Elisa 实验原理及实验开发
elisa检测实验报告
elisa检测实验报告ELISA 检测实验报告一、实验目的本次 ELISA 检测实验的目的是定量检测样本中特定抗原或抗体的浓度，以评估实验对象的生理或病理状态。
二、实验原理ELISA（酶联免疫吸附测定）是一种基于抗原抗体特异性结合反应的免疫测定技术。
其基本原理是将已知的抗原或抗体固定在固相载体（如聚苯乙烯微孔板）表面，然后加入待检样本，样本中的待测抗原或抗体与固相载体上的抗原或抗体发生特异性结合。
接着，加入酶标记的第二抗体（或抗原），形成抗原抗体酶标记抗体复合物。
最后，加入底物，酶催化底物反应生成有色产物，通过测定有色产物的吸光度值，即可定量分析样本中待测抗原或抗体的浓度。
三、实验材料与设备1、试剂包被缓冲液（碳酸盐缓冲液，pH 96）封闭液（含 1% 5% 牛血清白蛋白的 PBS 缓冲液）洗涤液（含 005% Tween-20 的 PBS 缓冲液）样本稀释液（PBS 缓冲液）标准品（已知浓度的抗原或抗体）酶标记的二抗（辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶标记）底物溶液（如 TMB 或 pNPP）终止液（如 2M 硫酸或 1M 氢氧化钠）2、仪器与设备酶标仪（能够读取 450nm 或 492nm 波长的吸光度值）恒温培养箱移液器（量程分别为20μL、200μL、1000μL）聚苯乙烯微孔板离心机四、实验步骤1、包被将已知浓度的抗原或抗体用包被缓冲液稀释至适当浓度。
向聚苯乙烯微孔板的每孔中加入100μL 稀释后的包被液，4℃过夜或 37℃孵育 2 3 小时。
2、封闭倒掉包被液，用洗涤液洗涤微孔板 3 次，每次浸泡 3 分钟，然后拍干。
每孔加入200μL 封闭液，37℃孵育 1 2 小时。
3、加样倒掉封闭液，用洗涤液洗涤微孔板 3 次，然后拍干。
将待检样本和标准品用样本稀释液进行梯度稀释。
向微孔板的每孔中分别加入100μL 稀释后的样本和标准品，空白对照孔加入100μL 样本稀释液。
37℃孵育 1 2 小时。
ELISA原理和实验
ELISA原理和实验ELISA的原理基于免疫学和酶学的原理。
它利用抗原与抗体之间的高度专一性和互相结合的性质，通过将抗原或抗体固定在固相（如微孔板）上，再加入未标记或标记有酶的抗体或抗原，利用酶反应可见色素形成的特性来测定目标物的存在和浓度。
直接ELISA是一种简单的ELISA方法，直接测定样品中的抗原。
首先，在微孔板上涂覆纯化的抗体，使其与微孔板表面结合。
然后，将含有抗原的样品加入微孔板孔中，抗原与涂覆的抗体结合。
接下来，加入与抗原特异性结合的抗体（通常是与酶标记物共偶联的抗体），洗涤掉非特异性结合物质，并使抗原与酶标记物的抗体发生结合。
最后，加入适当的底物，通过酶反应产生的可见色素变化测定抗原的存在和浓度。
间接ELISA是一种常用的ELISA方法，用于检测抗体。
首先，在微孔板上涂覆纯化的抗原或蛋白质，使其与微孔板表面结合。
然后，加入样品，例如患者血清，其中包含待测抗体。
接下来，加入与待测抗体特异性结合的抗体（通常是与酶标记物共偶联的抗人或抗动物IgG抗体），洗涤掉非特异性结合物质。
最后，加入适当的底物，通过酶反应产生的可见色素变化测定抗体的存在和浓度。
竞争ELISA也称为抗原饱和法，用于测定溶液中的抗原。
首先，在微孔板上涂覆纯化的抗体，使其与微孔板表面结合。
然后，加入含有已知浓度的抗原的样品溶液和待测抗原样品溶液，它们将竞争与涂覆的抗体结合。
接下来，加入与该抗原特异性结合的抗体（通常是与酶标记物共偶联的抗体），洗去未结合的抗体。
最后，加入适当的底物，通过酶反应产生的可见色素变化测定待测抗原的存在和浓度。
夹心ELISA是一种用于检测特定抗原的双抗体夹心法。
首先，在微孔板上涂覆特异性抗体，使其与微孔板表面结合。
然后，加入待测样品，使其与固定的抗体结合。
接下来，加入另一种特异性抗体（通常与酶标记物共偶联的抗体），使其与抗原结合。
最后，加入适当的底物，通过酶反应产生的可见色素变化测定抗原的存在和浓度。
elisa的实验原理和技术应用
Elisa的实验原理和技术应用1. 引言酶联免疫吸附测定（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay 或 ELISA）是一种常用于生物医学研究中的免疫测定方法。
