葡萄糖异构酶在链霉菌的发酵生产概况
链霉菌的研究概况
链霉菌的研究概况海南大学课程论文题目名称：链霉菌的研究概况学院：专业班级：姓名：学号：评阅意见评阅成绩评阅教师：2014年11 月22 日链霉菌的研究概况（工作单位，姓名）摘要链霉菌(Streptomyces)属于链霉菌属，是高等的放线菌。
链霉菌是一类革兰氏阳性细菌，是一种没有细胞核的原核生物,共约1000多种，其中包括和很多不同的种别和变种。
它主要生长在含水量较低、通气较好的土壤中，一些链霉菌也可见于淡水和海洋。
由于许多链霉菌产生抗生素的巨大经济价值和医学意义，对这类放线菌已做了大量研究工作。
研究表明，抗生素主要由放线菌产生，而其中90%又由链霉菌产生，著名的、常用的抗生素如链霉素、土霉素，抗真菌的制霉菌素，抗结核的卡那霉素，能有效防治水稻纹枯的井冈霉素等，都是链霉菌的次生代谢产物。
有的链霉菌能产生一种以上的抗生素，有化学上，它们常常互不相关；可是，从全世界许多不同地区发现的不同种别，却可能产生同抗生素；改变链霉菌的营养，可能导致抗生素性质的改变。
这些菌一般能抵抗自身所产生的抗生素，而对其他链霉菌产生的抗生素可能敏感。
金黄垂直链霉菌作为链霉菌的一种，它能拮抗多种真菌和细菌，且对香蕉枯萎病的防治效果好，因此，该链霉菌在植物病害的生物防治领域广阔的应用前景。
关键词：链霉菌应用发展第一章绪论1.1综述链霉菌有发育良好的分枝菌丝，菌丝无横隔，分化为营养菌丝、气生菌丝、65孢子丝。
营养菌丝又名基内菌丝，色浅，较细，具有吸收营养和排泄代谢废物的功能；气生菌丝是颜色较深，直径较粗的分枝菌丝；气生菌丝成熟分化成孢子丝，孢子丝再形成分生孢子。
孢子丝和孢子的形态、颜色因种而异，是分种的主要识别性状之一。
已报道的有千余种，主要分布于土壤中。
已知放线菌所产抗生素的90%由链霉菌属属产生。
其中链霉菌属的基内菌丝多分枝，常产生各种水溶性或脂溶性色素，本属种数最多，因许多种是抗生素的产生菌而且产生抗生素的种类最多而著名（如链霉素等）。
葡萄糖异构酶[知识研究]
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萄糖分离开来，将分离出来的葡萄糖再次进
行异构化，并且如此反复多次，最后的混合
物中果糖的含量可以达到70%～90%，这
样的混合物就叫做高果糖浆。
专业知识
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二、酶的特性
葡萄糖异构酶的生物学性质 葡萄糖异构酶能催化D2葡萄糖至D2果糖的异构化反应, 它是工业上大规模从淀粉制备高果糖浆的关键酶,且该酶 可将木聚糖异构化为木酮糖,再经微生物发酵生产乙醇.
◆ 物理破碎法：指利用温度差、压力差或超声波等将细胞破碎开来。
◆ 化学破碎法：指利用甲醛、丙酮等有机溶剂或表面活性剂作用于细胞膜， 使细胞膜的结构遭到破坏或透性发生改变。
◆ 酶学破碎法：指选用合适的酶，使细胞壁遭到破坏，进而在低渗溶液中将 原生质体破碎开来。
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葡萄糖异构酶的分离纯化
◆ 分子筛
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七、酶活力的测定方法
现在国内普遍采用的是钼铵酸显色和半 胱氨酸—-咔唑法，这些方法的优点是灵敏 度高。现象直接，用肉眼可以粗略辨别酶活 大小，但所用试剂多，易受环境温度的影响， 特别是后者需在浓硫酸存在下显色，对实验 者和一起易造成损伤。因此，有必要建立新 的简便快速的检测酶活的手段。
专业知识
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第 七 节
葡
萄
糖
异
构
小组成员：周杰 张芬
酶
周伊玲 陈艳梅
专业知识
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本
参考文献
节
影响
课
酶活的因素
概念和用途
的
框
架
酶活的测定
该酶的特性
葡萄糖异酶
酶的固定化
产生菌株 及其分布
提取 分离、纯化
国内外的 研究情况
专业知识
白色链霉菌盐霉素生产工艺分析
白色链霉菌盐霉素生产工艺分析作者：李艳伟来源：《健康必读·下旬刊》2011年第03期【中图分类号】TQ46 【文献标识码】 A【文章编号】1672-3873（2011）03-0339-02【摘要】以白色链霉菌为产生菌，着重从菌种选育和补料工艺两方面研究提高白色链霉菌的盐霉素产量。
【关键词】盐霉素白色链霉菌发酵工艺盐霉素(salinomycin)是从白色链霉菌(Streptomyces albus)的深层培养液中分离得到的一种聚醚类抗生素，由6分子乙酸，6分子丙酸和3分子丁酸提供的相应酰基缩合而成。
抗生素发酵水平的提高，主要取决于菌种改良和培养工艺优化。
为提高白色链霉菌中盐霉素产量，在过去工作的基础上，我们从菌种选育和补料工艺两方面进行研究，以期提高盐霉素的生产水平。
一、材料与方法1 、菌种供试菌株为白色链霉菌。
2 、培养基斜面培养基高氏一号培养基。
摇瓶培养基(g/L) 牛肉膏5，酵母粉3，氯化钾2，丙三醇20，消泡剂1。
种子培养基(g/L) 葡萄糖15，黄豆粉20，小麦胚芽10，碳酸钙3，牛肉膏5，酵母粉3，氯化钾2，丙三醇20，KH2PO4 1，消泡剂1。
pH6.5～7.0。
3 、实验规模摇瓶种子 250ml三角瓶内装25ml培养基，接入成熟斜面孢子， 33℃于摇床培养70h左右，转速220r/min。
种子培养 20L种子罐装12L培养基，接入摇瓶种子，接种量120ml，罐温35℃，罐压0.05Mpa，搅拌转速500r/min，通气比为1∶0.5vvm，培养30h左右。
4 、测定方法还原糖测定斐林试剂法。
氨基氮测定甲醛法。
盐霉素效价测定以杯碟法测定，检定菌为短小芽孢杆菌。
豆油和脂肪酸的测定按文献进行。
脂肪酶活力的测定 37℃下，将1ml发酵液每分钟分解底物产生1μmo1脂肪酸定义为一个酶活单位。
菌丝浓度的测定 10ml发酵液于离心管内3000r/min离心10min，测量上清液体积，计算得出：菌丝浓度(%)=(10-上清液体积)÷10×100%5 、诱变方法(1)悬浮液制备将生产用孢子斜面，加蒸馏水l0ml，制成孢子悬液，倒入盛有玻璃珠的三角瓶中，置旋转摇床振荡15min，然后用滤纸过滤，使成单孢子悬液，供诱变处理用。
发酵工程填空题
