅法⾃噬（Autophagy）及其研究⽅法概述⼀、背景概念:⽬前根据发⽣过程分为三类：Macroautophagy，Microautophagy和Chaperone-mediated autophagy CMA), ⼤⾃噬（Macroautophagy）即我们说的⾃噬（autophagy）;微⾃噬（Microautophagy）：是指溶酶体主动、直接吞噬胞浆成分的⼀种⽅式;分⼦伴侣介导的⾃噬(Chaperone-mediated autophagy，CMA)：⼀些分⼦伴侣，如hsp70，能帮助未折叠蛋⽩转位⼊溶酶体。
通常说的⾃噬泛指Macroautophagy.⾃噬是细胞内的⼀种“⾃⾷（Self-eating）”的现象，凋亡是“⾃杀（Self-killing）”的现象，⼆者共⽤相同的刺激因素和调节蛋⽩，但是诱发阈值和门槛不同，如何转换和协调⽬前还不清楚. ⾃噬是指膜（⽬前来源还有争议，⼤部分表现为双层膜，有时多层或单层）包裹部分胞质和细胞内需降解的细胞器、蛋⽩质等形成⾃噬体（autophagosome），最后与溶酶体融合形成⾃噬溶酶体（autophagolysosome），降解其所包裹的内容物，以实现细胞稳态和细胞器的更新。
⾃噬的步骤可以⼤概总结为下⾯四步:步骤1：细胞接受⾃噬诱导信号后，在胞浆的某处形成⼀个⼩的类似“脂质体”样的膜结构，然后不断扩张，但它并不呈球形，⽽是扁平的，就像⼀个由2层脂双层组成的碗，可在电镜下观察到，被称为Phagophore，是⾃噬发⽣的铁证之⼀。
步骤2：Phagophore不断延伸，将胞浆中的任何成分，包括细胞器，全部揽⼊“碗”中，然后“收⼝”，成为密闭的球状的autophagosome，即“⾃噬体”。
电镜下观察到⾃噬体是⾃噬发⽣的铁证之⼆。
有2个特征：⼀是双层膜，⼆是内含胞浆成分，如线粒体、内质⽹碎⽚等。
步骤3：⾃噬体形成后，可与细胞内吞的吞噬泡、吞饮泡和内体融合（这种情况不是必然要发⽣的）。
羰基氰氯苯腙调节非经典自噬的机制研究
羰基氰氯苯腙调节非经典自噬的机制研究高瑛;刘亚军;蔡欣然;刘培庆;李民【摘要】目的：探讨可以调控羰基氰氯苯腙（ carbonyl cyanide m－chlorophenylhydrazone，CCCP）诱导的不依赖自噬关键基因的非经典自噬的影响因素。
方法分别将野生型细胞和自噬关键基因敲除／敲低的细胞（ Atg5－KO MEF，FIP－200 KO MEF，ULK1－KO MEF， Beclin 1－KO U251）用CCCP 处理，观察GFP－LC3的分布聚集情况和LC3蛋白水平的表达。
荧光定量PCR检测CCCP处理后LC3B mRNA水平变化。
Western blot检测FIP200－KO MEF 中CCCP处理时，水通道蛋白抑制剂对LC3蛋白水平的影响。
结果在Atg5－KO MEF细胞中，和对照组相比，CCCP 处理组免疫荧光实验不能产生GFP－LC3自噬斑点，Western blot结果显示LC3－I 型不能转变为LC3－II。
而在ULK1－KO MEF，FIP200－KO MEF，及Beclin1－KD U251细胞中，CCCP处理组免疫荧光实验能产生GFP－LC3自噬斑点，同时LC3－I型也能转变为LC3－II型。
但CCCP处理不影响LC3B的mRNA水平。
CCCP诱导的非经典自噬能被水通道蛋白抑制剂所抑制。
结论 CCCP诱导的非经典自噬需要自噬关键基因Atg5参与，但不需要Beclin 1，ULK1，FIP200的参与，不影响LC3B 的转录调控。
渗透压不平衡可以调节CCCP诱导的自噬。
%Objective To identify the factors those regulate CCCP-induced non-canonical autophagy.Methods Different cells expressing GFP-LC3 were treated with or without CCCP (30μM) for 6h.Fluorescent images were taken and cell lysates were analyzed by western blot assay.Real-time PCR was used to measure the mRNA levels ofLC3B.FIP200-KO MEF cells were cultured and treated by 30 μM CCCP with or without water channel inhibitors, for 6 h.Cell lysates were analyzed byWestern blot assay.Results CCCP could not induced autophagy in Atg5-KO MEF CP could induce non-canonical autophagy in ULK1-KO MEF, FIP200-KO MEF, and Beclin1-KD CP treatment in FIP200-KO MEF cells had no effect on the expression level of LC3B mRNA.We also found two distinct aquaporin water channel inhibitors could inhibit the generation of LC3 which was induced by CCCP.Conclusion CCCP induced non-canonical autophagy was Atg5-dependent, but Beclin1-, ULK1-andFIP200-independent.Osmotic imbalance could regulate CCCP-induce non-canonical autophagy.【期刊名称】《中国生化药物杂志》【年(卷),期】2016(036)004【总页数】4页(P34-36,40)【关键词】自噬;渗透压不平衡;羰基氰氯苯腙;LC3;MEF【作者】高瑛;刘亚军;蔡欣然;刘培庆;李民【作者单位】中山大学药学院/新药成药性评估与评价国家与地方联合工程实验室，广州广东 510006;中山大学药学院/新药成药性评估与评价国家与地方联合工程实验室，广州广东 510006;中山大学药学院/新药成药性评估与评价国家与地方联合工程实验室，广州广东 510006;中山大学药学院/新药成药性评估与评价国家与地方联合工程实验室，广州广东 510006;中山大学药学院/新药成药性评估与评价国家与地方联合工程实验室，广州广东 510006【正文语种】中文【中图分类】R329.2+7自噬(巨自噬)是对细胞内衰老细胞器、长寿命蛋白以及外源病原微生物进行吞噬然后与溶酶体融合并降解内含物的过程，其在进化过程中具有高度保守性[1]。
自噬检测方法
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自噬流评价： 1.双标LC3,红色斑点/黄色斑点; 2.LC3与lamp1的共定位； 3.DQ-BSA; 4.稳转GFP-LC3细胞中检测游 离GFP
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Fusion of autophagosomes with endosomes/lysosomes is mediated by the class C VPS complex, Rab GTPase and the SNARE complex.
