CEBPβ在脂肪细胞分化过程中的调节

博士学位论文引言

Ｆｉｇ．１．ＣｈａｎｇｅｓｉｎｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎｓｔａｔｅａｎｄＤＮＡｂｉｎｄｉｎｇａｃｔｉｖｉｔｙｏｆＣ／ＥＢＰＢｅａｒｌｙｉｎｔｈｅａｄｉｐｏｃｙｔｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｐｒｏｇｒａｍ．

Ｔｗｏ—ｄａｙｐｏｓｔ—ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ３Ｔ３－ＬＩｐｒｅａｄｉｐｏｃｙｔｅｓｗｅｒｅｉｎｄｕｃｅｄｔｏｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅ，ｎｕｃｌｅａｒｅｘｔｒａｃｔｓｐｒｅｐａｒｅｄａｔ４，１６ａｎｄ２４ｈａｆｔｅｒｉｎｄｕｃｔｉｏｎ（ｔｒｅａｔｅｄｗｉｔｈｏｒｎｏｔｗｉｔｈａｌｋａｌｉｎｅｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）ａｎｄｔｈｅｎｓｕｂｊｅｃｔｅｄｔｏ２－Ｄｇｅｌ．丸２－Ｄｇｅｌａｎａｌｙｓｉｓａｎｄｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔｔｉｎｇｗｉｔｈａｎｔｉ－Ｃ－ｔｅｒｍｉｎａｌＣ／ＥＢＰ９ａｎｔｉｂｏｄｙ．Ｂ．ＥＭＳＡｔｏａｓｓｅｓｓＤＮＡｂｉｎｄｉｎｇａｃｔｉｖｉｔｙｕｓｉｎｇａｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｐｒｏｂｅｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇｔｏｔｈｅＣ／ＥＢＰｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｅｌｅｍｅｎｔｉｎｔｈｅｐｒｏｘｉｍａｌｐｒｏｍｏｔｅｒｏｆｔｈｅＣ／ＥＢＰｏｇｅｎｅ．

Ｃ／ＥＢＰＪ３Ｔｈｒｌ８８位为已知的ＭＡＰＫ磷酸化位点［２０－２３］。用诱导剂诱导后２小时内Ｃ／ＥＢＰｐ的表达迅速增加，ＭＡＰＫ对Ｃ／ＥＢＰｐ／ＬＡＰＴｈｒｌ８８的磷酸化，也在诱导后４小时内迅速发生，但是此时Ｃ／ＥＢＰｐ并没有ＤＮＡ结合活性，因此不能激活Ｃ／ＥＢＰｄ和ＰＰＡＲｙ基因表达［７］，直到诱导后１４小时Ｃ／ＥＢＰｐ才开始获得ＤＮＡ结合活性。Ｃ／ＥＢＰｐ的Ｓｅｒｌ８４和Ｔｈｒｌ７９位点是两个新的磷酸化位点。这两个磷酸化位点可能为ＧＳＫ３Ｂ磷酸化位点。ＧＳＫ３Ｂ磷酸化位点的特征：在其Ｃ末端４个氨基酸左右的氨基酸残基首先发生磷酸化后，ＧＳＫ３Ｂ才能发挥作用。在Ｃ／ＥＢＰＢＳｅｒｌ８４和Ｔｈｒｌ７９位点Ｃ末端４个氨基酸左右的氨基酸残基为ＭＡＰＫ磷酸化位点Ｔｈｒｌ８８，如前所述，在诱导后４小时内ＭＡＰＫ已经使Ｃ／ＥＢＰ８／ＬＡＰＴｈｒｌ８８发生磷酸化，因此Ｃ／ＥＢＰＢ／ＬＡＰＴｈｒｌ８８的磷酸化可能是Ｃ／ＥＢＰＢＳｅｒｌ８４和Ｔｈｒｌ７９位点磷酸化的基础。那么Ｃ／ＥＢＰｐＳｅｒｌ８４和Ｔｈｒｌ７９位点能否被ＧＳＫ３Ｂ磷酸化？Ｃ／ＥＢＰＢＳｅｒｌ８４和Ｔｈｒｌ７９位点的磷酸化是否依赖于ＭＡＰＫ对Ｃ／ＥＢＰｐ／ＬＡＰＴｈｒｌ８８的磷酸化？Ｃ／ＥＢＰＢ的顺序磷酸化（首先ＭＡＰＫ磷酸化Ｔｈｒｌ８８，然后ＧＳＫ３Ｂ磷酸化Ｓｅｒｌ８４和Ｔｈｒｌ７９位点）或Ｃ／ＥＢＰＢ的高磷酸化状态对Ｃ／ＥＢＰＢ的ＤＮＡ结合活性和转录激活功能有何影响？本文也将对此提供更多功能方面的研究。