一.填空题第一章1.发酵工业的开展经历了〔自然发酵〕,纯培养技术的建立,〔好气性〕发酵技术的建立,人工诱变育种, 〔代谢限制〕发酵技术的建立,开拓新型发酵原料时期,与〔基因操作〕技术相结合的现代发酵工程技术等六个阶段2.工业发酵方式根据所用菌种是单一或是多种可以分为单一〔纯种发酵〕和〔混合〕发酵.3.微生物培养〔发酵〕方式,可以分为〔分批培养〕〔发酵〕,〔连续培养〕〔发酵〕,补料分批培养〔发酵〕三种类型.4.〔发酵工程〕是连接生物技术上下游过程的重要枢纽；〔发酵工程〕是生物技术产业化的一个主要途径.5.发酵工程开展史可分为三个发酵技术阶段：在1910以前为〔自然〕发酵技术阶段；深层培养生产青霉素属于〔近代〕发酵技术阶段；现代生物技术的技术特征就是以〔基因工程〕为首要标志.第二章1.常用工业微生物可分为：〔细菌〕、酵母菌、霉菌、〔放线菌〕四大类.2.在培养基中掺入可溶性淀粉、酪素或CaCO3可以分别用于检测菌株产〔淀粉〕酶、产〔蛋白〕酶或产〔酸〕水平的大小.3.〔自然选育〕是指对自然界中的微生物〔未经人工诱变或杂交处理的情况下〕进行别离和纯化,择优选取微生物菌种的方法.4.工业微生物育种的根本方法包括自然选育、〔诱变育种〕、代谢限制育种、〔基因重组〕和定向育种等；原生质体融合技术、基因工程技术而进行的诱变育种称为〔杂交育种〕.5.由于自发突变的作用而引起某些优良特性变弱或消失的现象称〔菌种衰退〕.6.常用菌种保藏方法有〔斜面〕、沙土管、〔液体石蜡〕、真空冷冻等保藏法等.7.〔自然选育〕方法简单易行,但获得优良菌种的几率小,一般难以满足生产的需要.8. 获得纯培养的方法有〔稀释法〕、划线法、〔单细胞〕挑选法、选择培养基别离法等方法.9.富集培养目的就是让〔目的菌〕在种群中占优势,使筛选变得可能.10.工业微生物菌种可以来自〔自然别离〕,也可以来自从微生物菌种保藏机构与〔工业单位〕获取.11.从自然界〔获得目的菌的〕别离和筛选微生物菌种,一般分为采样、〔富集培养〕、纯种别离、〔初筛和复筛〕等步骤.12.〔透明圈〕法在固体培养基中渗入溶解性差、可被特定菌利用的营养成分,造成浑浊、不透明的培养基背景,所筛选的菌落周围就会形成透明圈.13.〔变色圈〕法在底物平板中参加指示剂或显色剂,使所需微生物能被快速鉴别出来.14.〔生长圈〕法将待检菌涂布于含工具菌并缺少工具菌营养物的平板上培养,假设能合成平板工具菌所需的营养物,在该菌株的菌落周围工具菌便会形成一个混浊的生长圈.15.〔富集培养〕：是根据微生物生理特点,设计一种选择性培养基,将样品加到培养基中,经过一段时间的培养,目的微生物迅速生长繁殖,数量上占了一定的优势,从中可有效别离目的菌株.第三章1.氨基酸,蛋白质,核昔酸,核酸,多糖,脂肪酸,维生素等,是各种不同种生物所共有的〔初级代谢产物〕.2.抗生素、生长刺激素、维生素、色素、毒素、生物碱是由特定物种在特定阶段产生,且受环境影响很大的〔次级代谢产物〕.12.发酵动力学主要内容为〔细胞生长〕动力学、〔基质消耗〕动力学及产物形成动力学.13微生物调节其代谢采用调节〔酶活性〕、〔酶合成量〕、细胞膜的透性的三种方式.第四章1.实验室中配制固体培养基要加〔0.2%~0.7%〕琼脂或5~12 %明胶等剂,〔1~2 %〕培养基的琼脂用量那么为半固体2.天然的〔孢子〕培养基主要有：麸皮培养基、小米培养基、大米培养基、玉米碎屑培养基等.3.〔种子〕培养基有供菌体大量繁殖的营养基质,营养成分要求比拟丰富和完全,能维持稳定的〔pH〕, 最后一级的种子培养基的成分最好能较接近〔发酵〕培养基.4.〔发酵〕培养基常用分批补料的方式来满足生长和合成两阶段不同的代谢需求.5.发酵培养基的成分中必包含〔碳源〕、〔氮源〕无机盐、〔生长因子〕和水五大营养要素,还根据需要添加前体和产物促进剂.6.工业上常用〔葡萄糖〕为淀粉水解糖,但要到达一定的质量指标.第五章1.〔高压蒸汽灭菌法〕可杀灭包括芽胞在内的所有微生物,是灭菌效果最好、应用最广的灭菌方法.2.经5~7分钟后受紫外线照射的空气,才能使氧气产生〔臭氧〕.因此消毒时间应从灯亮5 — 7分钟后计时.3.30w的紫外线灯管有效照射距离为〔25飞0〕,时间为〔25~30〕分钟4.培养基湿热灭菌以杀死热阻大的〔芽抱杆菌〕为指标.5.空气中的微生物以〔细菌和细菌芽胞〕较多.第六章1.产抱子水平强及抱子发芽繁殖快的菌种采用〔固体〕培养；〔细菌〕、酵母菌应采用液体摇瓶培养.2.种子培养基营养成分要适当丰富和完全,〔氮源〕和〔维生素〕含量要高.3.影响种子质量的主要因素包括培养基成分,〔种龄〕与接种量,〔温度〕,湿度,pH值,通气和搅拌, 泡沫,染菌的限制和种子罐级数确实定.4.菌种扩大培养的目的是为每次发酵罐的投料提供〔数量相当〕的〔代谢旺盛〕的种子.5.生产上采用微生物能承受的〔稍高〕温度繁殖,可减少杂菌污染,减少降温能耗.第八章1.发酵过程工艺限制的代谢参数中物理参数有〔温度〕、〔压力〕、搅拌转速、功率输入、流加数率和质量等.2.发酵热包括〔生物热〕、搅拌热、蒸发热和〔辐射热〕等几种热.3.发酵过程中调节pH值的方法主要有添加碳酸钙法、〔氨水或液氨〕流加法和尿素流加法.4.微生物工业上消除泡沫常用的方法有〔化学消泡〕和〔机械〕消泡.5.根据微生物与氧的关系,发酵可分为〔有〔需〕氧〕发酵；〔厌氧〕发酵两大类.6.发酵产物的浓缩和纯化前一般先要对发酵液进行〔预处理〕,然后才能提取,精制等相关操作.7.发酵过程限制的目的就是得到最大的〔比生产率〕和最大的〔得率〕.8.实验室中进行的发酵菌液体发酵方式主要有四种：〔试管液体〕培养、培养皿浅层液体培养、〔摇瓶培养〕、台式发酵罐.9.发酵过程主要分析工程如下：〔pH〕、排气氧、排气CO2和呼吸熵、〔糖含量〕、氨基氮和氨氮、磷含量、菌浓度和菌〔形态〕.第九章1.环境无菌的检测方法有：〔显微镜〕检查法、肉汤培养法、〔平板〕培养法、发酵过程的异常观察法等2.染菌原因：发酵工艺流程中的各环节漏洞和发酵过程〔治理不善〕两个方面.3.不同菌种发酵污染的杂菌不同,如放线菌最适pH为7左右,因此染〔细菌〕为多；霉菌生长pH为5左右,因此染〔酵母菌〕为多.4.按染菌时间不同,可分为：〔种子培养〕期染菌、发酵前期染菌、发酵中期染菌、发酵后期染菌四个阶段.第十章1.发酵产物整个别离提取路线可分为：〔预处理〕、固液别离、〔初步纯化〕、精细纯化和成品加工等五个主要过程.2.黄酒以大米、黍米为原料,一般酒精含量为〔14%—20%〕,属于低度酿造酒.3.格瓦斯是一种盛行于俄罗斯、乌克兰和其他东欧国家的,含〔1%左右〕低度酒精的饮料.4.〔半干黄酒或称加饭酒〕酒质厚浓,风味优良.是黄酒中的上品.我国大多数出口酒,均属此种类型.5.黄酒生产的主要原料是酿酒用的大米,包括〔糯米〕、粳米和籼米.6.一般落缸后,经〔36~ 48 h〕,饭粒软化,香气扑鼻；此时酿窝已成熟,可以参加一定比例的麦曲和水, 俗称〔冲缸〕.7.黄酒发酵成熟酒醅中的酒液和糟粕的别离操作称为〔压滤或压榨〕.8.压榨设备过去长期采用杠杆式的古老〔木榨〕；现多采用板框式气膜压滤机,能到达酒液澄清、糟粕干、时间短的要求.二.选择题第一章1.以下关于发酵工程的说法,错误的选项是〔C 〕A发酵工程产品主要是指微生物的代谢产物、酶和菌体本身B可以通过人工诱变选育新菌株C培养基、发酵设备和菌种必须经过严格的灭菌D环境条件的变化既影响菌种的生长繁殖又影响菌体代谢产物的形成2.发酵工程是生物技术实现以下哪项的关键环节〔A 〕A产业化 B商品化 C社会化 D平安化3.通气搅拌技术的建立是发酵技术进步的〔C 〕A第一个转折期B第二个转折期C第三个转折期D第四个转折期4.以下关于单细胞蛋白的表达,正确的选项是〔B 〕A是微生物细胞中提取的蛋白质B是通过发酵生产的微生物菌体C是微生物细胞分泌的抗生素D单细胞蛋白不能作为食品第二章1 . (D )中的链霉菌属用于生产链霉素、四环素、红霉素、新霉素、卡那霉素和井冈霉素等.