ELISA可以高度特异性地检测出某个特定抗原或抗体，广泛应用于免疫学、分子生物学、临床诊断等领域。
本文将介绍ELISA的实验原理和技术应用。
2. ELISA的原理ELISA基于抗原与抗体之间的特异性反应，通过将抗原或抗体固定在试验板上，然后与相应的酶标记抗体或酶标记抗原结合，最后通过添加底物来检测酶的活性。
ELISA可分为直接ELISA、间接ELISA、竞争ELISA等不同类型，下面将分别介绍这些类型的原理。
2.1 直接ELISA直接ELISA是最简单的ELISA类型，适用于检测抗原。
原理如下： 1. 在试验板上涂布抗体。
2. 加入样品，其中含有待测抗原。
3. 洗涤试验板，去除未结合的物质。
4. 加入酶标记的第二抗体，该抗体与待测抗原结合。
5. 再次洗涤试验板，去除未结合的物质。
6. 加入底物，使酶反应生成可检测的颜色。
2.2 间接ELISA间接ELISA适用于检测抗体。
原理如下： 1. 在试验板上涂布抗原，例如蛋白质。
2. 加入样品，其中含有待测抗体。
3. 洗涤试验板，去除未结合的物质。
4. 加入酶标记的第二抗体，该抗体与待测抗体结合。
5. 再次洗涤试验板，去除未结合的物质。
6. 加入底物，使酶反应生成可检测的颜色。
2.3 竞争ELISA竞争ELISA适用于检测抗原或抗体。
原理如下： 1. 在试验板上涂布抗原。
2.加入样品，其中含有待测抗原或抗体。
3. 洗涤试验板，去除未结合的物质。
4. 加入酶标记的第二抗体或酶标记的第一抗体，该抗体或抗原与待测物竞争结合。
5.再次洗涤试验板，去除未结合的物质。
6. 加入底物，使酶反应生成可检测的颜色。
3. ELISA的技术应用ELISA在医学和生物科学研究中有广泛的应用。
ELISA酶联免疫吸附试验报告
大学实验报告酶联免疫吸附试验学院：专业：姓名：学号：一．实验原理酶联免疫吸附试验（ELISA）是一种用酶标记抗原或抗体的方法，此法是将抗原、抗体免疫反应的特异性和酶的高效催化作用原理有机地结合起来的技术，可敏感地检测体液中微量的特异性抗原或抗体。
基本原理如下：①先使用抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性；②使抗原或抗体与某种酶联结成酶标抗原或酶标抗体，这种酶标抗原或酶标抗体即保留了其免疫活性，又保留了酶活性；③试验时，把受检标本（抗体或抗原）和酶标抗原或酶标抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应，用洗涤法去除固相载体上的游离物质，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的多少有关。
当加入酶反应的底物后，底物被酶催化而产生有色物质。
颜色反应深浅与受检抗原或抗体的量成正比。
因此，可借助颜色反应的深浅来定性、定量抗体或抗原。
本技术的特点是敏感性高，特异性强，操作简易，结果容易观察。
图1 ELISA实验原理示意图二．实验材料BSA抗原、兔抗BSA抗体（一抗，分别用PBS稀释成1:2, 1:4, 1:16, 1:32, 1:64, 1:128, 1:256七个浓度）、酶标羊抗兔IgG（二抗）、0.05M PH9.6碳酸盐包被缓冲液、洗涤液（PBS）、底物溶液、2mol/L H2SO4。
三．实验方法1.包被板的处理：加BSA（包被缓冲液稀释为10μg/ml）至酶标板中，每孔100μl，置湿盒中4℃过夜。
第二天取出，用PBS洗涤3-4次。
2.取包被好的酶标板，在第一孔中加入100μl PBS作阴性对照，在第2-8孔加入上述稀释的一抗各100μl，置37℃保温1h。
3.倾去液体，用PBS洗涤3-4次后加入二抗各100μl，置37℃保温30min。
4.倾去液体，用PBS洗涤3-4次后加入底物溶液各100μl，在暗处37℃避光显色20min，最后加入50μl、2M H2SO4终止反应。
5.在波长490nm处，测定各孔的光密度吸收值。
ELISA原理及步骤
ELISA原理及步骤ELISA，即酶联免疫吸附实验（Enzyme-linked immunosorbent assay），是一种常见的免疫学实验技术，在生物医学研究和临床诊断中广泛应用。
它基于抗原与抗体的特异性结合，在酶的催化下，通过颜色的变化来检测和定量分析目标分子的存在。
一、ELISA原理1.包被：将抗原或抗体固定在微孔板表面。
