重组质粒的构建

我的质粒构建总结-

重组质粒构建是常用的分子生物学手段，其实只是最基本的方法，一般一个星期同时构建三二个组质粒是没有问题的。在国内先进的实验中，也大都是由实验员搞定。所以其中其中还是有基本的技巧需要掌握。在这里决定将我的心得分享于大家，以期能提供借鉴，让大家在实验中少走弯路。

在本帖及之后继帖中将以一段PCR获得基因，以NdeI和HindIII位点克隆进入质粒为例来系统剖析重组质粒的构建中基本策略与技巧。这作的经验积累与心得。所涉及内容如下：

1) 克隆基因的酶切位点问题

2) 载体酶切的问题

3) 连接片段浓度比的问题

以上阐明上述问题同时，本人尽可能引入实验时会各种出现的问题予以说明。

一、克隆基因的酶切位点问题

1 对目标基因进行酶切位点扫描分析，列出其所含酶切位点清单。对照质粒多克隆位点，所选择的克隆位点必须是目标基因所不含的酶切位点。这是常识不赘述。这里对NdeI和HindIII 为例。

2 设计PCR引物时的保护碱基数目。这可能是初涉入未引起注意与重视问题。NdeI需加入6个以上的保护碱基，而HindIII则要三个就可以。

一般情况下，普通的内切酶只加入两个保护碱基，其内切反应就可以正常进行；而有一类，只加入两个保护碱基，其内切反应就不能正常进行，这是因为内切酶不能正常结合DNA 片段上。如NdeI就属这类。

下面是我提供这类酶的列表及其所需最少的保护碱基数：

NcoI 4

NdeI 6

NheI 3

NotI 8

PmeI 6

SacI 3

SalI 3

SmaI 3

HindIII 3

BstI 8

SphI 4

XhoI 3

XbaI 3

SmaI 4

案例分析：本人最初用NdeI酶，未注意到该问题，只与普通酶一样引入两个保护碱基，一个月内没有进展。后查文献得知症结所在，加下六个后，迎刃而解。大家引以为戒啊。

现在普通酶我都引入三个保护碱基，现在合成价格不贵，为保证酶切充分，连接顺利，不用

节约那点钱，再说若一次不成功，重要实验花费时间与金钱更多，孰利孰弊，不言自明。呵呵。

二、载体酶切的问题

1单切鉴定。这个问题实是简单，但我认为很有着重强调之必要。现在大家手头的质粒都是转来转去的，其中的各酶切位点状况如何，是否能被有效地切开，在实验开始之前对质粒载体很有作单切鉴定之必要。现在我每次构建之前，对所要用的酶切位点都作一一鉴定，比如要用到NdeI和HindIII，我就先对质粒该两个酶进行鉴定。有效地切开后，再将引物发出合成；若不能，就按“一”中原则进行调换。

2 质粒双切后对照连接。实验中这是连接步骤，但实质还是质粒酶切问题。一般情况下，都在通用缓冲液中进行双酶切，但两种酶在通用缓冲液中中酶切效率不一样，可能导致部分只是单切缺口的质粒片段存在，这样，连接的对照实验在不加入外源片段时，质粒就会自连，长出菌斑，这种情况下，质粒酶切片段是不可能用于下一步真正连接实验。

案例分析：本人曾用XhoI和HindIII酶切位点构建重组质粒，对质粒进行双酶切后，直接就做连接，未上述两步鉴定，每次结果满板的菌斑。但就是没有阳性。后来对质粒进行单酶要鉴定后，发现XhoI酶切位点损坏。又是一个月没有进展，浪费精力和药品。血的教训啊。因为当时没有注意到：单切质粒是一条带，双切质粒也是一条带，电泳行为上是一样的，分辨不出。如果做上述任何一个鉴定就会知道问题出在那儿，呵呵。

案例分析：本实验室一个号称实验严谨的大博士，有KpnI和HindIII构建重组质粒，一个月未果，只得阴性斑，不得阳性斑，后怀疑KpnI酶失效。迁怒KpnI,在我不知情下扔掉实验室所满管KpnI酶。我得知后，问他做过上述两鉴定实验后，他支吾着说没有，反而责备本人不早说出问题原因所在。呵呵，他不自责自己只是闷头做实验，不早问，反倒咬一口解铃人。呵呵，你说冤不冤？版主你的类似的冤可能更多吧，辛苦了!