有的可产生 工业用蛋白酶、葡萄糖异构酶或维生素B12等.A 细菌B 酵母菌C 霉菌D 放线菌2 . (C )通常用于别离筛选氨基酸、核昔酸和维生素等的产生菌.工具菌是一些相对应的营养缺陷型菌株.A 透明圈法B 变色圈法C 生长圈法D 抑菌圈法.3 . (D )常用于抗生素产生菌的别离筛选.工具菌采用抗生素的敏感菌.A 透明圈法B 变色圈法C 生长圈法D 抑菌圈法.4 . (A )常用于脂肪酶、淀粉酶、蛋白酶产生菌的别离筛选.A 透明圈法B 变色圈法C 生长圈法D 抑菌圈法.5 .关于菌种的选育不正确的选项是(C )A 自然选育菌种费时且盲目性大B 诱变育种原理的根底是基因突变C 代谢限制育种方法有转化、转导及杂交D 采用基因工程的方法可构建工程菌6 .平板划线别离法不需要下面哪个物品或设备(D )A 接种环B 琼脂培养基平板C 超净工作台D 电泳仪7 .诱变处理时所用的出发菌细胞应处于(B )A 延迟期B 对数生长期C 稳定期D 衰亡期8 .发酵工程的第一个重要工作是选择优良的单一纯种.消灭杂菌,获得纯种的方法不包括(C )A.根据微生物对碳源需求的差异,使用含不同碳源的培养基B.根据微生物缺乏生长因子的种类,在培养基中增减不同的生长因子C.根据微生物遗传组成的差异,在培养基中参加不同比例的核酸D.根据微生物对抗菌素敏感性的差异,在培养基中参加不同的抗菌素 第三章1 . (C )可以有效限制发酵液的基质浓度,提升发酵产率.A 分批发酵B 连续发酵C 补料分批发酵D 糖类发酵2 .某些放线菌产生的抗生素,是它们的(B )A 初级代谢产物B 次级代谢产物C 代谢中间产物D 代谢废物3 .微生物代谢的调节属于(C )A 神经调节 B.激素调节 C.酶的调节 D.基因调节4 .关于微生物代谢产物的说法中不正确的选项是(D )A 初级代谢产物是微生物生长和繁殖所必须的B 次级代谢产物并非是微生物生长和繁殖所必须的C 初级代谢产物在代谢调节下产生D 次级代谢产物的合成无需代谢调节5 .以下抗生素作用机制中,抑制细胞壁合成的是(D )A 利福霉素B 四环素C 氯霉素D 青霉素6 .酶活性调节速度比酶合成调节速度(A )A 快B 慢C 相等D 无法比拟10.大多数芽抱细菌形成芽抱在哪个时期(C )第四章 1 .发酵工业中使用的培养基按成分划分多为(C )A 天然培养基B 合成培养基C 半合成培养基2 .培养过程中不希望培养基pH 发生变化时,应该(C )A 加酸B 加碱C 加缓冲液D 加无机盐3 .以下营养物质中,不同时含有碳源、氮源和生长因子的是(C )A 牛肉膏B 蛋白胨C 生物素D 酵母粉4 .在培养基的配制过程中,具有如下步骤,其正确顺序为(B )①溶化②调pH ③加棉塞④包扎⑤培养基的分装⑥称量A ①②⑥⑤③④B ⑥①②⑤③④C ⑥①②⑤④③D ①②⑤④⑥③5 .固体培养基中需要参加琼脂的目的是(D )A 调整期B 对数期 11.巴斯德效应是指(D )A 乳酸对微生物的抑制C 氧气对呼吸作用的抑制 C 稳定期D 衰亡期B 酒精对葡萄糖分解的抑制 D 氧气对发酵作用的抑制A为菌体提供碳源B为菌体提供氮源C使培养基保持水分D使培养基凝固6..实验室常用的培养放线菌的培养基是(C )A牛肉膏蛋白胨培养基B马铃薯培养基C高氏一号培养基D麦芽汁培养基7.以下关于生长因子的说法中,不正确的一项为哪一项(B)A.是微生物生长不可缺少的微量有机物B.是微生物生长不可缺少的微量矿质元素C.主要包括维生素、氨基酸和碱基等D.是微生物自身不能合成的8.1.列属于微生物不可缺少的微量有机物是(D )①牛肉膏②蛋白胨③氨基酸④维生素⑤碱基⑥生物素A.①②③B.②③④C.②③④⑤D.③④⑤⑥第五章1.关于灭菌和消毒的不正确的理解是(B )A灭菌是指杀灭环境中的一切微生物的细胞、芽抱和抱子B消毒和灭菌实质上是相同的C接种环用烧灼法灭菌D常用灭菌方法有加热法、过滤法、紫外线法、化学药品法2.加热灭菌时,一般营养细胞的致死温度是多少度(B )A 32℃B 60rC 100℃D 120℃.3.使用高压锅灭菌时,翻开排汽阀的目的是(D )A预防高压锅内压力过高,使培养基成分受到破坏B排尽锅内有害气体C预防锅内压力过高,造成灭菌锅爆炸D排尽锅内冷空气4.实验室常规高压蒸汽灭菌的条件是 (C )A 135℃—140℃, 5—15 秒B 72℃、15 秒C 121℃, 30 分钟D 100℃, 5 小时5.出于限制微生物的目的,灭菌一词指的是(C )A除去病原微生物B降卑微生物的数量C消灭所有的生物D只消灭体表的微生物6.紫外线辐射主要作用于微生物的(C )A糖类 B酶类 C核酸 D细胞壁7.发酵通入空气的除菌的方法是(D )A干热杀菌法B湿热杀菌法 C静电除菌法 D介质过滤除菌法.第八章1.种子罐或发酵罐之间的移种方式采用CA微孔接种法B火焰接种C差压送法2.常作为生产菌种和科研材料的细菌群体,应该是代谢旺盛、个体形态和生理特性比拟稳定的.所以应选择在它的(B)A迟滞期 B对数期 C稳定期 D衰亡期3.微生物群体生长状况的测定方法可以是(B )①测定样品的细胞数目②测定次级代谢产物的总含量③测定培养基中细菌的体积④测定样品的细胞重量A.②④B.①④C.①③D.②③4.酵母菌培养液中常含有一定浓度的葡萄糖,但当葡萄糖浓度过高时,反而会抑制微生物的生长,原因是(8)A.碳源供给太充足B.细胞会发生质壁别离C.改变了酵母菌的pH值D.葡萄糖不是酵母菌的原料5.在微生物生长的过程中,细胞形态最多和数目最多的时期是(B)A.对数期、稳定期B.衰亡期、稳定期C.迟滞期、衰亡期D.衰亡期、对数期6.在实际生产中,对数期的长短取决于(A )①培养罐的大小②接种量的大小③培养基的多少④代谢产物合成的多少A.②③B.②④C.①②D.①③第八章1.在发酵中有关氧的利用正确的选项是(B )A微生物可直接利用空气中的氧B微生物只能利用发酵液中溶解氧C温度升高,发酵液中溶解氧增多D机械搅拌与溶氧浓度无关2.发酵过程中,不会直接引起pH变化的是(C )A营养物质的消耗B微生物呼出的CO2C微生物细胞数目的增加D代谢产物的积累3.发酵液中含量最高的成分为(A )A水分 B蛋白质 C发酵产物D菌体4.通过影响微生物膜的稳定性,从而影响营养物质吸收的因素是(B )A.温度B. pHC.氧含量D.前三者的共同作用5.酵母菌适宜的生长pH值为(A )A 3.8-6.0B 3.0-4.0C 8.0-9.0D 7.0-7.56. 1摩尔葡萄糖通EMP和TCA循环彻底氧化共产生多少摩尔ATP (C)A 34B 36C 38D 39第十章1 ( A )原料经发酵,(不经蒸馏)而可直接饮用的酒A酿造酒 B蒸馏酒配制酒D果露酒2( B )含糖量0.5〜5g/100 ml的黄酒按糖分可确定属于A干黄酒 B半干黄酒C半甜黄酒D甜黄酒 E浓甜黄酒3 ( B )绍兴的加饭、元红黄酒采用()生产A淋饭法 B摊饭法 C喂饭法 D双加饭4( A )目前发酵工业常用的处理菌体、固形物杂质和悬浮物等固体物质,保证处理液澄清的主要方法为A离心和过滤B离心和萃取C蒸馏和萃取D离子交换和过滤5( B )如果发酵工程生产的产品是菌体,菌体别离采用的方法是A.