2.孵育：加入待测标本，使抗原和抗体充分结合。
3.清洗：去除未结合的物质。
4.检测：加入酶标记的抗体或底物，与已结合的抗原或抗体反应。
5.测定：加入底物后，产生可测量的信号，如颜色变化。
6.分析：对信号进行测量和定量分析。
二、ELISA步骤1.准备试剂和材料：-抗原或抗体：根据需要选择合适的抗原或抗体。
-微孔板：常用的是96孔或384孔微孔板。
-缓冲液：包括洗涤缓冲液、稀释缓冲液等。
-酶标记二抗和底物：根据需要选择适合的酶标记二抗和底物。
2.包被抗原或抗体：-将抗原或抗体稀释至合适的浓度。
-加入微孔板孔中，使其吸附在孔底。
-孵育在4℃或37℃下，一般需要数小时或过夜孵育。
3.添加标本和控制样品：-将待测标本和控制样品逐孔加入微孔板中。
-孵育一段时间，使抗原和抗体发生特异性结合。
4.洗涤：-倾倒试剂，并洗涤孔内的非特异性吸附物。
-重复该步骤2-3次，以确保洗涤干净。
5.加入酶标记二抗：-将酶标记的二抗加入每个孔中。
-孵育一段时间，使其与已结合的抗原或抗体结合。
6.洗涤：-倾倒试剂，并洗涤孔内的非特异性吸附物。
-重复该步骤2-3次，以确保洗涤干净。
7.加入底物：-加入适合的底物。
-孵育一段时间，使底物与酶发生反应。
8.反应停止：-加入适当的溶液，停止底物酶反应。
9.测定信号：-使用光密度测定仪读取每个孔的吸光度。
-记录吸光度值，用于后续数据分析和定量结果。
三、ELISA的注意事项-实验过程中需严格控制温度和时间，尤其是孵育和洗涤步骤。
-各个试剂需事先准备好，避免其中一步骤时间过长导致信号的变化。
elisa原理及步骤
elisa原理及步骤Elisa原理及步骤。
ELISA（enzyme-linked immunosorbent assay）是一种常用的免疫学实验方法，用于检测抗体或抗原的存在和浓度。
它的原理基于酶标记的抗体或抗原与待检测样品中的特定分子结合，然后通过酶介体的作用产生可定量检测的信号。
ELISA方法具有高灵敏度、高特异性和简单操作的特点，因此在生物医学研究和临床诊断中得到了广泛的应用。
ELISA的原理。
ELISA方法的原理是基于抗体-抗原的特异性结合。
在ELISA实验中，待检测的抗原或抗体首先被吸附在微孔板上，然后加入特异性的酶标记抗体或抗原，形成抗原-抗体-酶标记抗体复合物。
随后，通过加入底物使酶产生可定量检测的信号，最终通过光度计或荧光计测定信号的强度，从而确定待检测样品中抗原或抗体的浓度。
ELISA的步骤。
1. 样品处理，将待检测的样品（血清、尿液、细胞上清液等）进行处理，如离心、稀释等，以便得到适合实验的样品。
2. 固定抗原或抗体，将待检测的抗原或抗体溶液加入微孔板中，使其吸附在板上，然后对板进行洗涤，以去除未结合的物质。
3. 加入酶标记抗体或抗原，将特异性的酶标记抗体或抗原加入微孔板中，与固定的抗原或抗体结合，形成复合物。
4. 洗涤，对微孔板进行洗涤，以去除未结合的酶标记抗体或抗原。
5. 加入底物，加入适当的底物，使酶产生可定量检测的信号。
6. 反应停止，在适当的时间后，加入反应停止液停止酶的反应。
7. 测定光密度，使用光度计或荧光计测定产生的信号的强度，从而确定待检测样品中抗原或抗体的浓度。
ELISA方法的应用。
ELISA方法在临床诊断、生物医学研究和药物开发等领域得到了广泛的应用。
在临床诊断中，ELISA方法常用于检测感染病原体的抗体、抗原或相关蛋白质，如HIV、乙肝病毒、丙肝病毒等。
在生物医学研究中，ELISA方法常用于检测细胞因子、生长因子、激素等蛋白质的浓度，以及疾病标志物的检测。
elisa常见实验方法
elisa常见实验方法摘要：1.ELISA实验原理简介2.ELISA实验步骤概述3.常见ELISA实验方法分类4.各类ELISA实验方法的优缺点及应用场景5.提高ELISA实验效果的方法6.ELISA实验中常见问题及解决策略正文：ELISA（酶联免疫吸附实验）是一种常用于生物医学领域，用于检测蛋白质、抗原和抗体等生物分子的方法。
ELISA实验通过特异性抗体与待检测物结合，再通过酶标记的二抗检测结合物，从而实现对目标分子的定量分析。
以下是ELISA常见实验方法的详细介绍。
1.ELISA实验原理简介ELISA实验基于抗原抗体反应原理，将抗原或抗体固定在固相载体上，待检测样品中的目标分子与固定在载体上的抗体结合，再加入酶标记的二抗，与结合在载体上的抗原或抗体发生反应。