Ｆｉｇ．２ＴｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆａＩｏＰ一１０ｄｕｒｉｎｇｔｈｅｅａｒｌｙｓｔａｇｅｏｆ３Ｔ３－ＬＩａｄｉｐｏｃｙｔｅｓｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｉｎｄｕｃｅｄｂｙｓｔａｎｄａｒｄｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｐｒｏｔｏｃ０１．

Ｗｈｏｌｅｃｅｌｌｐｒｏｔｅｉｎｅｘｔｒａｃｔｓｗｅｒｅｐｒｅｐａｒｅｄａｔｄｅｓｉｇｎａｔｅｄｔｉｍｅｐｏｉｎｔｂｅｆｏｒｅ（Ｏｈ）ｏｒ

ｉｎａｕｎｏｂｌｏｔｔｅｄａｆｔｅｒｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｉｎｄｕｃｔｉｏｎａｎｄｗｅｒｅｓｅｐａｒａｔｅｄｂｙＳＤＳ—ＰＡＧＥａｎｄ

ｗｉｔｈｍｏｕｓｅａｎｔｉ．ｃＨＯＰ一内ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｈｒｓ，ｈｏｕｒｓａｆｔｅｒｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｉｎｄｕｃｔｉｏｎ．２．２不同诱导剂对ＣＨＯＰ－ＩＯ表达的影响

我们检测了不同诱导剂单独（Ｍ，Ｄ，Ｉ）及不同组合（ＭＤ，ＭＩ，ＩＤ，岫Ｉ）对ＣＨＯＰ－ＩＯ表达的影响，并用只含有１０％胎牛血清的ＤＭＥＭ作为对照。结果表明，与ｄａｙＯ天相比较，１０％胎牛血清本身就足以使ＣＨＯＰ－ＩＯ表达下调，１０％胎牛血清与其他不同诱导剂的组合，并没有明显改变这种下调作用。因此在脂肪细胞分化早期ＣＨＯＰ－ＩＯ的表达下调，是由于１０％胎牛血清所引起的。而作为对照的１０％ｔＪ，牛血清使ＣＨＯＰ－ＩＯ维持在很高水平（Ｆｉｇ．３）。

Ｆｉｇ．３ＴｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉｎｄｕｃｅｒｓａｌｏｎｅｏｒｉｎｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｏｎｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＣＨＯＰ－ＩＯ．

２－ｄａｙｐｏｓｔｃｏｎｆｌｕｅｎｔ３Ｔ３一Ｌ１ｐｒｅａｄｉｐｏｃｙｔｅｓｗｅｒｅｔｒｅａｔｅｄｗｉｔｈｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉｎｄｕｃｅｒｓａｌｏｎｅｏｒｉｎｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｉｎＩＯ％ＦＢＳｏｒ１０％ＣＳ，ａｎｄｗｈｏｌｅｃｅｌｌｅｘｔｒａｃｔｓｗｅｒｅｐｒｅｐａｒｅｄ２４ｈｏｕｒｓｌａｔｅｒ．

２．３不同诱导分化方案中ＣＨＯＰ－ＩＯ表达及对脂肪细胞分化的影响

本组实验采用两种分化方案：标准的诱导分化方案和将标准诱导分化方案中的１０％胎牛血清用１０％的小牛血清所代替，以观察不同诱导分化方案中脂肪细胞分化情况。结果显示，只要有ＭＤＩ存在，无论是在１０％胎牛血清还是１０％小牛血