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自噬பைடு நூலகம்测方法
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常用细胞器标记物
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自噬体检测： 1.透射电镜 2.免疫荧光观察LC3斑点, （P62辅助说明）； 3.WB检测LC3+P62,并增加自 噬降解抑制剂处理组。
实验顺序：3 1
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机制研究：
CO-IP 比较各组处理后stx17结合的 SNAP29和vamp8
Cai, H., Reinisch, K. & Ferro-Novick, S. Coats, tethers, Rabs, and SNAREs work together to mediate the intracellular destination of a transport vesicle. Dev. Cell 12,671–682 (2007). Itakura, E., Kishi-Itakura, C. & Mizushima, N. The hairpin-type tail-anchored SNARE syntaxin 17 targets to autophagosomes for fusion with endosomes/lysosomes. Cell 151, 1256–1269 (2012). Takáts, S. et al. Autophagosomal Syntaxin17-dependent lysosomal degradation maintains neuronal function in Drosophila. J. Cell Biol. 201, 531–539 (2013)
中波紫外线诱导HaCaT细胞自噬的研究
中波紫外线诱导HaCaT细胞自噬的研究王超鹏;蒋丽君;陈富强;周美娟【摘要】目的探究中波紫外线(UVB)诱导的人永生化角质形成细胞HaCaT自噬效应及其信号通路.方法 30 mJ/cm2 UVB照射HaCaT细胞后,透射电镜和MDC染色法观察自噬小体的变化,Western Blot检测自噬和凋亡相关蛋白的表达情况,CCK-8法检测细胞增殖的变化,流式细胞术检测细胞凋亡率的变化.结果 30mJ/cm2 UVB照射24 h后,电镜下可见自噬小体增多,内含待降解的细胞器和折叠蛋白;MDC染色可见细胞自噬囊泡增多,荧光强度增强;Western Blot结果显示自噬标志蛋白LC3-Ⅱ、Beclin-1和SQSTM1表达增加,AMPK/mTOR通路中的关键蛋白AMPK、p-ULK1表达增加,p-mTOR表达降低;运用3-Methyladenine(3-MA)和siATG5抑制自噬后,LC3-Ⅱ表达降低,细胞凋亡率增加,增殖减慢,凋亡蛋白Cleaved-PARP表达增加,AMPK/mTOR通路中的关键蛋白AMPK、p-ULK1表达下降,p-mTOR表达增加.结论 UVB通过AMPK/mTOR通路诱导了HaCaT细胞的保护性自噬.【期刊名称】《实用医学杂志》【年(卷),期】2019(035)012【总页数】6页(P1910-1914,1919)【关键词】中波紫外线;人永生化角质形成细胞;自噬;凋亡【作者】王超鹏;蒋丽君;陈富强;周美娟【作者单位】南方医科大学公共卫生学院放射医学系,广东省热带病研究重点实验室广州510515;南方医科大学公共卫生学院放射医学系,广东省热带病研究重点实验室广州510515;南方医科大学公共卫生学院放射医学系,广东省热带病研究重点实验室广州510515;南方医科大学公共卫生学院放射医学系,广东省热带病研究重点实验室广州510515【正文语种】中文日光中的紫外线，尤其是中波紫外线（ultraviolet radiation b，UVB），是造成人体表皮细胞损伤最常见的环境因素之一。
检测自噬的实验方法
检测自噬的实验方法一、形态学检测。
1. 透射电子显微镜（TEM）- 这可是检测自噬的“金标准”呢。
就像用一个超级放大镜去看细胞内部。
自噬的时候啊，细胞里会形成自噬体，这个自噬体在TEM下有它独特的样子，双层膜结构，里面包着要降解的东西。
不过呢，TEM也有点小麻烦，它的样品制备不容易，就像做一道超级精细的菜，得小心翼翼的，而且对仪器要求也高，就像开豪车得有好的路况一样。
2. 荧光显微镜检测。
- 可以用一些标记自噬相关蛋白的荧光染料。