最后，通过底物显色反应，根据颜色的深浅判断待测物含量。
2.ELISA实验步骤概述ELISA实验一般分为以下四个步骤：（1）抗原或抗体固定：将抗原或抗体吸附在固相载体（如酶标板）上；（2）样品处理：对待测样品进行适当处理，使其与实验体系相适应；（3）加样：将处理后的样品和酶标记的二抗加入酶标板，incubate；（4）底物显色：加入底物，酶标记的二抗与抗原或抗体结合后，底物被酶催化显色；（5）读数：用酶标仪测定显色程度，换算成待测物浓度。
3.常见ELISA实验方法分类根据实验过程中抗原抗体结合的方式，ELISA实验可分为以下几类：（1）双抗原夹心法：待测物为抗原，实验中使用两种针对抗原不同表位的抗体；（2）竞争法：待测物为抗体，与固定抗原竞争结合酶标抗体；（3）间接法：待测物为抗体，通过酶标记的二抗检测；（4）免疫共沉淀法：利用抗原抗体结合后形成的免疫复合物与底物结合。
4.各类ELISA实验方法的优缺点及应用场景（1）双抗原夹心法：优点为特异性高、灵敏度高，适用于抗原含量较低的检测；缺点为操作复杂，易出现交叉反应。
（2）竞争法：优点为操作简便，适用于抗体含量较低的检测；缺点为特异性相对较低，易受其他物质干扰。
ELISA干货实验原理+实验步骤+注意事项
ELISA干货实验原理+实验步骤+注意事项ELISA是酶联接免疫吸附剂测定( Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay )的简称。
它是继免疫荧光和放射免疫技术之后发展起来的一种免疫酶技术。
在检测时，受检标本（测定其中的抗原）与固相载体表面的抗体反应。
洗涤后加入酶标记的抗体，通过反应结合在固相载体上。
加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。
一、ELISA样本的处理ELISA的检测目的是为了实验提供准确的实验依据，为了保证实验数据的可靠性，在实验过程中必须坚持全面的质量控制和全过程质量控制，在收集标本前都必须有一个完整的计划注意事项1、每个样本量收集体积=100ulx检测种类，如果要做复孔，标本量收集体积=100ulx检测种类x22、样本收集后若在一周内进行检测可保存于2-8°C，若不及时检测，请进行分装，冻存于-20°或-80°C，避免反复冻融3、试剂盒的检测范围不等同于样本中待测物的浓度范围，建议实验前通过相关文献预估样本中待测物的浓度并通过预实验确定样本。
4、血清标本采集是应注意避免溶血，红细胞溶解是会释放出具有过氧化物酶活性的物质，溶血标本可能会增加非特异性显色5、为了保证尿液检测的准确性，必须正确收集尿液标本和保存，收集尿液的容器必须要清洁干燥，最好使用一次性的容器，避免因用药并清洁不到而造成的污染，尿液样本必须新鲜，留取后，应及时检测或保存6、标本宜在新鲜是检测如有细菌污染，菌体中可能含有内源性HRP，也会产生假阳性反应。
如在冰箱中保存过久，其中可能发生聚合，间接法ELISA中乐视本底加深，7、反复冻融会使蛋白效价降低，所以待测样本如需多次检测，宜少量分装冻存二、标本类型01、ELISA的常见标本液体类标本：血清、血浆、尿液、细胞上清、脑脊液等培养细胞组织标本02、ELISA标本的保存一般来说，再5天内测定的血清标本可放置于4°C，标本再冰箱中保存时间过长会导致血清IgG聚合，是间接法的试剂本底加深，超过一周测定的需-20°C保存，冻结血清溶解后，蛋白质局部浓缩，分不均，应充分混匀并避免产生气泡，浑浊或有沉淀的血清标本应先离心或过滤，澄清后再检测。
elisa实验报告讨论
elisa实验报告讨论Elisa实验报告讨论引言：Elisa（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay）是一种常用的实验技术，用于检测和定量分析生物样本中的特定分子，例如蛋白质、抗体、细胞因子等。
Elisa技术具有高灵敏度、高特异性和广泛的应用领域，因此在医学、生物学和生物技术等领域被广泛采用。
本文将探讨Elisa实验的原理、步骤以及一些常见的应用和优缺点。
一、Elisa实验原理Elisa实验基于酶标记的免疫反应原理，其核心思想是利用抗原和抗体之间的特异性结合来检测目标分子的存在。
实验分为直接Elisa、间接Elisa、竞争性Elisa和间接竞争性Elisa等不同类型。