蒸馏B.过滤C.萃取D.离子交换6( C )以下不属于发酵工程应用的是A.生产抗生素、维生素、药用氨基酸等B.生产啤酒、果酒和食醋等C.用于化学检测和水质监测D.生产各种各样的食品和添加剂三.判断题第二章1.人工诱变、细胞工程、基因工程等都能对微生物进行定向改造..X2.土壤是获得微生物菌种的主要来源.J第三章1.初级代谢是次级代谢的根底,为次级代谢提供前体或起始物.J2.EMP和HMP代谢途径往往同时存在于同一种微生物的糖代谢中.X3.同功酶是行使同一功能、结构不同的一组酶 V4.最适的生长繁殖温度就是微生物代谢的最适温度.X5.微生物的次级代谢产物是初级代谢不畅通时,由支路代谢产生的.X6.分批培养时,细菌首先经历一个适应期,此期间细胞处于代谢活动的低潮,所以细胞数目并不明显增加.^7.化能异养菌以有机物作为呼吸底物,以02作为最终电子受体进行有氧呼吸作用产生能量.V 第四章1.精确定量某些成分而配制的培养基是所有成分的性质和数量的培养基,称为天然培养基.X2.目前不能从生化反响根本原理来推断和计算出适合某一菌种的培养基配方V3.但凡影响微生物生长速率的营养成分均称为生长限制因子.V第五章(V)煮沸法常用于注射器、注射针等器皿的消毒.(V)高压蒸汽灭菌时布类物品应放在金属类物品上(X)紫外线能透过纸张和固体物质(V)紫外线灭菌时,物品要摊开或挂起,以扩大照射面.(V)细菌比酵母、丝状菌或霉菌抱子更耐热.(X)发酵通入空气的除菌采用的是加热杀菌法(V)无菌药品生产所需洁净区以D级为最高.A(V)洁净区与非洁净区之间、不同等级洁净区之间的压差应不低于100帕斯卡X10(V)灭菌就是杀死一定环境中所有微生物的营养细胞、抱子和胚芽.(X)巴斯德消毒法能杀死牛奶或奶制品中存在的所有微生物.(J)因紫外线的穿透力低,所以,仅用于外表消毒和空气的消毒.(J)压缩空气过滤前的预处理包括压缩空气的冷却、压缩空气的除油除水第六章无机离子中Mg2+、CU2+、Ba2+能刺激抱子的形成通常接种量是细菌〈酵母菌〈霉菌.第七章液体厌氧发酵设备放大、制造和操作时,都比好气发酵设备简单得多.盘曲、帘子曲是最简单的固体发酵技术第八章1.环境条件的变化不仅会影响微生物的生长繁殖,也会影响微生物的代谢途径.J2.发酵罐中微生物的生长繁殖、代谢产物的形成都与搅拌速度有关.J3.微生物的最适生长繁殖温度就是积累代谢产物的最适温度.X4.通过调节根底培养基的配方和补料限制可以调控发酵醪的pH值.J第九章1.按危害轻重排序依次为：发酵后期,种子培养期,发酵前期染菌；发酵中期染菌；J2.污染时间是指无菌检测确准的,不是杂菌窜入培养液的时间.J3.发酵染菌对产品质量和数量的影响有：①产物遭破坏②降低产量③产物报废J4.染菌对细菌及放线菌的发酵影响最大、危害最广的是噬菌体.J第十章1.()黄酒前酵期,酒精浓度可到达15%左右.2.()后发酵过程中会生成各种香味物质,同时酒精度可进一步提升到16%以上.3.()经灭菌的黄酒要趁热灌入陶坛或大罐进行贮存,以防杂菌入侵而变质.。
链霉素发酵工艺技术
生物制药工程系毕业实习调研报告姓名：专业：班级：学号:指导老师：完成时间：目录链霉素的发酵工艺过程1、制备流程图 (1)2、链霉素详细过程 (2)3、链霉素制备注意事项 (8)4、参考文献 (8)链霉素的发酵工艺过程发酵工艺流程图：摘要：链霉菌在生产抗生素方面的特殊作用使它成为放线菌中遗传育种的核心，近年来的进展主要在于原生质体融合、脂质体的使用、质粒及其它载体的发现和克隆技术工业应用。
本文综述了链霉素生物合成途径、代谢调节机制、链霉素发酵的代谢调控育种及其进展。
关键词：链霉素；发酵；代谢调控链霉素是1944年从灰色链霉菌培养液中分离出来的一种碱性抗生素，我国于1958年以来大量生产，目前已形成了相当大的生产规模与能力。
传统工艺:链霉素早期的提取方法采用活性炭吸附法、带溶法、沉淀法、离子交换法。
目前国内外多采用离子交换法提取链霉素，其工艺流程如图:链霉素是由链霉胍、链霉糖和N-甲基-L-葡萄糖胺组成的三糖苷，属于氨基糖苷类抗生素。
链霉胍是在l，3-位置上带有2个孤基的l，3-去氧青蟹肌醇，去掉2个脒基后称为链霉胺。
链霉糖是带有支链的5’-脱氧五碳糖，在第3碳上有一个醛基。
N-甲基-L-葡萄糖胺是在第2碳上的-NH2被甲基化(-CH3NH)的L-葡萄糖胺。
这三糖连接的糖苷键都是α型的糖苷键。
链霉素发酵工业延续至今已有相当长的历史，和其它抗生素生产过程一样，它的菌体生长，产物形成等所涉及的一系列时刻变化着的生物化学和质量、能量传递过[1]使链霉素发酵表现出相当程度的不确定性。
同时又由于反应机理复杂，无合适的模型用以描述过程，使人们在其发酵操作上依赖经验甚于理论。
这给链霉素生产水平的提高带来了一定的困难，但同时又给基于理论分析提高生产提供了可能。
1 链霉素生物合成的途径及代谢调节机制1.1 链霉素的生物合成途径由D-葡萄糖和NH3合成链霉素的大致途径如图1所示[2]从图l可看出，每生成1个链霉素分子都需消耗3个葡萄糖分子、7个HN3分子、2个CO2分子和l个甲硫氨酸分子。
项目二 链霉素的发酵
液氮保藏(-196℃)
或
沙土管保藏(2-4℃)
斜面培养恒温恒湿35-36℃，7天
原斜面孢子
工艺流程
斜面培养恒温恒湿34-35℃，6天
斜面孢子(代1)
摇瓶培养33-34℃，39.5hr转速250rpm 装量80ml/750ml接种量一块斜面/瓶50-64hr 小罐种子培养36±0.5℃24-30h转速60-300rpm， 搅拌功率5.5kw通气量2m3/min,罐压0.03Mpa 中罐种子培养36±0.5℃，25hr转速60-240rpm接种量15% 通气量1.5VVM罐压0.03Mpa搅拌功率22kw 大罐发酵36±0.5℃，136hr转速60-130rpm接种 量15%通气量0.75VVM罐压0.04Mpa搅拌功率115kw
链霉素的发酵方案的制备
制作小：第三组 陈文 顾香君 戴逊 桑圣月 冯伊鹭 陈科亦
一、概 述
链霉素（streptomycin）是一种氨基葡 萄糖型抗生素，分子式C21H39N7O12。 1943年美国 S.A.瓦克斯曼从链霉菌中分离 得到，是继青霉素后第二个生产并用于临 床的抗生素。它的抗结核杆菌的特效作用 ，开创了结核病治疗的新纪元。从此，结 核杆菌肆虐人类生命几千年的历史得以有 了遏制的希望。
链霉素效价的测定
效价测定的方法：（1）样品处理 A．发酵液浸提处理：称取2g均匀后发酵液加丙酮 浸提液9ml，超声40min，8000r/min离心5min，取 上清备用。若效价较高，可用0.1mol/L，pH4.0的醋 酸-醋酸钠缓冲液，进行一定稀释。 B.丙酮浸提液：丙酮：1mol/L HCl：水 =490ml:48ml:462ml ,再用1mol/HCl调节pH至1.82.3。 (2) 也像（HPLC）检测 柱子：Gemini C18 洗脱液：乙腈50mM KH2PO4=30%:70%,pH4.5
葡萄糖异构酶
葡萄糖异构酶研究概况摘要：葡萄糖异构酶(glucose isomerase，GI)能催化D—葡萄糖至D—果糖的异构化反应，是工业上大规模从淀粉制备高果糖浆的关键酶，目前国内外众多科研机构和企业正在进行葡萄糖异构酶研究和应用。
