Elisa 实验原理及实验开发
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其免疫原性。理论上讲，对于蛋白质类抗原或抗体的最佳包被pH应该比其PI高1-2个单位， 这是因为在PI以及更低的pH条件下，蛋白质总是倾向于将亲水基团暴露在外而将疏水基团 包裹在内部，而在偏碱性的条件下，有利于疏水基团的暴露，从而增强其与固相载体的结 合。然而实际操作中，每种蛋白质的PI都是很难确定的，所以包被缓冲液首选公认比较好 的50mM pH9.6的碳酸盐缓冲液。另外，也可以尝试20mM pH8.5 Tris-HCl，或者10mM pH7.2 PBS。
种一抗
此方法是检测抗体最常用的方 法，用于检测抗体的效价、血 清的效价以及单克隆抗体的筛 选。 临床中，是检测标志性抗体的 重要手段。
特异性高：两种抗体特异性识别同 一抗原的不同表位； 灵敏度高及灵活性高：直接法、间 接法都可以用； 适用于成分复杂的样品
设计要求高：找到两种特异性 识别同一抗原的不同表位的抗 体，且两种抗体能很好的协同 工作
基于三点：
➢ 抗原或抗体能以物理性地吸附于固相载体表面。
➢ 抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物，而此种酶结合物仍能保持 其抗原或抗体的免疫学特性和酶的酶学活性。
➢ 酶结合物与相应抗原或抗体结合后，可根据加入底物的颜色反应来判定是否
有免疫反应的存在，而且颜色反应的深浅与标本中相应抗原或抗体的量成正
蛋白质抗原或抗体来说适当的提高温度有利于包被的进行，但是温度过高会影响抗原或抗 体的结构。一般包被都在37℃进行1-3h，如果包被的温度较低，则需要延长包被时间，例 如4℃包被过夜。包被的时间不能过短，否则包被不能充分进行。
(3) 包被缓冲液，包被缓冲液一个主要作用就是提高抗原或抗体的疏水性但不至于破坏
6
用途广泛：大多数蛋白质、细菌、病毒、细菌外毒素等都是抗原。 由于各种抗原成分，包括小分子的半抗原，均可用于制备特异性的抗血清或抗体， 利用此抗体作为试剂就可以检测标本中相应的抗原，因此免疫测定的应用范围极广。
7
Eห้องสมุดไป่ตู้ISA types
四大类型： 直接法 间接法 夹心法 竞争法
8
类型
优点
缺点
应用范围
最常用于抗原检测，且为多价 抗原检测。但不适用于半抗原 以及小分子单价抗原，因其不 能形成两位点的夹心。
可适用比较不纯的样本，而且数据
再现性很高；
取决于试剂盒的选择
适用于小抗原
可用于小分子的抗原和半抗原 的定量测定，以及抗体亲和力 测定。小分子激素、药物等的 测定多用此方法。
9
ELISA Protocol- Sandwich
酶
体结合的共价结合 的基团。
用酶标记的抗体（或抗原）建立的免疫测定法，可以使结果 得以放大，保证了测定方法的灵敏度。
5
特异性强：ELISA的特异性来自抗体或抗原的选择性
抗原与抗体结合反应具有专一性， 其实质是抗原分子表面的抗原决 定簇与抗体的抗原结合位点的在 化学结构和空间构象呈互补关系， 所以抗原抗体反应具有高度特异 性。
直接法
操作手续简短，节省时间； 因无须使用二抗可避免交互反应
标记一抗，灵活性差，费用高；主要用于测定样品中的抗体量，
无信号放大，灵敏度低
例如感染后的血清抗体水平
间接法 夹心法 竞争法
信号放大，灵敏度提高：多个二抗
会与一抗结合；
与直接法相比，用时较长；
灵活性高：相同的二抗可以用于多 二抗可能导致交叉反应
10
1. 样品准备 样品可以是细胞培养上清、细胞裂解液、条件培养基、血浆、血清、组织提取物、 体液等。 注意的点： （1）尽量冰上操作，避免蛋白降解； （2）收集样品时，高速离心去除杂质； （3）样品分装，储存于-80℃，避免反复冻融。
11
2.包被：将抗原或抗体固定在固相载体上，是ELISA操作中非常关键的一步，包 被的好坏直接影响到ELISA的灵敏度和特异性。 影响因素： (1) 固相载体的选择，常见的固相载体材料有聚苯乙烯（PS）、聚丙烯（PP）、环
比例，因此，可以按底物显色的程度显示试验结果。
3
ELISA特点： ➢ 灵敏度高 ➢ 特异性强 ➢ 可定性和定量 ➢ 用途广泛、易于操作、通量高
4
灵敏度高：ELISA测定法的灵敏度来自于与抗体（或抗原）结合的酶。
高活性
具有可与抗原、抗
一个酶蛋白分子每分钟可 以催化103-104个底物分子 转化为有色产物。