在直接Elisa中，首先将待测样本加入到已经包被在微孔板上的抗原表面，待样本中的目标分子与抗原结合。
然后，加入与目标分子特异性结合的酶标记抗体，允许其与已结合的目标分子形成复合物。
最后，通过加入底物并测量底物的酶活性来定量目标分子的存在。
二、Elisa实验步骤1. 微孔板的包被：将抗原溶液加入到微孔板孔中，使其吸附在孔壁上。
2. 阻断：加入阻断剂，防止非特异性结合。
3. 样本加入：加入待测样本，使其中的目标分子与孔中的抗原结合。
4. 酶标记抗体加入：加入与目标分子结合的酶标记抗体，形成复合物。
5. 洗涤：多次洗涤以去除非特异性结合的物质。
6. 底物加入：加入底物，使其与酶标记发生反应，产生可测量的信号。
7. 信号检测：使用酶标仪或光度计测量底物的反应产物，得到目标分子的定量结果。
三、Elisa实验的应用1. 医学诊断：Elisa技术广泛应用于疾病的早期诊断和筛查，例如HIV、乙肝、艾滋病等。
通过检测患者血液中特定抗体或抗原的存在，可以准确判断患者是否感染某种病原体。
2. 药物研发：Elisa技术可以用于药物的研发和评估。
通过检测药物对特定蛋白质的结合能力，可以评估药物的亲和力和效果。
3. 生物学研究：Elisa技术在生物学研究中也有广泛的应用，例如检测细胞因子、蛋白质表达水平等。
ELISA原理方法及操作细节
ELISA原理方法及操作细节一、ELISA的原理1.直接ELISA：将抗原直接附着在固相载体上，通过特异性抗体的结合来检测抗原的存在和浓度。
2.间接ELISA：将已知的抗原附着在固相载体上，再加入待测样品，通过特异性抗体和二抗的结合来检测抗体的存在和浓度。
3.夹心ELISA：分别在固相载体上附着抗原和特异性抗体，再加入待测抗原，通过特异性抗体和二抗的结合来检测抗原的存在和浓度。
4.竞争ELISA：将已知抗原和酶标记的抗原竞争与待测抗原中的特异性抗体结合，通过酶标记抗体的含量来反映待测抗原的浓度。
二、ELISA的方法以下以间接ELISA为例进行详细介绍ELISA的方法步骤：1.固相吸附：将已知抗原溶液加入微孔板孔中，使抗原吸附在孔壁上。
然后用PBS或BSA溶液冲洗孔板孔，以去除未结合的抗原。
2.阻断：加入BSA或牛血清蛋白溶液等阻断剂，封闭孔壁上的非特异性结合位点。
3.添加待测样品：加入待检测的抗体样品，经过适当的孵育后，将孔板洗涤，去除未结合的抗体。
4.加入检测抗体：加入与待测抗体特异性结合的二抗，如抗人IgG的辣根过氧化物酶（HRP）二抗，HRP会与抗体特异性结合，形成复合物。
5.反应缓冲液：加入含有HRP底物的反应缓冲液，允许HRP催化底物，产生荧光或颜色反应。
6.反应停止：加入止反应剂，停止酶反应，停止颜色的产生。
7.读取结果：使用酶标仪或光密度计测量各孔中的荧光或颜色的强度，根据强度值的差异来判断样品中抗原或抗体的存在和浓度。
三、ELISA的操作细节1.实验前准备：准备所需试剂、材料和设备，并确保其干净和无菌。
2.微孔板处理：在操作前检查微孔板的孔是否完整，边沿是否正常。
可事先进行热处理或使用已经处理好的微孔板。
3.孔的布置：根据需要设置对照孔和待测孔，每种样品应设置多个孔位，以保证实验的可靠性。
4.液体处理：液体的加入和去除要注意均匀和充分，特别是在液体去除时需要彻底排空。
5.孔板洗涤：洗涤液的选择要注意是否会影响特异性结合和反应的准确性，同时洗涤液的温度和洗涤次数也需要严格控制。
ELISA实验原理及操作
ELISA实验原理及操作ELISA（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay）是一种常用的免疫学实验方法，用于检测和定量分析特定分子（如蛋白质、抗原、抗体等）的存在和浓度。
ELISA实验基于特异性抗原-抗体相互作用的原理，其中酶被用作信号发生器。
以下将详细介绍ELISA实验的原理和操作步骤。
实验原理：1.吸附：首先，将待检测物质（如抗原、抗体等）稀释并加入到孔板（通常是96孔板）中的孔中。
然后，将孔板在低温条件下孵育，使待检测物质与孔壁结合。
2.结合：在吸附步骤完成后，孔板中存在未结合的部分空白孔。
这些空白孔将被添加特异性的第二抗体或标记物与待测物质的结合进行识别。
当第二抗体结合到待测物质时，会形成一个抗原-抗体-第二抗体（或标记物）复合物。
3.检测：根据所使用的标记物的不同，有两种常用的检测方法：酶标方法和荧光方法。