葡萄糖异构酶的研究主要包括菌种的筛选、发酵条件的优化以及酶的固定化生产等方面。
关键字：葡萄糖异构酶菌种分离纯化固定化一、葡萄糖异构酶简介葡萄糖异构酶(Gl)又称D-木糖异构酶（D-xylose isomerase），为一种水溶性酶。
1957年在嗜水假单胞菌中最早发现了GI，它能催化D一葡萄糖至D一果糖的异构化反应，特别是在果葡糖浆的生产中，是工业上大规模从淀粉制备高果糖浆(high fructose cord syrup，HFCS)的关键酶，并且该酶还能够将木聚糖异构化为木酮糖，再经微生物发酵后生产乙醇。
应用这种酶可以使葡萄长期以来糖浆中90%以上的糖分转化为果精，使甜度大大提高，因而可用淀粉作原料生产出食用性良好的葡果糖浆。
为了解决食糖供应不足，六十年代末期以来，葡萄糖异构酶的生产与应用的研究引起了人们的重视。
二、产葡萄糖异构酶的微生物产葡萄糖异构酶的菌株很多，主要有沙门氏菌、大肠杆菌、枯草杆菌属、葡萄球菌属、链霉菌属及其他菌属。
大多数是从土壤中分离出来的。
放线菌具有葡萄糖异构酶产量多，酶的热稳定性好等优点，并且在酶反应时不需要添加砷酸盐或锰盐等有毒物质。
分离异构酶产生菌，一般采用木糖作唯一碳源，如吉村贞彦等使用D—木糖1%、酵母膏0.1 %、磷酸氮二钾0.05 %、硫酸镁0.025 %、硫酸锰0.001 %和碳酸钙0.2 %组成培养基，在含有10毫升上述培养基的试管中，接入土样。
45℃培养24小时，连续富集培养三次，然后于加入2 %琼脂的上述培养中，进行平板分离，移入斜面，再进行摇瓶发酵，测定葡萄糖异构酶活力。
除土壤分离新菌种外，另外对原有菌种进行强烈因子处理。
如Bengtson用亚硝基胍或紫外线诱变Streptomyces ATCC 21175能显著提高酶活，经处理的菌种酶活力为518单位/毫升，而不处理的仅有3 18单位/毫升。
发酵设计链霉菌生产维生素B12
1 绪论维生素B 12是一种水溶性维生素。
只需少量即能产生效果， 为深红色结晶或结晶粉末又称为红色维生素（red vitamin ）或氰钴胺。
维生素 B 12具有广泛的生理作用，它参与体内甲基转换及叶酸代谢，促进神经髓鞘中脂蛋白的形成，保持中枢神经和外周髓鞘神经纤维的功能完整，参与广泛的蛋白质及脂肪代谢等。
其计量单位为微克（mcg ——microgram ，即1/1000000克）。
现在维生素B 12 的发酵常用菌种为放线菌中的链霉菌。
1.1 链霉菌的简介链霉菌 -链霉菌属（streptomyces)，其基内菌丝多分枝，一般横隔稀疏，很少断裂，常产生各种水溶性或脂溶性的色素；气生菌丝比基内菌丝稍粗，为外鞘所包，气生菌丝部分分化成直形、柔曲、钩环状至松敞或紧密螺旋形的孢子丝，时常含50个左右的孢子，短者含5～10个孢子。
本属菌种数最多，分类鉴定比较困难，一般认为孢子丝的形状、孢子的表面结构、孢子的颜色和在有机培养基内是否产生类黑色素是最主要的分类指征。
它们在土壤中分布极广，大多在人工培养基上生长茂盛，少数是植物致病菌。
因许多种是抗生素的产生菌而且产生抗生素的种类最多而著名（如链霉素）。
在维生素B 12发酵中，我们采用国内比较常用的灰色链霉菌及其变种。
灰色链霉素的孢子柄直而短，不呈螺旋。
孢子量多，呈椭圆球形。
气生菌丝和孢子都呈白色，单菌落生长丰满，呈梅花形或馒头形，直径3-4mm 。
基质菌丝透明，在斜面背后产生淡棕色色素。
菌种采用沙土管或冷冻干燥保藏。
1.2 维生素B 12结构与性质维生素B 12（VB 12）为钴胺素（Cobalamin ）类化合物，它的分子中有4个还原性吡咯环联结在一起，这种构叫做咕啉，它与核苷酸（二甲基苯异咪唑）及核糖相联，另一方面与D-1-氨基-2-丙醇相连，钴与核苷酸之N相偶联。
化学上称氰钴胺素为维生素B12，除CN后称钴胺至少。
CN可为其他基团代替，成为不同类型的钴胺素。
链霉素发酵实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 掌握链霉素发酵的基本原理和操作步骤。
2. 了解发酵过程中关键参数的调控对发酵效果的影响。
3. 通过实验，优化链霉素发酵培养基配方，提高发酵效率。
二、实验原理链霉素是一种重要的氨基糖苷类抗生素，由灰色链霉菌发酵生产。
发酵过程中，灰色链霉菌将葡萄糖等碳源转化为链霉素，同时产生一定的热量和二氧化碳。
发酵过程中，温度、pH值、通气量等参数对发酵效果有显著影响。
三、实验材料1. 菌种：灰色链霉菌2. 培养基：黄豆饼粉培养基、葡萄糖、硫酸铵、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠等3. 仪器：锥形瓶、移液管、pH计、生物传感仪、分析天平、发酵罐等四、实验步骤1. 菌种活化：将灰色链霉菌接种于黄豆饼粉培养基中，37℃恒温培养24小时，活化菌种。
2. 培养基配制：按照实验设计，将黄豆饼粉、葡萄糖、硫酸铵、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠等原料称量，加入适量水，搅拌均匀，制成发酵培养基。
3. 发酵：将活化后的菌种接种于发酵培养基中，置于发酵罐中，控制温度、pH值、通气量等参数，进行发酵实验。
4. 发酵过程监测：定时取样，测定发酵液中的链霉素浓度、pH值、残糖等指标，分析发酵过程的变化。
5. 发酵终止：当发酵液中的链霉素浓度达到预定目标时，终止发酵，收集发酵液。
6. 发酵产物提取：采用适宜的提取方法，从发酵液中提取链霉素。
五、实验结果与分析1. 发酵过程中关键参数的调控：（1）温度：发酵过程中，链霉素产量随温度升高而增加，但过高温度会导致菌体死亡，降低发酵效果。
实验结果表明，发酵温度以28-30℃为宜。
（2）pH值：发酵过程中，pH值对链霉素产量有显著影响。
实验结果表明，pH值以6.5-7.0为宜。
（3）通气量：发酵过程中，通气量对链霉素产量有显著影响。
实验结果表明，通气量以0.5-1.0L/h为宜。
2. 发酵培养基配方优化：通过正交实验，优化发酵培养基配方，结果表明，最佳培养基配方为：黄豆饼粉2.0%、葡萄糖2.0%、硫酸铵1.0%、磷酸二氢钠0.5%、磷酸氢二钠0.5%。
葡萄糖异构酶
葡萄糖异构酶研究概况摘要：葡萄糖异构酶(glucose isomerase，GI)能催化D—葡萄糖至D—果糖的异构化反应，是工业上大规模从淀粉制备高果糖浆的关键酶，目前国内外众多科研机构和企业正在进行葡萄糖异构酶研究和应用。
葡萄糖异构酶的研究主要包括菌种的筛选、发酵条件的优化以及酶的固定化生产等方面。
关键字：葡萄糖异构酶菌种分离纯化固定化一、葡萄糖异构酶简介葡萄糖异构酶(Gl)又称D-木糖异构酶（D-xylose isomerase），为一种水溶性酶。
1957年在嗜水假单胞菌中最早发现了GI，它能催化D一葡萄糖至D一果糖的异构化反应，特别是在果葡糖浆的生产中，是工业上大规模从淀粉制备高果糖浆(high fructose cord syrup，HFCS)的关键酶，并且该酶还能够将木聚糖异构化为木酮糖，再经微生物发酵后生产乙醇。