比如说LC3蛋白，它可是自噬的一个重要标志。
当细胞发生自噬的时候，LC3 - I会变成LC3 - II，并且会定位到自噬体膜上。
我们就可以用带有绿色荧光的标记物去标记LC3，然后在荧光显微镜下看。
就像给自噬体穿上一件绿色的小衣服，在黑暗里用特殊的灯一照就能看到啦。
这种方法相对简单一些，就像穿休闲装出门，没那么多繁琐的步骤。
二、生化检测。
1. 检测自噬相关蛋白的表达水平。
- 像Western blot就可以用来检测自噬相关蛋白的变化。
比如前面说的LC3蛋白，还有p62蛋白。
p62蛋白是自噬的底物，如果自噬正常进行，p62蛋白的水平会下降，因为它被自噬体降解了。
这就像看一个东西的库存一样，如果一直在消耗，库存就会减少。
通过检测这些蛋白的表达量的变化，就能知道自噬是不是在正常工作啦。
2. 检测自噬流。
- 可以用一些试剂来阻断自噬体和溶酶体的融合，然后看自噬相关蛋白的变化。
如果自噬流是正常的，阻断之后自噬体就会堆积，相关蛋白的表达也会有相应的改变。
这就像是在水管中间堵一下，看看水是不是真的在流，在哪个地方堵住了一样有趣呢。
自噬研究指南第四版
自噬研究指南第四版第四版自噬研究指南自噬是一种细胞内的重要代谢过程，它可以清除垃圾蛋白质、细胞器以及损坏DNA等，以维持细胞的功能和稳态。
近年来，对自噬的研究取得了很大的进展，为深入理解该过程的机制和功能提供了重要的指导。
1. 自噬的检测方法自噬的监测是研究中的重要一环，常用的方法包括显微镜下观察自噬体形成、检测自噬相关蛋白的表达水平、蛋白质水解活性等。
此外，近年来流行的指示性信号分子GFP-LC3和mCherry-GFP-LC3转染技术，也为自噬的实时监测提供了便利。
2. 自噬的调控自噬的调控涉及一系列的信号通路，包括mTOR通路、AMPK通路等。
研究表明，mTOR是一个关键的负调控分子，mTOR被抑制时，可以激活自噬的启动，并调控自噬的不同阶段。
此外，AMPK的激活也可以促进自噬的发生。
此外，一些细胞因子、热休克蛋白和ATP等也可以参与自噬的调控。
3. 自噬与相关疾病自噬与许多疾病的发生和发展密切相关，如神经变性疾病、肿瘤、心血管疾病等。
了解自噬的异常调控在疾病中的作用有助于发展新的治疗策略。
例如，通过调节自噬的发生和抑制特定信号通路，可以为神经退行性疾病的治疗提供新的思路。
4. 自噬的药物研发自噬在疾病治疗中的潜力已引起广泛关注，因此，开发针对自噬过程的药物成为了一个热门的研究领域。
目前已有许多潜在的抑制剂和激活剂被发现，这些药物可用于疾病的治疗。
然而，目前对自噬的药物研发仍处于初级阶段，还需要进一步的研究来优化药物的特性和疗效。
综上所述，随着对自噬研究的深入，我们对于自噬机制和调控方式的理解不断增加。
继续推动自噬研究，对于揭示细胞的代谢调控、疾病的发生和治疗，以及药物研发等方面都具有重要意义。
希望本指南能为研究者提供有关自噬的最新进展和研究方法的参考，并助力推动自噬的深入研究与应用。
细胞自噬的检测方法及原理
细胞自噬的检测方法及原理细胞自噬是一种维持细胞内稳态的重要过程，通过降解非功能性或老化的细胞器和细胞垃圾，以提供新的生物分子和能量。
自噬不仅在维持细胞内平衡方面起着关键作用，还与多种疾病的发生和发展密切相关。
因此，准确检测和探究细胞自噬的机制和功能对阐明疾病发生的分子机理具有重要意义。
目前，常用的细胞自噬检测方法主要包括观察自噬体形成和测量自噬相关蛋白水平两大类。
观察自噬体形成是一种直观和直接的方法来检测细胞自噬。
自噬体是由自噬小体和被降解的物质组成的膜包泡体，形成过程可以通过染色和显微镜技术进行观察。
以下是常用的自噬体形成检测方法：1. 电镜观察：电子显微镜技术可以观察到产生多层膜结构的自噬体。
2. 免疫荧光染色：通过特异性抗体对自噬相关蛋白进行染色，如微管相关蛋白1A/1B链轻链3（LC3）和自噬素5（Atg5），来观察细胞内自噬体的形成和分布。
3. 荧光探针染色：利用特定的荧光探针来标记自噬体，例如LC3染色剂（如LC3-GFP）和酸性小体标记剂（如LysoTracker Red）。
这些染料可以用于观察自噬体形成的时空演变过程。
4. 转基因动物模型：通过构建表达自噬相关标记物的转基因动物模型，如LC3-GFP转基因小鼠，可以观察到生物体内的自噬体形成情况。
除了观察自噬体形成，测量自噬相关蛋白水平也是评估细胞自噬活性的常用方法。
以下是常用的自噬相关蛋白水平检测方法：1. 免疫印迹：通过Western blot技术检测自噬相关蛋白的表达水平。
以LC3为例，可以检测其转化为醛固酮（LC3-I）和醛固酮转化为醛固酮（LC3-II）这一过程。
LC3-II是在自噬体形成过程中在自噬体外膜上积累的标志。