博士学位论文第一部分ＣＨＯＰ－ＩＯ在脂肪细胞分化过程中的表达调节

清培液中，Ｃ／ＥＢＰＢ的表达没受任何影响（Ｆｉｇ．４）。在修改的含有１０％小牛血清诱导分化方案中ＣＨＯＰ－ＩＯ持续高水平表达，直到诱导分化后第四天ＣＨＯＰ－ＩＯ表达水平开始下降，第６天以后基本检测不到ＣＨＯＰ—１０的表达。油红染色显示，此诱导分化方案中脂肪细胞分化明显受到抑制，并且与标准诱导分化方案相比，Ｃ／ＥＢＰｎ和ＰＰＡＲＹ的表达明显延迟，表达的量亦明显减少。而在标准的诱导分化方案中诱导分化后第一天ＣＨＯＰ－ＩＯ的表达明显下降，以后一直维持在痕量水平。油红染色显示，在标准的诱导分化方案中，１００％前脂肪细胞分化为脂肪细胞。由此可以说明在含有１０％的小牛血清的诱导分化方案中ＣＨＯＰ－ＩＯ持续高水平表达可明显抑制脂肪细胞分化（Ｆｉｇ．５）。

Ｆｉｇ．４Ｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆ１（ｙ％ＣＳａｎｄＩＯ％ＦＢＳｗｉｔｈｏｒｗｉｔｈｏｕｔ蛐）ＩｏｎｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＣＨＯＰ－１０ａｎｄｅｆＥ鼹１３．

２－ｄａｙｐｏｓｔｃｏｎｆｌｕｅｎｔ３Ｔ３一ＬＩｐｒｅａｄｉｐｏｃｙｔｅｓｗｅｒｅｔｒｅａｔｅｄｗｉｔｈ１０％ＣＳａｎｄＩＯ％ＦＢＳｗｉｔｈｏｒｗｉｔｈｏｕｔＭＤＩ，２４ｈｏｕｒｓｌａｔｅｒ，ｔｈｅｃｅｌｌｓｗｅｒｅｈａｒｖｅｓｔｅｄａｎｄｗｅｒｅｓｕｂｊｅｃｔｅｄｔｏｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔｔｏｄｅｔｅｃｔｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＣＨＯＰ－ＩＯａｎｄＣ／ＥＢＰＢｂｙＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ．３８ｋＤａｎｄ１８ｋＤａｒｅｔｗｏｉｓｏｆｏｒｍｓｏｆＣ／ＥＢＰＢ．

２．４胎牛血清对ＣＨＯＰ—ｌＯ的表达下调与生长状态无关

ＣＨＯＰ－ＩＯ的表达与生长状态相关，在生长分裂的细胞中，ＣＨＯＰ－ＩＯ几乎没有表达，而在生长抑制的细胞中ＣＨＯＰ—１０表达明显增加［２４］。在前面的实验中，我们发现ＩＯ％ＦＢＳ能使生长抑制的前脂肪细胞中ＣＨＯＰ－ＩＯ的表达下调，在本实验中我们也检测了用含ＩＯ％ＦＢＳ的ＤＭＥＭ培养分裂的前脂肪细胞，当细胞生长到接触抑制后２天后，ＣＨＯＰ－ＩＯ蛋白水平的表达。结果表明：用含ＩＯ％ＦＢＳ的ＤＭＥＭ培养的前脂肪细胞生长到接触抑制后ＣＨＯＰ一１０表达水平亦很低（Ｆｉｇ．６Ａ），更有趣的是如果换用含ＩＯ％ＣＳ的培液继续培养细胞２４小时后，ＣＨＯＰ－ＩＯ表达水平明显增加，而作为对照，如果换用新鲜的ＩＯ％ＦＢＳ培液培养２４小时后，ＣＨＯＰ－ＩＯ蛋白仍处于很低的