应用这种酶可以使葡萄长期以来糖浆中90%以上的糖分转化为果精，使甜度大大提高，因而可用淀粉作原料生产出食用性良好的葡果糖浆。
为了解决食糖供应不足，六十年代末期以来，葡萄糖异构酶的生产与应用的研究引起了人们的重视。
二、产葡萄糖异构酶的微生物产葡萄糖异构酶的菌株很多，主要有沙门氏菌、大肠杆菌、枯草杆菌属、葡萄球菌属、链霉菌属及其他菌属。
大多数是从土壤中分离出来的。
放线菌具有葡萄糖异构酶产量多，酶的热稳定性好等优点，并且在酶反应时不需要添加砷酸盐或锰盐等有毒物质。
分离异构酶产生菌，一般采用木糖作唯一碳源，如吉村贞彦等使用D—木糖1%、酵母膏 %、磷酸氮二钾 %、硫酸镁 %、硫酸锰 %和碳酸钙 %组成培养基，在含有10毫升上述培养基的试管中，接入土样。
45℃培养24小时，连续富集培养三次，然后于加入2 %琼脂的上述培养中，进行平板分离，移入斜面，再进行摇瓶发酵，测定葡萄糖异构酶活力。
除土壤分离新菌种外，另外对原有菌种进行强烈因子处理。
如Bengtson用亚硝基胍或紫外线诱变Streptomyces ATCC 21175能显著提高酶活，经处理的菌种酶活力为518单位/毫升，而不处理的仅有3 18单位/毫升。
葡萄糖异构酶PPT课件
行转化反应，从而大大加速反应速度，使重组葡萄糖异构酶生产的
果糖浆产量高，质量好，味道鲜美。
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回了 10
五、酶的筛选
酶的提取是指在一定条件下，用适当的溶剂 处理细胞破碎后的含酶原料，使酶充分地溶 解到提取液中的过程。酶的提取方法有盐溶 液提取法、碱溶液提取法和有机溶剂提取法 等。为了提高酶的提取率和防止酶提取后变 性失活，提取过程中必须注意保持适宜的温 度和pH，并且添加适量的保护剂。提取液 中含有多种酶，要想从提取液中分离纯化出 某一种酶，必须根据这种酶的特性，选择适 合的分离纯化方法。
A、热稳定性
B、底物专一性
C、 金属离子的影响
亲爱的~想我了 吗？嘿嘿~~
D、最适pH和温度
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7
四、国内外的研究情况
目前国内许多科研机构和企业正在进行葡萄糖异构酶研究 和应用。在与基础理论研究中有关的基因改造、酶学性质，以 及在遗传育种过程中突变型筛选，都需要一个准确、快速、具 有较高重复性的测定葡萄糖异构国对a—淀粉酶、葡萄糖淀汾酶和葡萄糖异构酶的研究取得了可喜
的成就。但由于一些因素的影响，我国果葡糖浆的工业尚未形成一
定规模，其主要问题是：
1、 果葡糖生产技术，尤其是酶制剂未完全过。
2、 原料价格过高影响生产成本。
3、 果葡糖浆价格高。
在果葡糖生产的系列酶中，葡萄糖异构酶是关键，这不仅是因
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1
第 七 节
葡
萄
糖
异 构
小组成员：周杰 张芬
酶
周伊玲 陈艳梅
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2
本
参考文献
节
影响
课
酶活的因素
概念和用途
的
框
架
酶活的测定
二、通用名称、功能分类,用量和使用范围
二、通用名称、功能分类，用量和使用范围本文叙述的葡糖异构酶（Glucose Isomerase，简称GI）制剂是通过重组锈棕色链霉菌生产菌株（Streptomyces rubiginosus）发酵生产的，该重组锈棕色链霉菌携带有多拷贝来自锈棕色链霉菌自身的葡糖异构酶编码基因GI。
通用名称：葡糖异构酶Glucose Isomerase功能分类：加工助剂食品工业用酶制剂使用范围：由玉米等淀粉原料工业生产高果糖糖浆用量：按生产需要适量使用来源（生产菌）：锈棕色链霉菌Streptomyces rubiginosus供体：锈棕色链霉菌Streptomyces rubiginosus系统名称：D-木糖醛糖-酮糖异构酶D-xylose aldose-ketose-isomerase其他使用名称：葡糖异构酶Glucose Isomerase；木糖异构酶Xylose Isomerase；D-木糖酮异构酶D-xylose ketoisomerase；D-木糖酮醇异构酶D-xylose ketol-isomeraseCAS号: 9055-00-9EC号: 5.3.1.5商品名称:三、证明技术上确有必要和使用效果的资料或者文件3.1 锈棕色链霉菌来源的葡糖异构酶的功能类别及作用机理3.1.1 功能类别葡糖异构酶作为食品工业加工助剂，一般采用固定化的形式，用于工业化生产高果糖玉米糖浆（HFCS，High Fructose Corn Syrup），将由玉米淀粉酶解而来的葡萄糖异构化生成甜度更高的果糖。
葡糖异构酶在高果糖玉米糖浆的生产应用如下图所示。
在食品工业生产食用糖浆的工艺中，由玉米等谷物来源的淀粉经液化、糖化、除杂等步骤加工处理生成葡萄糖糖浆，成分主要为葡萄糖，还有少量低聚糖，如麦芽糖、异麦芽糖、潘糖等。
将该葡萄糖浆以一定的流速通过填充有固定化葡糖异构酶的填充柱，使部分葡萄糖异构化为果糖，则产品为高果糖糖浆。
高果糖玉米糖浆是一种葡萄糖和果糖的1：1等量混合糖浆，是蔗糖的甜度的1.3倍，被用作糖尿病人使用的甜味剂。
白色链霉菌发酵生产ε—聚赖氨酸工艺的优化
白色链霉菌发酵生产ε—聚赖氨酸工艺的优化摘要：采用白色链霉菌N31-69菌株发酵制备ε-聚赖氨酸，考察碳源、氮源等因素对ε-聚赖氨酸产量的影响，优化发酵培养基。
结果表明，优化的培养基为葡萄糖、（NH4）2SO4和酵母浸出粉的浓度分别为30、7、7 g/L，ε-聚赖氨酸摇瓶发酵产量达1.519 g/L，比优化前的产量提高了28.0%。
进一步对N31-69菌株在5 L 发酵罐内的发酵工艺进行优化，发现发酵48 h后采用流加补糖方式控制还原糖浓度为10～15 g/L，从72 h开始控制pH为4.3，发酵168 h后ε-聚赖氨酸的产量可达15.60 g/L。
关键词：白色链霉菌（Streptomyces albus）；ε-聚赖氨酸；培养基；发酵工艺ε-聚赖氨酸由25～30个赖氨酸残基聚合而成，有很强的抑菌能力[1]，被FDA 批准为安全的天然生物防腐剂，具有巨大的商业潜力[2]。
日本窒素公司已实现ε-聚赖氨酸微生物发酵的工业化生产，发酵罐产量达48.30 g/L[3，4]。
而国内ε-聚赖氨酸的研究还处于实验室水平，发酵产量与国外差距很大。
刘长江等[5]优化了发酵培养基和培养条件，ε-聚赖氨酸摇瓶产量为1.50 g/L；陈玮玮等[6]对北里孢菌Kitasatospora MY5-36发酵产ε-聚赖氨酸的条件进行优化，摇瓶发酵产量达1.17 g/L，在5 L发酵罐内批式发酵产量达7.72 g/L；黄国昌等[7]在50 L自控式发酵罐中对ε-聚赖氨酸的发酵条件进行研究，发酵产量最高达7.36 g/L。
本研究采用白色链霉菌（Streptomyces albus）N31-16菌株发酵制备ε-聚赖氨酸，考察碳源、氮源、无机盐等因素对发酵的影响，以提高ε-聚赖氨酸产量，为促进ε-聚赖氨酸的工业化生产提供依据。