烃（COC/COP）等，他们都能非特异性的吸附蛋白质，靠的是蛋白质分子上的疏 水基团与固相载体表面疏水基团间的作用力。这种物理吸附并未发生化学特性的 改变，所以抗原或抗体被吸附到固相载体表面上后仍然保持其特性。聚苯乙烯因
其价格低廉、对蛋白的吸附能力强，所以应用最为广泛。
12
(2) 包被的温度与时间，一般来讲，温度越高，蛋白质的疏水作用越明显，因此对于
注意： （1）有些厂商生产的BSA里含有较高浓度的牛抗体，在实验中可能与二抗进行 结合从而造成假阳性的情况。 （2）有研究表明，封闭剂的封闭效果与分子量大小成反比，如果传统的封闭 剂起不到很好的封闭效果时，可以选用分子量更小的封闭剂（如酪蛋白）。 （3）如果检测体系是生物素-链霉亲和素体系，不能使用脱脂奶粉作为封闭剂， 因为脱脂奶粉中含有生物素，会对检测系统产生干扰。
Elisa 实验原理及实验开发
2020.12.31
Content
ELISA pPrinciple ELISA Types
ELISA Protocol ELISA Validation and Optimization
ELISA Troubleshooting
2
ELISA principle
ELISA是以免疫学为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作 用相结合起来的一种敏感性很高的实验技术。
有时提高缓冲液的离子浓度也可以提高抗原或抗体的疏水性，此时可以尝试向缓冲溶液中 加入0.6M左右的NaCl。
(4) 最佳包被量，通过实验优化确定最佳包被浓度。对于要求不是很严格的实验来说，
一般按照1-10ug/ml，每孔50-100ul左右的蛋白类抗原或抗体包被比较合理。
13
3. 封闭 抗原或抗体包被完成后，固相载体表面仍然存在未被占用的位点，这些位点还可 以继续结合抗原或抗体，为了排除这些位点对后续步骤的干扰，需要引入一些无 关的物质将这些位点占用。
种一抗
此方法是检测抗体最常用的方 法，用于检测抗体的效价、血 清的效价以及单克隆抗体的筛 选。 临床中，是检测标志性抗体的 重要手段。
特异性高：两种抗体特异性识别同 一抗原的不同表位； 灵敏度高及灵活性高：直接法、间 接法都可以用； 适用于成分复杂的样品
设计要求高：找到两种特异性 识别同一抗原的不同表位的抗 体，且两种抗体能很好的协同 工作
基于三点：
➢ 抗原或抗体能以物理性地吸附于固相载体表面。
➢ 抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物，而此种酶结合物仍能保持 其抗原或抗体的免疫学特性和酶的酶学活性。
➢ 酶结合物与相应抗原或抗体结合后，可根据加入底物的颜色反应来判定是否
有免疫反应的存在，而且颜色反应的深浅与标本中相应抗原或抗体的量成正
蛋白质抗原或抗体来说适当的提高温度有利于包被的进行，但是温度过高会影响抗原或抗 体的结构。一般包被都在37℃进行1-3h，如果包被的温度较低，则需要延长包被时间，例 如4℃包被过夜。包被的时间不能过短，否则包被不能充分进行。
(3) 包被缓冲液，包被缓冲液一个主要作用就是提高抗原或抗体的疏水性但不至于破坏
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用途广泛：大多数蛋白质、细菌、病毒、细菌外毒素等都是抗原。 由于各种抗原成分，包括小分子的半抗原，均可用于制备特异性的抗血清或抗体， 利用此抗体作为试剂就可以检测标本中相应的抗原，因此免疫测定的应用范围极广。
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Eห้องสมุดไป่ตู้ISA types
四大类型： 直接法 间接法 夹心法 竞争法
8
类型
优点
缺点
应用范围
最常用于抗原检测，且为多价 抗原检测。但不适用于半抗原 以及小分子单价抗原，因其不 能形成两位点的夹心。
可适用比较不纯的样本，而且数据
再现性很高；
取决于试剂盒的选择
适用于小抗原
可用于小分子的抗原和半抗原 的定量测定，以及抗体亲和力 测定。小分子激素、药物等的 测定多用此方法。
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ELISA Protocol- Sandwich
酶
体结合的共价结合 的基团。
用酶标记的抗体（或抗原）建立的免疫测定法，可以使结果 得以放大，保证了测定方法的灵敏度。