因此，检测LC3-I到LC3-II的转化可以用作自噬的指标。
2. 转基因动物模型：构建表达自噬标志物的转基因动物模型（如GFP-LC3小鼠），通过检测标志物在组织和细胞水平的表达情况来评估自噬活性。
3. 靶标免疫荧光检测：利用免疫荧光技术直接观察和测量自噬相关蛋白的表达水平，如通过LC3抗体进行染色，来检测LC3-II水平。
细胞自噬的研究方法
细胞自噬的研究方法一、本文概述细胞自噬是一种细胞内自我降解和再循环的过程，通过这一过程，细胞能够清除受损、老化或多余的细胞器及蛋白质，从而维持细胞内部环境的稳态。
近年来，随着对细胞自噬机制的深入研究，其在生物学领域的重要性日益凸显，成为了生命科学研究的热点之一。
本文旨在探讨细胞自噬的研究方法，包括细胞自噬的监测技术、诱导与抑制方法，以及研究细胞自噬在疾病发生发展中的作用等。
通过本文的阐述，希望能为从事细胞自噬研究的科研人员提供有益的参考和借鉴，推动细胞自噬研究领域的深入发展。
二、细胞自噬的基本过程与机制细胞自噬是一种细胞内降解和回收细胞质组分和细胞器的重要过程，对维持细胞稳态和适应环境变化具有关键作用。
自噬的基本过程可以分为几个关键步骤，包括自噬体的形成、自噬体与溶酶体的融合以及自噬体内物质的降解。
自噬体的形成是自噬过程的起始阶段。
在这一阶段，细胞内的双层膜结构（称为吞噬泡或自噬泡）开始延伸并包裹待降解的细胞质组分或细胞器。
这一过程受到多种自噬相关基因（ATG）编码的蛋白质的调控。
一些关键的ATG蛋白，如ATG5和ATG12，参与自噬体膜的延伸和闭合。
接下来，自噬体与溶酶体融合，形成一个自噬溶酶体。
在这一步骤中，自噬体的外膜与溶酶体的膜融合，释放出自噬体内的物质进入溶酶体的酸性环境。
溶酶体中含有多种水解酶，这些水解酶能够降解自噬体内的蛋白质、脂质和糖类等有机物。
自噬体内物质的降解是自噬过程的最后阶段。
在自噬溶酶体中，水解酶将自噬体内的物质分解为小分子，如氨基酸、脂肪酸和单糖等。
这些小分子可以被细胞重新利用，以支持细胞的代谢活动和生长需求。
除了上述基本过程外，细胞自噬还受到多种信号通路的调控。
例如，雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号通路和腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）信号通路是调控自噬的两个重要通路。
mTOR通路在营养充足时抑制自噬，而在营养不足时则促进自噬的发生。
AMPK通路则在能量不足时激活自噬，以提供能量来源。
自噬流的检测方法
自噬流的检测方法一、本文概述自噬流是一种细胞自我消化和再生的过程，对于维持细胞稳态和适应环境变化具有重要意义。
随着生物学研究的深入，自噬流的检测已成为研究细胞自噬机制的重要手段。
本文旨在综述自噬流的检测方法，包括常用的生物化学方法、显微成像技术以及基于流式细胞仪的分析等。
我们将详细介绍这些方法的原理、操作步骤、优缺点以及应用实例，以期为自噬流研究提供全面的技术支持和参考。
通过本文的阅读，读者可以深入了解自噬流检测的原理和方法，掌握自噬流研究的最新进展，为相关研究提供有益的借鉴和指导。
二、自噬流的基本概念和机制自噬流（Autophagic Flux）是细胞自噬过程的一个核心概念，它描述了从自噬体的形成、自噬底物的降解，到降解产物的再利用这一连续过程。
自噬是一种细胞内的降解途径，通过这一过程，细胞可以将受损的细胞器、错误折叠的蛋白质或其他细胞内组分包裹在双层膜结构的自噬体中，并运送到溶酶体进行降解，从而实现物质的循环利用和细胞的稳态维持。
自噬流的基本机制涉及多个关键步骤。
细胞在感受到饥饿、缺氧或其他压力信号时，会启动自噬过程。
随后，自噬相关基因（Autophagy-related genes, ATGs）及其产物会参与自噬体的形成。
这些自噬体通过膜延伸和闭合，将待降解的底物包裹在内。
形成成熟的自噬体后，它们会与溶酶体融合，形成自噬溶酶体。
在自噬溶酶体中，自噬体的内膜及其包裹的底物会被溶酶体中的水解酶降解，释放出氨基酸、脂肪酸等小分子物质。
这些降解产物随后会被细胞重新利用，以支持细胞的生存和代谢活动。
自噬流的顺畅进行对于细胞的正常生理功能至关重要。
它不仅可以清除细胞内的有害物质和受损组分，还可以为细胞提供能量和营养物质，以应对各种环境压力。
因此，研究自噬流的检测方法对于理解自噬的生理和病理作用，以及开发相关疾病的治疗策略具有重要意义。
三、自噬流检测方法的分类与特点自噬流的检测是理解自噬过程的关键环节，其方法多种多样，各具特点。
肿瘤细胞自噬调节机制及研究方法
肿瘤细胞自噬调节机制及研究方法细胞自噬是一种重要的生物学过程，旨在维持细胞代谢平衡和清除不需要的或受损分子。