在酶标方法中，标记物通常是酶，如HRP（辣根过氧化物酶）或AP（碱性磷酸酶）。
标记物可以与底物反应，产生一个可检测的信号。
通过加入特定的底物和染色物质，可以检测到酶的活性，从而确定待测物质的存在和浓度。
操作步骤：1.准备试剂和设备：如溶液、洗涤缓冲液、酶标板、吸液管、微量分注器、孔板读数仪等。
2.样品制备：将待测物样品适当稀释，并添加到孔板中。
正样和阴性对照也需相应加入。
每个样品应有至少两个孔。
3.孔板处理：将孔板置于4°C的冰箱中孵育一段时间，使待测物与孔壁结合。
然后，将标准物质和对照物质加入到孔板中的相应孔中。
4.吸除样品：将孔板倒置，并使用洗涤缓冲液洗涤孔壁上未结合的物质。
5.结合抗体：加入特异性的第二抗体或标记物，使其与待测物结合。
6.吸除未结合的抗体：用洗涤缓冲液洗涤孔壁上未结合的抗体。
7.信号发生：加入底物和染色剂，允许酶与底物反应，生成可检测的信号。
8.读取结果：使用孔板读数仪测量各孔的吸光度，并将其转化为待测物浓度。
需要注意的是，每个实验都应包括阴性对照、阳性对照和标准曲线。
ELISA实验原理方法仪器流程图和注意事项分析
ELISA实验原理方法仪器流程图和注意事项分析ELISA（enzyme-linked immunosorbent assay），即酶联免疫吸附法，是一种常用的免疫学检测方法。
该方法通过检测抗原与抗体间的特异结合反应来确定样品中特定抗原或抗体的存在与数量。
ELISA技术广泛应用于生物医学和生物化学领域，如病原微生物检测、药物筛选、分子生物学等。
一、ELISA实验的原理方法：1.抗原或抗体的固定：在试验板上的孔中固定特定的抗原或抗体。
这样，待测样品中的特定抗体或抗原与固定的分子结合，形成复合物。
2.特异性抗体或抗原的添加：将待测样品加入试验孔中，特异性的酶标记抗体或抗原与复合物结合形成特异结合。
3.酶标记抗体或抗原的添加：在第二步形成的特异结合物上加入酶标记抗体或抗原，使其与特异结合物再次发生反应。
4.酶标记分子的检测：添加底物，通过底物的转化反应，观察酶标记物的生成并测定其中的酶活性。
底物催化生成的产物含有染色体，可以用光谱仪检测反应的光密度。
5.检测结果的判定：根据光密度的变化来判断待测样品中特定抗体或抗原的含量，常用的方法包括比色法、荧光法和化学发光法等。
二、ELISA实验的仪器：1.酶标仪或光谱仪：用于测定酶标物产生的光密度或荧光信号。
2.孵育箱：提供恒定的温度和湿度条件，进行酶反应过程。
3.洗板机：用于洗涤试验板以去除非特异性结合部分。
4.加液器：用于添加试剂和样品。
5.显微镜：用于观察试验结果。
三、ELISA实验的流程图：1.将特定抗原或抗体固定在试验板上的孔中。
2.加入待测样品，并与固定的抗原或抗体反应。
3.洗涤试验板，去除非特异性结合的物质。
4.加入酶标记抗体或抗原，形成特异结合。
5.洗涤试验板。
6.加入底物，观察酶标物的生成并测定其酶活性。
7.根据底物转化产物的光密度变化，判定待测样品中特定抗体或抗原的含量。
四、ELISA实验的注意事项：1.使用纯净的试剂和无菌的操作条件，以避免实验结果的偏差。
ELISA实验报告
ELISA实验报告一、实验目的ELISA（酶联免疫吸附测定）是一种广泛应用于生物医学研究和临床诊断的免疫学技术。
本次实验的目的是通过 ELISA 方法检测样本中特定抗原或抗体的含量，熟悉 ELISA 的实验原理、操作步骤，并对实验结果进行分析和解读。
二、实验原理ELISA 的基本原理是将已知的抗原或抗体固定在固相载体（如聚苯乙烯微量反应板）表面，然后加入待检样本，使其中的抗原或抗体与固相载体上的抗原或抗体发生特异性结合。
洗去未结合的物质后，再加入酶标记的第二抗体或抗原，形成抗原抗体酶标抗体复合物。
最后加入底物，通过酶催化底物显色，根据颜色的深浅来定量测定样本中抗原或抗体的含量。
三、实验材料1、试剂包被缓冲液（pH 96 的碳酸盐缓冲液）洗涤缓冲液（含 005% Tween-20 的 PBS 缓冲液）封闭液（含 1% BSA 的 PBS 缓冲液）样本稀释液（PBS 缓冲液）酶标抗体工作液底物溶液（TMB 溶液）终止液（2 M 硫酸溶液）2、仪器酶标仪移液器恒温箱微量反应板3、样本待检血清样本四、实验步骤1、包被用包被缓冲液将抗原稀释至适当浓度，每孔加入100 μL，4℃过夜包被。
