微生物鉴定常用的生理生化试验实验报告 (2)

山东大学实验报告2017年1２月４日

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科目:微生物学实验题目:微生物鉴定常用的生理生化试验姓名:丁志康

一、目的要求

１、证明不同微生物对各种有机大分子的水解能力不同,从而说明不同微生物有着不同的酶系统。

2、掌握进行微生物大分子水解试验的原理与方法。

3、了解糖发酵的原理与在肠道细菌鉴定中的重要作用。

4、掌握通过糖发酵鉴别不同微生物的方法。

５、了解IMVｉC反应的原理及其在肠道细菌鉴定中的意义与方法。

二、基本原理

1、生物对大分子的淀粉、蛋白质与脂肪不能直接利用,必须靠产生的胞外酶将大分子物质分解才能被微生物吸收利用。胞外酶只要为水解酶,通过加水裂解大的物质为较小的化合物,使其能被运输至细胞内。如淀粉酶水解淀粉为小分子的糊精、双糖与单糖;脂肪酶水解脂肪为甘油与脂肪酸;蛋白酶水解蛋白质为氨基酸等。这些过程均可通过观察细菌菌落周围的物质变化来证实;淀粉遇碘液会产生蓝色,但细菌水解淀粉的区域,用碘测定不在产生蓝色,表明细菌产生淀粉酶。脂肪水解后产生脂肪酸可改变培养基的ｐＨ,使pH降低,加入培养基的中性红指示剂会使培养基从淡红色变成深红色,说明胞外存在着脂肪酶。

2、糖发酵试验就是常用的鉴别微生物的生化反应,在肠道细菌的鉴定上尤为重要。绝大多数细菌都能利用糖类作为碳源与能源,但就是它们在分解糖类物质的能力上有很大的差异。有些细菌能分解某种糖产生有机酸(如乳糖、醋酸、丙酸等)与气体(如氢气、甲烷、二氧化碳的等);有些细菌只产酸不产气。例如大肠杆菌能分解乳糖与葡萄糖产酸并产气;伤寒杆菌分解葡萄糖产酸不产气,不能分解乳糖;普通变形杆菌分解葡萄糖产酸产气,不能分解乳糖。发酵培养基含有蛋白胨,指示剂(溴甲酚紫),倒置的德汉氏小管与不同的糖类。当发酵产酸时,溴甲酚紫指示剂可由紫色(pH6、8)变为黄色(pＨ５、2)。气体的产生可由倒置的德汉氏小管中有无气泡来证明。

３、IMViC反应就是吲哚试验、甲基红试验、伏-普试验与柠檬酸试验4个试验的首字母缩写。这四个实验主要就是用来快速鉴别大肠杆菌与产气杆菌,多用于水的细菌检查。

(1)吲哚试验:某些细菌有色氨酸酶,能分解蛋白胨中的色氨酸形成吲哚(靛基质),吲哚能与对二甲基氨基苯甲醛作用生成玫瑰吲哚而呈红色。

(2)甲基红试验:某些细菌在糖代谢过程中,分解葡萄糖产生丙酮酸,丙酮酸进一步被分解成为甲酸、乙酸、琥珀酸等,使培养基pH下降至４.5以下,加入甲基红指示剂可呈红色。如细菌分解葡萄糖产酸量少,或产生的酸进一步转化为其她物质(如醇、醛、酮、气体与水),培养基pH 在5、4以上,加入甲基红指示剂呈橘黄色。本试验常与V-P试验一起使用,因为前者呈阳性的

细菌,后者通常为阴性。

(3)伏-普(二乙酰)试验:某些细菌能发生如下转换:葡萄糖→丙酮酸(脱羧)→乙酰甲基甲醇→2,3—丁烯二醇,在有碱存在时氧化成二乙酰,后者与胨中的胍基化合物起作用产生粉红色的化合物。本试验目的在于测定细菌产生乙酰甲基甲醇的能力。

(4)柠檬酸试验:当细菌利用铵盐作为唯一氮源,并利用柠檬酸盐作为唯一碳源时,若细菌能利用这些盐作为氮源与碳源而生长,则能利用柠檬酸钠产生碳酸盐,从而与利用铵盐产生的氨反应,形成NH４OＨ,使培养基呈碱性,使指示剂溴麝香草酚蓝(BTＢ)由淡绿转为深蓝。