在正常细胞中，自噬机制通常起到维持细胞生长和稳态的作用。
然而，在某些情况下，如营养匮乏，细胞受到胁迫或恶性转化，自噬机制会被激活，导致细胞死亡或存活。
对于肿瘤细胞来说，自噬机制的调节非常重要。
它们可以通过自噬来获取生存所需的营养，抵抗化疗药物的毒性并维持肿瘤生长。
因此，理解肿瘤细胞自噬的调节机制是开发新型抗癌治疗策略的关键。
调节自噬的信号通路自噬的信号通路是通过一系列蛋白质，包括 Beclin-1、Atg5、LC3B 等，构成的复杂动态网络实现的。
一个主要的自噬调节器是表达过量的 B-cell lymphoma 2 (Bcl-2) 家族蛋白。
表达如 Bcl-2、Bcl-xL 和 Mcl-1 的抗凋亡蛋白，促进细胞存活和增殖，同时抑制自噬信号通路。
类系蛋白木瓜酶样磷酸酯酶（Class III Phosphatidylinositol-3-kinase，PI3KC3）是一个重要的自噬信号通路调节器。
PI3KC3 和其配体 Beclin-1 可以促进自噬体的形成。
此外，mTOR 激酶是调节自噬通路最重要的负调节因子。
通过抑制Atg1/ULK1 复合物的活性和抑制 Beclin-1 的表达和活性，mTOR 可以调节自噬通路并促进细胞增殖和生长。
研究肿瘤细胞自噬的方法目前，研究自噬的方法主要有三种：显微镜技术、免疫印迹和荧光成像技术。
显微镜技术可以观察自噬体的形成和聚集，允许分析细胞渗透压、酸碱度和溶酶体内钙离子浓度。
免疫印迹技术可以定量测量关键自噬蛋白表达的变化，例如 LC3B 和 Beclin-1。
荧光成像技术可以在单个细胞水平上检测特定自噬体，例如绿色荧光蛋白 (GFP) 的 LC3B 融合蛋白质。
在研究肿瘤细胞自噬的调节机制时，还需要考虑肿瘤细胞本身的异质性、环境因素和药物治疗等问题。
为此，许多研究方法被开发出来，包括细胞活性测试、药物筛选和基因编辑技术。
细胞自噬相关通路关键分子的检测方法
细胞自噬是一种重要的细胞生物学过程，涉及多个关键分子和通路。
以下是一些常用的检测方法，用于研究细胞自噬相关通路的关键分子：
1. 免疫荧光染色：通过使用特异性抗体标记关键分子，然后观察其在细胞中的分布和表达水平变化。
例如，可以使用LC3B抗体来标记自噬囊泡膜结构，并观察自噬囊泡的形成和降解。
2. 免疫印迹（Western blot）：通过提取细胞蛋白质并使用特异性抗体进行免疫印迹分析，以检测关键分子的表达水平变化。
例如，可以检测LC3B-II（转化后的形式）和p62等自噬相关蛋白的表达水平。
3. 转基因小鼠模型：利用基因工程技术构建具有特定基因缺陷或突变的小鼠模型，从而研究关键分子对细胞自噬的影响。
通过对这些小鼠进行组织或细胞水平的分析，可以评估关键分子在自噬调控中的作用。
4. 实时荧光显微镜：利用荧光标记的自噬囊泡膜结构或关键分子，观察细胞内自噬过程的实时动态变化。
例如，可以使用mCherry-GFP-LC3B融合蛋白来监测自噬囊泡的形成和降解过程。
5. 基因组学和转录组学方法：通过测定关键分子的基因表达水平变化和调控机制，以了解自噬相关通路的调控网络。
这包括RNA测序（RNA-seq）和质谱法等高通量技术。
这些方法的选择取决于具体研究问题和实验要求。
综合应用多种技术可以更全面地揭示细胞自噬相关通路的关键分子的功能和调控机制。
1。
自噬的热点研究方法及步骤
自噬的热点研究方法及步骤自噬作为时下的研究热点，有非常深远的研究意义。
一、自噬病毒工具1）GFP-LC3单荧光自噬指示病毒系统GFP-LC3病毒系统可高效感染目的细胞，表达GFP-LC3，感染感染后细胞可在荧光显微镜下实时观察自噬的整体水平；由于电镜耗时长，不利于监测（Monitoring）自噬形成。
我们利用LC3在自噬形成过程中发生聚集的现象开发出了GFP-LC3指示技术：无自噬时，GFP-LC3融合蛋白弥散在胞浆中；自噬形成时，GFP-LC3融合蛋白转位至自噬体膜，在荧光显微镜下形成多个明亮的绿色荧光斑点，一个斑点相当于一个自噬体，可以通过计数来评价自噬活性的高低。
汉恒生物已开发出高效的评价用GFP-LC3病毒载体，通过瞬时高效感染细胞，配合活细胞工作站成功评价自噬流。
2）mRFP-GFP-LC3双荧光自噬指示病毒系统表达mRFP-GFP-LC3 融合蛋白的病毒产品。
mRFP 用于标记及追踪LC3，GFP 的减弱可指示溶酶体与自噬小体的融合形成自噬溶酶体，即由于GFP 荧光蛋白对酸性敏感，当自噬体与溶酶体融合后GFP 荧光发生淬灭,此时只能检测到红色荧光。