2、洗涤次日，弃去孔内液体，用洗涤缓冲液洗涤 3 次，每次 3 分钟，拍干。
3、封闭每孔加入200 μL 封闭液，37℃孵育 1 小时，洗涤 3 次。
4、加样将待检血清样本用样本稀释液进行梯度稀释，每孔加入100 μL，同时设置阴性对照和阳性对照，37℃孵育 1 小时，洗涤 3 次。
5、加酶标抗体每孔加入100 μL 酶标抗体工作液，37℃孵育 1 小时，洗涤 5 次。
6、显色每孔加入100 μL 底物溶液，37℃避光显色 15 分钟。
7、终止每孔加入50 μL 终止液，终止反应。
8、测定使用酶标仪在 450 nm 波长处测定各孔的吸光度值（OD 值）。
五、实验结果1、原始数据记录各孔的 OD 值，如下表所示：｜样本|OD 值|｜｜｜｜阴性对照|0085|｜阳性对照|1258|｜待检样本 1|0325|｜待检样本 2|0158|｜待检样本 3|0685|2、结果判断计算阴性对照和阳性对照的平均 OD 值，分别记为 OD 阴平和 OD阳平。
elisa的原理和其应用
Elisa的原理和其应用1. Elisa的原理简介ELISA（enzyme-linked immunosorbent assay），即酶联免疫吸附测定法，是一种常用于检测特定蛋白质、抗原或抗体的实验方法。
它基于免疫学原理，通过酶标记的抗体或抗原与待测物相互作用，再经过特定的酶促反应，最终通过颜色变化的测量来定量或定性目标物质。
1.1. Elisa的基本步骤ELISA实验通常包括以下几个步骤：1.涂布（Coating）：将待测物（例如抗原）固定在微孔板上的底部。
通常使用高结合力的表面来保证待测物的吸附。
2.阻断（Blocking）：将未被固定的孔位用非特异蛋白质（如牛血清蛋白、鱼胶）进行封闭，以防止非特异结合的干扰。
3.探针结合（Probing）：在固相的抗原或抗体上加入特异性的酶标记抗体或抗原，与待测物发生特异性结合。
4.反应（Reaction）：将孔位中非特异性结合的抗体或抗原洗掉，通过适当的酶促反应体系，如辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase）或碱性磷酸酶（alkaline phosphatase），产生显色反应。
5.检测（Detection）：通过加入合适的底物，使酶催化反应可见，测量反应产物的吸光度或荧光强度。
1.2. Elisa的特点和优势•高灵敏度：ELISA的灵敏度在ng/mL的量级，可以检测低浓度蛋白质、抗原或抗体。
•高选择性：通过特异性抗体的结合，可以准确检测目标物质。
•高通量：ELISA可以同时检测多个样品，适用于大规模实验。
•简单易行：ELISA实验步骤相对简单，操作方便。
•广泛应用：ELISA广泛应用于医学、生物学、食品安全等领域，用于诊断、监测和研究目标物质。
2. Elisa的应用场景2.1. 医学领域•临床诊断：ELISA在临床诊断中常用于检测病原微生物、肿瘤标志物、激素以及各种抗体和免疫相关的蛋白质。
•药物研发：ELISA用于药物研发中的生物样品分析，例如药物代谢产物的检测和药物浓度监测。
ELISA实验原理及操作
待测抗原： 取50μl未知浓度的抗原按照同上操作。 250ul抗体
100ul 标准抗原
50ul
50ul
稀释板
50ul 稀释液
.
待测抗原 50ul
37℃，30 min
就是利用酶标记抗体或抗原，以检测 相应抗原或抗体的一种免疫学标记技术。
.
4
• 酶联免疫吸附试验ELISA
（enzyme linked immunosorbent assay）
是一类常用的免疫酶技术。是将已知的 抗原或抗体吸附在固相载体表面，使抗 原抗体反应在固相表面进行。
常用的酶：辣根过氧化物酶(HRP)
PBS 50ul
15
3. 与固相抗原的竞争结合
取稀释板中预孵育的抗原抗体混合液100μl，加入 酶标板的抗原孔中，放入37℃恒温培养箱中60 min。洗 板3次。
稀释板
100ul
37℃，60 min 洗板. 3次
酶标板
16
4. 酶标二抗的结合
酶标抗体用稀释液稀释至工作浓度后，加入每孔中， 100ul/孔，置湿盒中放37℃ 30min。洗板3次。
电子致密物质等作为示踪剂，标记抗体或抗原进行 的抗原抗体反应。
特点：高度灵敏、特异、快速，定性、定量、定位 分类：免疫酶技术、免疫荧光技术、放射免疫技术、 免疫电镜技术、免疫胶体金技术和发光免疫测定。
.