两星期前写了前两问题后，终于能抽时间写第三个问题，在做好前述两个方面工作后，这个问题相对简单。

三、连接时两片段浓度比问题

一般实验指导手册上都说质粒：片段＝1：3（摩尔比），在实际操作中我以为在1：5甚至1：10为宜。做好“一、二”，16℃10小时后，每次都能有效地连接上。当然还有感觉态问题，我们以前自己做，现在懒得做了，都用“天为时代公司”的产品，还不错（注明我不是天为公司内线，呵呵）。

这里介绍一个估测处DNA浓度的方法：DNA可以用紫外法检测，也可以电泳对比marker 估测，在要求不是很精确情况下，大家不妨试试下面方法：

1．取一平皿。

2．薄薄倒一层含有EB的琼脂糖胶，凝固(4 ℃可以存一个星期)。

3．平皿背面可以画成小方格。

4．一小格中点1 ul样品。

5．另一小格格点1 ul DNA标准品(我一般用Takara 2000 DNA lander，1 ul相当60 ng) 6．凉干后，紫外灯下根据亮度就可以估测了。

OK，我连接时这么估测浓度，5分钟就要可以知道两片段浓度。其实连接片段浓度比可以充许在一个范围内，1：5至1：10都可以，所以上述估测方法在这种情况下是行得能的。

2008-05-01

几个月的光阴。几乎都耗在这上了。也总结出些门道。

最终转化的成功。取决于以下几方面：

1.PCR。

PCR条带特异性很重要。哪怕是亮度低，只要能与其他条带分开，可以确定是目的条带就可。SMEAR会影响转化的成功率。

引物的设计需要考虑的主要是酶切位点，保护碱基，长度。当然特异性和DIMER不能忽视。但前者更为重要。

在这需要注意引物的合成是有一定出错率的。全世界现在用的技术都如此，出错率理论上各家都一样。据说是千分之七。不过我不知道是指一条引物还是一个碱基。就我而言，应该是一个碱基的出错率。

2.酶切。酶切的处理方法有两种：抽提、回收。当然还可以直接加热灭活然后连接，没试过。抽提的时候，酚仿醇容易降低连接效率，我采用的是用20lymda的移液器+白枪头。宁可取少一点，也不要沾上它。BOSS是个技术超群之人。35的体系可以轻易取到34.

回收的话，比较废材料。一般抽提能做4-5次的材料，回收一次就用了。而且相对麻烦。不过好处是可以定量（连接的时候应片段比质粒数量=10：1），而且看得见，踏实，方便失败分析。（我发现引物错误就是酶切跑胶发现错误的带。）

要特别注意的是保护碱基的设置。保护碱基根据不同酶有不同要求。我用的XhoI，保护碱基需要3个以上。我一开始设少了，结果很难连上。文献说2个保护碱基，20h NEB的XhoI 只能切去25%。我采取的措施1.是超长时间酶切，适当增加酶量。效果还可以。 2.构建T 载体，但T载体一般用TAQ来PCR，容易出突变，且耗时长。

3.连接。说明书虽然说10分钟就能连好。但是事实上不是的。据说16度过夜连接是最好的。

4.转化。很骄傲于我们实验室的10分钟转化大法。当然我构建质粒时不敢用。

当连接体系加入到感受态细胞时，若体系过大，应补充CaCl2到30mM。

5.验证。抽提一般长出来十多个属于正常（就我们的感受态），太多则应怀疑是载体未被切开。

验证手段有以下三种：

1.菌落PCR。挑取单菌落，点于另一标记平板上，再把枪头于含适量水EP管中。将EP管煮沸10分钟，作模板PCR。得到与对照相异的相应片段。

2.提质粒。通常在菌落PCR得到阳性结果后进行。然而菌落本来少的时候。直接提质粒可能省事。质粒可以直接与空载体一起跑胶，比较大小以确定片段是否插入。

3.蛋白小量表达。预测蛋白大小=将目的片段（到终止子）/3*106/1000+标签大小。通过转化质粒到表达菌中，小量表达，SDS-PAGE电泳。可以比较蛋白与预期蛋白SIZE。

4.（我不识数）。。。测序。

如果你一切做得很好的话，阳性结果应该接近100%。