三、器材

1.菌种:枯草芽孢杆菌,大肠杆菌,产气杆菌,铜绿假单胞菌,普通变形杆菌,金黄色葡萄球

菌。

2、培养基:固体淀粉培养基,蛋白胨水培养基,葡萄糖蛋白胨水培养基,葡萄糖发酵培养基,

乳糖发酵培养基。

3.溶液或试剂:革兰氏染色用卢戈氏碘液,甲基红试剂,V、P、试剂,吲哚试剂。

4、仪器或其她用具:无菌平板,无菌试管,接种环,接种针,试管架,酒精灯,小玻璃管。

四、操作步骤

（一）淀粉水解试验

(1)将固体淀粉培养基融化后冷却至5０℃左右,无菌操作制成平板。

(２)用记号笔在平板底部划成四部分。

(３)将枯草芽孢杆菌,大肠杆菌,金黄色葡萄球菌,铜绿假单细胞菌分别在不同的部分点点接种,在平板的反面分别在四部分写上菌名。

(4)将平板倒置在3７℃温箱中培养24ｈ。

(5)观察各种细菌的生长情况,将平板打开盖子,滴入少量卢戈氏碘液于平皿中,轻轻旋转平板,

使碘液均匀铺满整个平板。如菌苔周围出现无色透明圈,说明淀粉已被水解,为阳性。透明圈的大小可初步判断该菌水解淀粉酶能力的强弱,即产生胞外淀粉酶活力的高低。

（二）糖发酵试验

1、用记号笔在各试管外壁上分别标明发酵培养基名称与所接种的细菌菌名。

２.取葡萄糖发酵培养基试管3支,同样分别接入大肠杆菌,普通变形杆菌,第三支不接种,作为对照。ﻫ在接种后,轻缓摇动试管,使其均匀,防止倒置的小管进入气泡。

3、将接种过与作为对照的６支试管均置3７℃培养24~48ｈ。

４、观察各试管颜色变化及德汉氏小管中有无气泡。

（三）IＭＶiC试验

（1）接种与培养

用接种环分别取一些大肠杆菌与产气杆菌的菌种,接入五只葡萄糖蛋白胨水培养基中以及三只蛋白胨水培养基中,分别贴上标签注明培养基名称以及菌种名称,放入３７℃培养基中培养４8ｈ。

（2）结果观察

1、吲哚试验:于培养48小时后的蛋白胨水培养基中滴入３～4滴乙醚,摇动数次,静置一

分钟,待乙醚上升后,沿试管壁徐徐加入２滴吲哚试剂。在乙醚与培养物之间产生红色环

状物为阳性。

2、甲基红试验:培养48小时后,向一只葡萄糖蛋白胨水培养基内加入甲基红试剂２滴,培

养基变为红色者为阳性,变为黄色者为阴性。(注意甲基红不要假的太多,以免出现假阳性。)

3、伏-普试验:培养48小时后,向另外两只葡萄糖蛋白胨水培养基内加入5~10滴40％Ｋ

OH,然后加入等量的5%的α-萘酚试剂,用力震荡,再放入37℃恒温箱中保温15~３0分钟,以加快反应速度,若培养物呈现红色则为阳性。

五、实验结果

（一）淀粉水解试验

(左上为枯草芽孢杆菌;左下为产气杆菌;右上为大肠杆菌;右下为铜绿色假单胞菌)

(＊因为金黄色葡萄球菌菌量剩余少,所以实验中菌余用量大的产气杆菌替代)

观察结果如下: 观察

菌种枯草芽孢杆菌大肠杆菌铜绿色假单胞菌产气杆菌

淀粉水解效果＋＋+ ++ ++

（二）糖发酵试验

实验结果如图所示:

左边三支试管分别就是乳糖发酵培养基

接种大肠杆菌、变形杆菌、空白对照。

右边三支试管分别就是葡萄糖发酵培养基

接种大肠杆菌、变形杆菌、空白对照。