1 材料与方法1.1 菌种来源白色链霉菌N31-16菌株，赣南医学院微生物实验室筛选保藏[8]。
1.2 白色链霉菌发酵生产ε-聚赖氨酸流程1.2.1 斜面培养斜面培养基包括酵母浸出粉4 g/L、麦芽浸出粉10 g/L、葡萄糖 4 g/L，pH 7.3。
酶制剂的生产及在食品工业中的应用
酶制剂的生产及在食品工业中的应用谢玉锋生物工程学院学号：12909002摘要：酶制剂由于其高效专一性的特点应用越来越广泛，微生物酶制剂的发酵生产也越来越引起了人们的关注。
本文主要从酶制剂的发酵、纯化、稳定性进行了分析，并且对微生物酶制剂在食品工业生产中的主要应用做了论述。
关键词：酶制剂；发酵；纯化；应用酶是一种生物催化剂，催化效率高、反应条件温和和专一性强等特点，已经日益受到人们的重视，应用也越来越广泛。
生物界中已发现有多种生物酶，在生产中广泛应用的仅有淀粉酶、蛋白酶、果胶酶、脂肪酶、纤维素酶、葡萄糖异构酶、葡萄糖氧化酶等十几种。
利用微生物生产生物酶制剂要比从植物瓜果、种子、动物组织中获得更容易。
因为动、植物来源有限，且受季节、气候和地域的限制，而微生物不仅不受这些因素的影响，而且种类繁多、生长速度快、加工提纯容易、加工成本相对比较低，充分显示了微生物生产酶制剂的优越性。
现在除少数几种酶仍从动、植物中提取外，绝大部分是用微生物来生产的。
1 主要酶制剂及产酶微生物酶制剂可以由细菌、酵母菌、霉菌、放线菌等微生物生产。
微生物产生的各种酶以及它们在食品工业中的应用见下表微生物酶制剂及其在食品工业中的应用酶用途来源淀粉酶普鲁兰酶蛋白酶脂肪酶纤维素酶果胶酶葡萄糖氧化酶乳糖酶凝乳酶水解淀粉制造葡萄糖、麦芽糖、糊精水解淀粉成直链低聚糖软化肌肉纤维、啤酒果酒澄清、动植物蛋白质水解营养液用于制作干酪和奶油，大米、大豆、淀粉制造用于大米、大豆、玉米脱皮，提高果汁澄清度等用于柑桔脱囊衣，饮料、果酒澄清、防止食品褐变制造转化糖，防止高浓度糖浆中蔗糖析出，防止糖乳糖酶缺乏的乳品制造，防止乳制品中乳糖析出细菌、霉菌细菌、霉菌细菌、霉菌酵母、霉菌霉菌霉菌霉菌、细菌霉菌霉菌1.1微生物酶制剂生产1.1.1菌种选择任何生物都能在一定的条件下合成某些酶。
但并不是所有的细胞都能用于酶的发酵生产。
一般说来，能用于酶发酵生产的细胞必须具备如下几个条件：酶的产量高。
链霉素发酵提取工艺
灰色链霉菌的孢子柄直而短，不呈螺旋形。
孢子量很多，呈椭圆球形。气生菌丝和孢子都呈 白色。单菌落生长丰满，呈梅花形或馒头形，直 径约为3～4mm。基内菌丝透明，在斜面背后产 生淡棕色色素。
链霉素产生菌诱变育种常用的诱变剂有：紫外 线、7射线、氮芥、乙烯亚胺、亚硝酸和硫酸二乙 酯等。一些化学诱变剂又经常和紫外线等进行复 合处理。近年来采用亚硝基胍、快中子和激光等， 诱变选育出营养缺陷型或再回复突变型高产菌株。 杂交育种与诱变育种相结合的方法，对提高菌种 的生产能力，收到了较好的效果。
(四)发酵培养
链霉素的发酵培养基主要由葡萄糖、黄 豆饼粉、硫酸铵、玉米浆、磷酸盐和碳酸 钙等所组成。
(1)碳源及其代谢
葡萄糖是链霉素发酵的一种较好的碳源，用其 他碳源(如淀粉、糊精、麦芽糖等)发酵单位都比葡 萄糖低。葡萄糖的用量，视补料量的多少而定，总 量一般在10%以上，以保证在发酵过程中有足够的 碳源.
(3)其他无机离子
在复合培养基中已经存在，一般就不需再添 加。为了调节pH，中和代谢过程中所产生的有机 酸，尚需加人CaCO3。Co+是一种酶的激活剂， 又量是，K生+物有合促成进维生生长素的B作12用的，前N体a+，与通维常持需细加胞入渗极透微 压有关，通常加入0.25％左右量的NaCl即可，增 加用量会明显影响菌的生长繁殖。Mn2+、Mg2+ 对链霉菌菌丝生长有明显作用。Fe2+浓度超过 60ug／mg以上，就要产生毒性，显著影响链霉素 的产量，而对菌丝体生长影响较小，一般适用量 在20ug／ul左右。
(二)摇瓶种子培养
生产斜面的菌落接种到摇瓶培养基中，经过培 养即得摇瓶种子。链霉素发酵经常使用：瓶种 子来接种种子罐。种子质量以菌丝阶段、发酵 单位、菌丝黏度或浓度、糖氮代谢、种子液色 泽和无杂菌检查为指标。摇瓶种子(母瓶)可以 直接接种子罐，也可以再扩大培养，用培养所 得的子瓶接种。摇瓶种子检查合格后，贮存于 冷藏库内备用，冷藏时间最多不超过7天。
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高产菌株选育及GI的改造 高产菌株选育及 的改造
美国 ：嗜水假单胞杆菌、短乳杆菌、 戊糖乳酸菌 日本 ：暗色链霉菌 、白色链霉菌 中国 ：玫瑰暗黄链霉菌、玫瑰红链霉菌、 高温放线菌M1033、密苏里游动放线菌 • 目前普遍葡萄糖异构酶生产菌种酶活低、 胞外酶含量较高
• 通过定点突变对葡萄糖异构酶进行改造， 改善其热稳定性，如Mrabet构建的密苏 里游动放线菌GI突变酶体K253R的半衰 期增为野生型的3倍。而AM GI突变体 E186Q的最适pH比野生型下降一个单位， 且活性提高两倍。 • 通过改变GI底物专一性，提高其催化效 率，如嗜热产硫梭状芽孢杆菌GI的定点 突变体W139F的催化效率大大提高
异构化机理
• 高果糖浆是自60年代崛起的新食糖资源， 味道纯正，具有较强的保温性、着色性 和防腐性，营养价值较高，可不经消化 直接被肠胃吸收，果糖的代谢不受胰岛 素调节，糖尿病人可以利用，是饮料、 糕点等食品工业的理想用糖。
• 高果糖浆的工业制造在全世界范围内尤其是在 发达国家发展极快，现美国的高果糖浆消费量 已与蔗糖持平。果葡糖浆的应用领域主要是食 品工业，还有医药和饮食业，根据商业部对蔗 糖消费的预测和果葡糖浆在各行业中的代用量 推算， 目前我国果葡糖浆的潜在销售市场为 150万吨干基。从长远观点看，果葡糖浆将成 为我国一个新的主要糖源，它将从根本上解决 我国糖源短缺问题。
• 木糖异构化以及发酵的同步性
反应平衡时木酮糖与木糖的比率只有1：5，所以木糖的同步异构 及发酵更优先考虑异构化条件。木酮糖由酵母发酵为乙醇的同时， 也更易于木糖向木酮糖的转化平衡。适宜于木糖的同步异构以及 发酵的pH为5.5或6.0，乙醇是最终产物。木糖同步异构及发酵中 若得率不高可能与酶量不足及木糖、木酮糖、乙醇的抑制有关
异源表达
• 大肠杆菌是最常用的异源表达宿主菌。
以地衣芽孢杆菌染色体的EcoRⅠ片段克隆入pBR322， 再转化GI缺陷型E.coli菌株，得到含有GI基因的重组质 粒十分稳定，其酶活比野生型高20倍。 用穿梭质粒载体pSE-3将大肠杆菌葡萄糖异构酶基因在 变铅青链霉菌中表达，稳定性良好。重组质粒在大肠 杆菌和链霉菌中均能表达，但在链霉菌中酶活性略低 于在大肠杆菌中，同时穿梭质粒载体pSE-3的新霉素抗 性在大肠杆菌中比在链霉菌中高出约3倍，可能是与载 体本身在这两种受体菌中的表达强度有关
底物专一性
• GI除了D-葡萄糖和D-木糖以外还能以D核糖、L-阿拉伯糖、L-鼠李糖、D-阿洛 糖和脱氧葡萄糖以及葡萄糖C-3、C-5和 C-6的修饰衍生物为催化底物。但GI只能 催化D-葡萄糖或D-木糖α-旋光异构体的 转化，而不能利用β-旋光异构体作为催 化底物