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特异性强：ELISA的特异性来自抗体或抗原的选择性
抗原与抗体结合反应具有专一性， 其实质是抗原分子表面的抗原决 定簇与抗体的抗原结合位点的在 化学结构和空间构象呈互补关系， 所以抗原抗体反应具有高度特异 性。
直接法
操作手续简短，节省时间； 因无须使用二抗可避免交互反应
标记一抗，灵活性差，费用高；主要用于测定样品中的抗体量，
无信号放大，灵敏度低
例如感染后的血清抗体水平
间接法 夹心法 竞争法
信号放大，灵敏度提高：多个二抗
会与一抗结合；
与直接法相比，用时较长；
灵活性高：相同的二抗可以用于多 二抗可能导致交叉反应
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1. 样品准备 样品可以是细胞培养上清、细胞裂解液、条件培养基、血浆、血清、组织提取物、 体液等。 注意的点： （1）尽量冰上操作，避免蛋白降解； （2）收集样品时，高速离心去除杂质； （3）样品分装，储存于-80℃，避免反复冻融。
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2.包被：将抗原或抗体固定在固相载体上，是ELISA操作中非常关键的一步，包 被的好坏直接影响到ELISA的灵敏度和特异性。 影响因素： (1) 固相载体的选择，常见的固相载体材料有聚苯乙烯（PS）、聚丙烯（PP）、环
比例，因此，可以按底物显色的程度显示试验结果。
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ELISA特点： ➢ 灵敏度高 ➢ 特异性强 ➢ 可定性和定量 ➢ 用途广泛、易于操作、通量高
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灵敏度高：ELISA测定法的灵敏度来自于与抗体（或抗原）结合的酶。
高活性
具有可与抗原、抗
一个酶蛋白分子每分钟可 以催化103-104个底物分子 转化为有色产物。
烃（COC/COP）等，他们都能非特异性的吸附蛋白质，靠的是蛋白质分子上的疏 水基团与固相载体表面疏水基团间的作用力。这种物理吸附并未发生化学特性的 改变，所以抗原或抗体被吸附到固相载体表面上后仍然保持其特性。聚苯乙烯因
其价格低廉、对蛋白的吸附能力强，所以应用最为广泛。
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(2) 包被的温度与时间，一般来讲，温度越高，蛋白质的疏水作用越明显，因此对于
注意： （1）有些厂商生产的BSA里含有较高浓度的牛抗体，在实验中可能与二抗进行 结合从而造成假阳性的情况。 （2）有研究表明，封闭剂的封闭效果与分子量大小成反比，如果传统的封闭 剂起不到很好的封闭效果时，可以选用分子量更小的封闭剂（如酪蛋白）。 （3）如果检测体系是生物素-链霉亲和素体系，不能使用脱脂奶粉作为封闭剂， 因为脱脂奶粉中含有生物素，会对检测系统产生干扰。
Elisa 实验原理及实验开发
2020.12.31
Content
ELISA pPrinciple ELISA Types
ELISA Protocol ELISA Validation and Optimization
ELISA Troubleshooting
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ELISA principle
ELISA是以免疫学为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作 用相结合起来的一种敏感性很高的实验技术。
有时提高缓冲液的离子浓度也可以提高抗原或抗体的疏水性，此时可以尝试向缓冲溶液中 加入0.6M左右的NaCl。
(4) 最佳包被量，通过实验优化确定最佳包被浓度。对于要求不是很严格的实验来说，
一般按照1-10ug/ml，每孔50-100ul左右的蛋白类抗原或抗体包被比较合理。
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3. 封闭 抗原或抗体包被完成后，固相载体表面仍然存在未被占用的位点，这些位点还可 以继续结合抗原或抗体，为了排除这些位点对后续步骤的干扰，需要引入一些无 关的物质将这些位点占用。