已多种双荧光病毒系统提供，具体如下：a）mRFP-GFP-LC3腺病毒系统——可高效感染目的细胞，表达mRFP-GFP-LC3，感染后细胞可在荧光显微镜下实时观察自噬发生过程；b）mRFP-GFP-LC3慢病毒系统——可以稳定表达持续检测细胞的自噬流检测；c）mRFP-GFP-LC3腺相关病毒（AAV）系统——最有效的在体自噬流检测工具；二、自噬检测以及整体服务1）自噬检测服务常规自噬检测服务包括western blot检测细胞自噬的水平，优惠提供自噬常规抗体LC3、p62以及beclin1等，我们的研究团队长期为客户提供自噬技术服务，有丰富的自噬研究经验，我们的优势是周期短，质量高；a）利用Western Blot检测LC3-II/I比值的变化以评价自噬形成。
细胞自噬检测方法
细胞自噬检测方法细胞自噬是一种细胞内降解和再利用细胞器和蛋白质的过程，它在细胞生理和病理过程中起着重要的调节作用。
因此，了解和研究细胞自噬的检测方法对于揭示其机制和在疾病治疗方面的应用具有重要意义。
细胞自噬的检测涉及多个层面，可以从整体水平观察细胞自噬、蛋白质水平观察细胞自噬和基因水平观察细胞自噬等多个方面进行研究。
首先，观察细胞自噬可以通过显微镜检测。
荧光显微镜技术是一种常用的方法，通过标记或染色示踪自噬相关的分子或结构，如LC3、ATG5/12或LAMP1等，来观察它们在细胞内的分布和表达水平变化。
这些标记物通常与荧光探针结合，形成具有特异性荧光信号的复合物，可以直接观察到自噬相关结构的形态和分布。
其次，细胞自噬的检测可以通过检测自噬相关蛋白的水平来进行。
Western blot 是常用的蛋白质检测方法之一。
通过分离细胞蛋白，使用特异的抗体针对自噬相关蛋白，如LC3、p62等，进行免疫检测。
通过比较蛋白质表达的变化，可以初步判断细胞自噬的活性和程度。
此外，还可以利用流式细胞术的方法，通过荧光标记的抗体或荧光素偶联的二抗与自噬相关蛋白进行特异性结合，进而利用流式细胞仪检测细胞自噬相关蛋白的表达水平。
细胞自噬的检测在基因水平上也是重要的。
使用CRISPR/Cas9技术敲除或过表达自噬相关基因，如ATG5、ATG7等，来研究自噬的调节作用。
此外，还可以使用siRNA等RNA干扰技术来抑制或增强自噬相关基因的表达，进一步验证其在细胞自噬中的作用。
除了上述方法，还可以利用融合蛋白或双荧光蛋白标记技术来观察细胞自噬。
例如，可以构建GFP-LC3、RFP-GFP-LC3等表达质粒，将其转染到细胞中。
GFP-LC3能够与自噬小体结合，形成黄绿荧光，而RFP-GFP-LC3则能够途径溶酶体的酸性环境而丧失荧光。
通过观察细胞中的荧光颜色变化，可以鉴定细胞自噬活性和自噬体的形成情况。
此外，还可以利用细胞自噬特异性信号分子的荧光探针进行细胞自噬的检测。
自噬荧光研究方法及具体步骤
自噬荧光研究方法及具体步骤自噬（Autophagy）一词来源于古希腊语，是“auto”（自我）与“phagein”（吞噬）的结合。
自噬发生在细胞内，是一个吞噬自身细胞质蛋白或细胞器，使其包被进入双层膜囊泡（自噬体），进而与溶酶体融合形成自噬溶酶体，降解其所包裹的内容物的过程，自噬的意义在于实现细胞本身的代谢需要和某些细胞器的更新。
在自噬过程中，自噬体的形成是关键，其直径平均500nm，囊泡内包裹胞质成分和某些细胞器如线粒体、内吞体、过氧化物酶体等。
与其他细胞器相比，自噬体的半衰期很短，只有8min 左右，说明自噬是细胞对于环境变化的有效反应。
细胞质中的线粒体等细胞器首先被囊泡所包被，这种囊泡主要来自于内质网和高尔基体；囊泡最终形成双层膜结构，即自噬体（autophagosome）；自吞噬体与胞内体融合形成中间自体吞噬泡，最终自体吞噬泡的外膜与溶酶体融合形成自噬溶酶体（autolysosome），由溶酶体内的酶降解自体吞噬泡中的内容物和内膜。
自噬观察检测方法：1．透射电镜下直接观察自噬体Phagophore 的特征为：新月状或杯状，双层或多层膜；自噬体的特征为：双层或多层膜的液泡状结构，内含胞浆成分，如线粒体、内质网、核糖体等；自噬溶酶体的特征为：单层膜，胞浆成分已降解。
2．利用Western Blot 检测LC3-II/I 比值的变化以评价自噬形成自噬形成过程中，胞浆型LC3（LC3-I）会酶解掉一段多肽，转变为膜型LC3 （LC3-II）。
故而LC3-II/LC3-I 比值的大小可估计自噬水平的高低。
3．在荧光显微镜下采用GFP-LC3 融合蛋白来示踪自噬形成无自噬时，GFP-LC3 融合蛋白弥散在胞浆中；自噬形成时，GFP-LC3 融合蛋白转位至自噬体膜，在荧光显微镜下形成多个明亮的绿色荧光斑点，一个斑点相当于一个自噬体，可以通过计数来评价自噬活性的高低。
单荧光检测系统该系统通过外源表达系统在宿主细胞中过表达GFP-LC3B 融合蛋白。
检测细胞自噬的方法
检测细胞自噬的方法
检测细胞自噬的方法主要包括以下三种：