金属离子的影响
• 二价金属离子对 的活力及稳定性影响 二价金属离子对GI的活力及稳定性影响 很大
葡萄糖异构酶的生物学性质
热稳定性 底物专一性 金属离子的影响 最适pH和最适温度 最适 和最适温度
• • • •
热稳定性
• 不同生物来源的葡萄糖异构酶热稳定性 不同
乳酸杆菌和埃希杆菌GI的热稳定性较差 GI 链霉菌和枯草芽孢杆菌GI在高温下相当稳定 嗜热高温菌GI的热稳定最高，可能是它对Val和Pro等 氨基酸的偏爱选择，使其具有更紧密的空间结构，而 这些氨基酸在其他GI中则被替代
同源表达 异源表达
• 高产菌株选育及 的改造 高产菌株选育及GI的改造
葡萄糖异构酶基因序列
• GI的序列同源性在相近种属中较高，不 同种属则较低。
大肠杆菌和枯草芽孢杆菌GI与链霉菌的同源性仅为 24.2%和26.3% 深灰色链霉菌与紫黑色链霉菌GI的同源性为86.6%，密 苏里游动放线菌和小瓶属菌株GI同源性达到93.4%
链霉菌中的D-木糖操纵子 链霉菌中的 木糖操纵子
• 链霉菌的D-木糖操纵子研究还不太多
在紫黑链霉菌中存在着一个调节蛋白（xylR）的阅读 框，xylA和xylB基因转录方向相同。但具体的调控机 制尚不清楚。 在锈赤链霉菌中，xylA和xylB基因相邻，但分开转录， 方向相反
• xyl基因的转录受木糖的诱导和葡萄糖的 阻遏
GI基因在链霉菌中的表达 基因在链霉菌中的表达
• 同源表达 • 异源表达
同源表达
• 在变铅青链霉菌中，同源克隆来自暗色 链霉菌的GI，结果GI活性大大提高。为 避免无选择压力下，由于质粒的不稳定 性而造成GI的表达不稳定，还可将链霉 菌启动子P1克隆到xylA的上游，再将P1xylA基因通过整合载体pTS55整合入染色 体。整合菌株CBS1在无糖条件下，GI活 性大约是需要木糖诱导的野生型GI的7倍
GI工业生产应用 工业生产应用
• 果葡糖在50年代后期由日本试制成功，70年代初期， 以淀粉为原料的果葡糖浆便应运而生，首先是美国进 入工业化生产，而后日本、西德、法国等国家先后投 入生产 • 到目前为止全世界有美国、加拿大等20多个国家和地 区生产果葡糖浆，并且随着生产技术和工艺的不断改 进，果葡糖的成本不断下降。 • 近年来，虽然蔗糖的价格下跌，但果葡糖浆工业已发 展壮大，其价格仍可低于蔗糖10%~15%。从生产上看， 果葡糖浆工业虽然只有20多年的历史，但发展速度相 当惊人。其中产量最大的首推美国，约占世界总产量 的72 %。
分离纯化以及工业化生产
• 分离提纯 • 固定化 • GI工业生产应用 工业生产应用
分离提纯
• 酶的提取是指在一定条件下，用适当的 溶剂处理细胞破碎后的含酶原料，使酶 充分的溶解到提取液中的过程。 • 酶的提取方法：盐溶液提取法、碱溶液 提取法和有机溶液提取法 • 提取液中含有多种酶，要想从提取液中 分离纯化出某一种酶，必须根据这种酶 的特性，选择合适的分离纯化方法
双层固定化异构酶的制备
• 靠静电相互作用将葡萄糖异构酶分子吸附到TMPS载体上，同时 载体表面电荷由正转为负，然后用去离子水洗涤。 • 取60L葡萄糖异构酶于1000L带搅拌的容器中，用去离子水稀释10 倍，搅拌均匀后，用Na2CO3 调pH7～8。将合成好的TMPS 200kg 用5%HCl浸泡30 min，用去离子水冲洗至中性，加入配好的稀释 酶液中，缓慢搅拌，控制pH 7～8，稳定2～3 h，将剩余酶液去除， 用去离子水洗涤。 • 将上述固定化单层葡萄糖异构酶浸入二碘化六亚甲基-双-三甲铵 溶液中，使葡萄糖异构酶表面又沉积一层双极性阳离子，同时其 表面电荷又由负转为正，再用去离子水洗涤。 • 将表面电荷为正电的单层葡萄糖异构酶再浸入异构酶溶液中，使 酶沉积到双极性阳离子层表面，去离子水洗涤以除去未吸附的酶 分子。 • 为防止已吸附的酶分子从载体上脱落，以0.3%戊二醛交联双层固 定酶(室温下交联2 h)，去离子水(10倍载体重量)洗涤除去游离的 戊二醛，即得双层固定化异构酶。
• 葡萄糖异构酶常用的分离纯化方法有分 子筛、DEAE-FF和透析
DEAE-FF是离子交换层析的一种，离子交换树脂为纤 维素类 透析在纯化中极为常用，透析膜的截留分子量为5000 左右，如分子量小于10000的酶液就有泄露的危险。在 纯化中可除去盐类、有机溶剂、低分子量的抑制剂等 不同菌源产生的葡萄糖异构酶纯化的条件不同。 从短杆菌得到的GI通过MnCl2处理，(NH4)2SO4分 级盐析，热处理以及用DEAE-葡聚糖凝胶柱层析而部 分纯化 凝结芽孢杆菌HN-80产生的葡萄糖异构酶经过 MnSO4处理，(NH4)2SO4分级盐析及DEAE-葡聚糖凝 胶柱过滤而被纯化
链霉菌葡萄糖异构酶的发酵 生产概况
王海燕 112000
综述框架
综述
前言
生物学性质
GI基因在链霉菌中的克隆表达 基因在链霉菌中的克隆表达
分离纯化以及工业化生产
热稳定性
葡萄糖异构酶基因序列
分离提纯
底物专一性
链霉菌中的D-木糖操纵子 链霉菌中的 木糖操纵子
固定化
金属离子的影响GI基因再链来自菌中的表达 基因再链霉菌中的表达
• 葡萄糖异构酶主要是胞内酶，可以直接 用其菌体进行反应。 • 提取胞内酶，首先要破碎细胞然后将含 有酶活性的部分用过滤或离心法去除残 留细胞和细胞碎片，从而得到澄清溶液。 再采用逐步逐级分离和浓缩等步骤将所 得的无细胞提取液纯化。 • 常用破碎处理方法：机械破碎法、物理 破碎法、化学破碎法和酶学破碎法。
固定化
• 提取和分离提纯的酶制成酶制剂
将葡萄糖异构酶的酶液进行干燥处理，加入适量的稳定剂和 填充剂，就可以用来催化化学反应。 酶制剂和产物是混合在一起的，产物的纯度不高，并且酶制剂 也不能重复利用
• 固定化葡萄糖异构酶
一直是酶工程领域中研究的最为活跃的课题，现已产生上百 种方法，但工业上实际应用的只有戊二醛交联法、载体吸附法、 包埋法以及细胞凝聚法等。 载体吸附法具有方法简单、酶活力回收高和载体可重复利用等 特点，因此应用的最为广泛
双层固定化
• 无论是载体吸附法还是目前采用的其他方法都 只能在载体表面固定化单层酶，固定化酶活力 会受载体表面积大小的限制。 • 分子沉积是利用阴阳离子相互吸引的原理，采 用有机两亲性阴阳离子或聚电解质在带电的基 片表面上交替沉积，制备有机分子的多层超薄 膜。 • 葡萄糖异构酶的等电点在pH5 左右。因此在中 性条件下，异构酶分子带负电荷，它可以代替 阴性聚电解质与双极性阳离子在载体上交替沉 积而把酶双层固定在载体内
• 我国对α—淀粉酶、葡萄糖异构酶的研究 取得了可喜的成就。但由于一些因素的 影响，我国果葡糖浆工业尚未形成一定 规模，其主要问题是：
果葡糖生产技术尤其是酶制剂未完全过关 原料价格过高迎香生产成本 果葡糖浆价格高
工业生产总结
• 增加果糖的含量
在高果糖浆的生产中，葡萄糖转化率约50%，而工业应用要求果 糖含量高于50%，提高反应温度及降低反应pH可增加果糖得率。 单一pH过程即指HFCS生产中的玉米淀粉、α-淀粉酶及脱支酶的 液化、糖化和异构化在同一pH下进行，约为4.5~5.0，因此酸、热 稳定的GI能减少高温下有色碳酰副产物的生成，提高HFCS生产 效益