1. 透射电镜法：自噬体属于亚细胞结构，普通光镜下看不到，直接在透射电镜下观察自噬不同阶段的形态变化是一种非常直接的方法。
2. 荧光显微镜观察法：LC3全称MAP1LC3，贯穿整个自噬过程，是目前公认的自噬标记物。
其中，LC3B应用广泛。
自噬体和溶酶体融合后，外膜上的LC3-II被Atg4切割，产生LC3-I循环利用；内膜上的LC3-II被溶酶体酶降解，导致自噬溶酶体中LC3含量很低。
因此，可以通过荧光显微镜观察内源性LC3或GFP-LC3，实现对自噬发生的检测。
3. Western Blot检测LC3和p62蛋白的表达量：利用Western Blot检测LC3-II/I比值的变化评价自噬形成。
自噬形成时，胞浆型LC3-I会酶解掉一小段多肽，随后跟PE结合转变为膜型的LC3-II。
因此可以通过LC3-II/I比值的大小估计自噬水平的高低。
请注意，以上方法可能受到多种因素的影响，例如样本的来源、处理方法、检测条件等。
在进行自噬检测时，建议按照操作规程仔细操作，以保证结果的准确性和可靠性。
同时，建议在进行自噬检测时参考相关文献，以获得更全面的信息。
自噬及其研究方法
自噬及其研究方法自噬是一种细胞内的重要代谢途径，它通过溶解和回收细胞内的有害或无用成分来维持细胞内环境的稳定。
自噬的研究对于深入理解细胞代谢过程、疾病的发生机制以及潜在的治疗策略具有重要意义。
本文将介绍自噬的基本概念和作用机制，并讨论常用的自噬研究方法。
自噬是细胞通过溶解和回收细胞内的蛋白质聚集体、有损细胞器以及其他无用成分的过程。
这一过程主要通过两种途径实现：宏自噬和微自噬。
在宏自噬过程中，细胞将要被降解的物质包裹在双层囊泡，自噬体中，然后自噬体与溶酶体融合，从而使物质被降解。
而微自噬则是通过直接融合溶酶体与被降解的物质实现的。
自噬起源于维持细胞内营养平衡的需要。
在细胞中，自噬的启动过程主要通过特定的信号通路调控，包括mTOR (mammalian target of rapamycin)途径、AMPK (adenosine monophosphate-activated protein kinase)途径和蛋白激酶C (protein kinase C) 途径等。
这些信号通路在细胞内根据环境的需求来调节自噬的速度和强度。
自噬的研究方法可以分为定性研究和定量研究两种。
定性研究主要通过观察细胞内自噬体的形态和分布来判断自噬的发生与否。
其中，常用的方法有原位荧光染色和电子显微镜观察。
原位荧光染色通常使用自噬标记蛋白 LC3 (Microtubule-associated protein 1 light chain 3) 的绿色荧光蛋白（GFP）或者红色荧光蛋白（RFP）标记，通过观察细胞内的荧光信号来评估自噬的发生。
电子显微镜观察则可以直接观察到细胞内自噬体的结构，包括限制膜、自噬体和溶酶体等。
这些方法可以初步确定自噬的发生与否，但无法准确评估自噬的活性。
因此，定量研究自噬的活性变得尤为重要。
其中，西方印迹和荧光测定是常用的定量方法。
西方印迹是一种可以定量测定特定蛋白质表达水平的方法。
在自噬研究中，根据自噬相关蛋白质（如LC3、p62等）的表达水平变化来评估自噬的活性。
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自噬研究方法工具汇总---BIO-RAD
细胞自噬
细胞自噬(autophagy)是依赖溶酶体途径对胞质蛋白和细胞器进行降解的一
种过程。
这个过程可以清除功能异常的细胞器、细胞内病原体以及再循环细胞组分。
尽管自噬最早被发现是应答饥饿，现在发现自噬受到各种胁迫信号的诱导，基础水平的自噬有利于细胞内稳态的维持。
很多因素包括激素刺激的天然免疫信号及能量耗尽或高温等引起的物理胁迫会诱导自噬上调。
相反，很多疾病如癌症、传染性疾病和神经退行性疾病及衰老和自噬的下调都有关联。
自噬主要有三种信号通路：
●Microautophagy小自噬通过溶酶体的膜内陷“吞入”目标分子，起到降解细胞质中小体积物质的作用。
这个过程研究得不是很清楚，膜内陷相关的GTPaseVps1p 蛋白和自噬相关蛋白(Atg)参与其中。
● 分子伴侣介导的自噬(chaperone-mediatedautophagy,CMA)直接将细胞质蛋白
带到溶酶体。
带KFERQ-序列的蛋白质和热休克蛋白Hsc70及其它分子伴侣相互作用形成的复合体和溶酶体膜上的Lamp-2A受体结合后，导致Lamp-2A聚合引发复合体中的底物易位穿越溶酶体膜。
● Macroautophagy大自噬被研究得最多，可以降解更大量的胞浆物质，由特殊的细胞器自噬小体介导。
大自噬起始于吞噬泡装配点（PAS）的形成和
Unc51-likekinase (Ulk)复合体的组装，这启动了自噬小体的形成（图1）。
接着是成核阶段，Ulk复合物与由beclin-1、Vps15、Vps34、Atg14组成classIII PI3K 复合物相互作用形成吞噬泡。
接着吞噬泡膜扩展形成自噬小体，在这个过程中Atg12/5/16复合物促成了磷脂酰乙醇胺（PE）和LC3（酵母中是Atg8）的偶联，这是自噬小体膜唯一已知的标志物。
PE-LC3偶联物在几个关键步骤中起作用：自噬泡膜的扩展、自噬体的识别及自噬溶酶体的形成。
整个过程涉及30多个自噬相关基因（Atg蛋白），包括Beclin-1、溶酶体相关膜蛋白(Lamp-1 and Lamp-2)和微管相关蛋白1A/1Blight chains 3A/B (MAP1LC3A/B 或简称LC3)，这些都是自噬常见的标志物。
最后一步，完全形成的自噬小体与溶酶体融合释放内含的物质被降解。
自噬细胞信号通路
如何检测自噬？
●Microautophagy小自噬研究的工具有限，最常用的就是用电子显微镜观察溶酶体膜内陷形成的囊泡。
● Chaperone-mediated autophagy (CMA) 被研究得较多，三种分子伴侣lys-Hsc70、膜相关Hsc70和lys-Hsp90有积极参与，作为CMA底物受体的膜蛋白Lamp-2A 的水平可以用来评估CMA的活力，Lamp-2A 和Hsc70的共定位可以用来识别CMA-active溶酶体。
另外对于CMA底物的评估可参考以下方面：
1. KFERQ-like targeting motif是否出现
2.与lys-Hsc70–positive溶酶体相关联
3.溶酶体活力依赖的降解速度
4. 与细胞质Hsc70的相互作用
5. 与Lamp-2A胞内区域相互作用;
6. Lamp-2A活力相关的浓度;
7.易位到纯化的溶酶体中的能力
● Macroautophagy大自噬的评估最好使用多个自噬阶段的标志物。
因为自噬小体数量的增加可能是自噬上调也可能是自噬最后阶段被抑制，所以放置合适的对照能说明得更清楚。
1.电子显微镜
透射电镜术(TEM)被广泛用于检测自噬过程中形成的各种结构，从吞噬泡到自噬小体到自噬溶酶体，但这个技术对使用者操作要求较高，且不能准确定量。
2.检测标志物LC3/Atg8和p62/SQSTM1
微管相关蛋白1A/1B light chains 3A/LC3A 和3B/LC3B (MAP1LC3A/B),
通常简称LC3 或酵母中称Atg8，是自噬小体最可靠的标志物。
在自噬过程中，非激活型胞质LC3 (LC3-I) 经过水解和脂质化后转变为激活的自噬小体膜结合LC3-II。
通过Western Blot可以观察到更小的LC3-II 条带, 或者通过免疫荧光或免疫组化，可观察到LC3从胞浆转移到膜结构上。
提示，自噬活跃时，LC3-II的水平也可能低，因为自噬小体与自噬溶酶体融合后LC3-II 会被降解。
另外某些anti-LC3抗体识别LC3-I和LC3-II灵敏度上有差异，且LC3-I 对于反复冻融和降解更敏感即使在SDS上样缓冲液中，因此样品要立即煮沸使用而不要反复冻融。
p62 降解是另一个常用的标志物，它在自噬清除多泛素化蛋白时会被优先降解。
自噬过程中LC3和p62的转录也会被调节，因此除了检测LC3和p62的降解，还需加上其它检测。
3.检测Lamps, Atg5,Atg14, and Beclin-1
针对溶酶体标志物Lamp-1 和 Lamp-2,或吞噬泡及自噬小体的标志
物 Atg5,Atg14,Beclin-1的抗体经常被用在免疫荧光显微镜上、western blot及流式细胞仪上追踪自噬过程的进展。
Lamp-2的检测应该与LC3-II检测联用，因Atg14也与ER关联它的检测也需要与其它标志物检测联用。
4.组织蛋白酶Cathepsin活力检测
荧光标记的组织蛋白酶底物可通过报告cathepsin B, K，L的蛋白酶活力来发现活细胞中的溶酶体。
这些可渗透细胞的无毒的试剂加入到细胞中被cathepsin 降解后产生荧光物质，与细胞核染料如Hoechst及溶酶体和细胞器标志物如acridine·orange联用，可检测自噬水平。
这些检测方法兼容荧光显微镜和酶标仪。
5.检测自噬潮autophagic flux
因为自噬是一个动态的过程，自噬潮是一个动态连续的概念，涵盖了自噬体的形成、自噬性底物向溶酶体的运送以及在溶酶体内降解的整个过程，对这整个过程进行监测较单纯定量自噬小体的数量更能反映自噬活性。
最后提醒大家，自噬和凋亡的关系很密切，例如cathepsins 和Beclin-1也介导凋亡的过程，因此建议大家多使用一些标志物检测以避免得到错误的结论。