3
• 免疫酶技术(enzyme immunoassay)：
是将抗原和抗体的特异性免疫反应与酶 的催化反应相结合而建立的一种免疫检测 技术。
elisa常用方法及其原理
elisa常用方法及其原理Elisa（酶联免疫吸附试验）是一种常用的实验方法，广泛应用于生物学和医学研究中。
本文将介绍Elisa的常用方法及其原理。
一、Elisa的基本原理Elisa是一种通过检测抗原-抗体反应来测定物质浓度的方法。
其基本原理是将待测物质（抗原或抗体）固定在固相载体上，然后加入特异性的酶标记二抗，通过酶标记物的催化作用，将待测物质与酶底物反应产生可测定的信号。
Elisa可以根据待测物质的特异性与酶标记物的催化作用来测定物质的浓度。
二、Elisa的常用方法1.直接Elisa法：将待测抗原直接固定在固相载体上，然后加入酶标记的第一抗体，通过酶标记物的催化作用来测定抗原的浓度。
这种方法简单快速，适用于抗原浓度较高的情况。
2.间接Elisa法：将待测抗原固定在固相载体上，然后加入与抗原特异性结合的第一抗体，再加入酶标记的第二抗体，通过酶标记物的催化作用来测定抗原的浓度。
这种方法灵敏度较高，适用于抗原浓度较低的情况。
3.竞争Elisa法：将待测抗原固定在固相载体上，然后加入与抗原特异性结合的酶标记抗体和待测样品，通过抗原与酶标记抗体的竞争来测定抗原的浓度。
这种方法可以测定抗原和抗体的亲和力，适用于测定抗原或抗体的亲和力常数。
4.间接竞争Elisa法：将待测抗原固定在固相载体上，然后加入与抗原特异性结合的第一抗体，再加入酶标记的第二抗体和待测样品，通过第一抗体与第二抗体的竞争来测定抗原的浓度。
这种方法可以测定抗原和抗体的亲和力，适用于测定抗原或抗体的亲和力常数。
三、Elisa的操作步骤1.涂覆：将待测物质（抗原或抗体）溶液加入固相载体上，使其吸附固定在载体表面。
2.阻断：加入适当的阻断剂，防止非特异性结合。
3.第一抗体反应：加入特异性的第一抗体，使其与待测物质发生特异性结合。
4.洗涤：用洗涤缓冲液洗去未结合的抗体。
5.酶标记抗体反应：加入酶标记的第二抗体，使其与第一抗体结合。
6.洗涤：用洗涤缓冲液洗去未结合的酶标记抗体。
elisa的方法及原理
elisa的方法及原理Elisa（酶联免疫吸附测定）是一种常用于检测特定蛋白质、抗体或抗原的分析方法。
它具有高度的敏感性和特异性，被广泛应用于医学、生物学和生物技术领域。
本文将介绍Elisa的原理、步骤和应用。
一、Elisa的原理Elisa基于免疫学原理和酶学反应，通过特异性抗原-抗体反应来检测目标物质的存在与否。
Elisa通常包括以下几个关键步骤：1. 固定抗原：将目标抗原固定在盘或膜上，以便后续的抗体结合反应。
2. 试样添加：将待测样品加入固定抗原的孔中，允许样品中的抗原与已固定的抗原发生结合。
3. 抗原结合：加入特异性的抗体，并使其与待测样品中的抗原结合。
4. 洗涤：通过洗涤剂去除未结合的物质，以减少非特异性反应。
5. 酶标记抗体结合：加入酶标记的抗体，它与待测样品中的抗原结合。
6. 信号发生：加入染色底物，使酶标记的抗体产生一个可测量的信号（如颜色变化）。
7. 信号检测：使用光度计或其他测量仪器测量信号的强度，与标准曲线相比较，确定待测样品中目标物质的浓度。
二、Elisa的步骤Elisa的步骤十分关键，需要严格按照以下程序进行：1. 准备工作：准备所需的试剂和设备，保持实验区域的洁净。
2. 抗原包被：将具有特异性的抗原添加到固相载体（如96孔板或膜）上，制备固定抗原。
3. 样品添加：将待测样品和标准品加入孔中，与固定抗原发生结合。
4. 增强体添加：加入特异性的酶标记抗体，允许其与结合的抗原发生结合。
5. 洗涤：通过洗涤液去除未结合的物质，减少背景干扰。
6. 底物加入：加入染色底物，与酶标记的抗体发生酶学反应。
7. 反应终止：加入终止液，停止酶学反应，保持结果稳定。
8. 信号测量：使用光度计测量发色底物的吸光度，与标准曲线或对照样品进行比较。
三、Elisa的应用Elisa具有广泛的应用领域，以下是一些常见的应用示例：1. 医学诊断：Elisa可用于检测疾病标记物、肿瘤标志物和病原体抗体，用于早期诊断和治疗监测。
ELISA实验原理及步骤
ELISA原理：利用抗原抗体的特异性反应，结合酶对底物的高效催化作用，来检测靶蛋白的含量。
实验时，需要将抗原或捕获抗体包被于固相载体上，通过检测分子（酶或荧光基团），将化学信号转换为电信号，以OD值或发光值的结果，对靶蛋白进行定量分析。
具体原理：ELISA的基础是抗原或抗体的酶标记，利用结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，在测定时，受检标本（测定其中的抗体或抗原）与固相载体表面的抗原或抗体起反应。
用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。
再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。
此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。
加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。
由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。
由于抗原、抗体的反应在一种固相载体──聚苯乙烯微量滴定板的孔中进行，每加入一种试剂孵育后，可通过洗涤除去多余的游离反应物，从而保证试验结果的特异性与稳定性。
分类：①直接法（Direct ELISA）：直接法将抗原或抗体固定到酶标板上，用带有酶标记的一级抗体或一级抗原，与之特异性结合，再利用酶催化底物显色，即可测定总靶标蛋白的含量。
②间接法（Indirect ELISA）：间接法常用于检测抗体。
将抗原固定到酶标板上，加入一抗，与抗原特异性结合，再加入带有酶标记的二抗，使二抗与一抗特异性结合，最后加入底物，使底物与酶反应显色，即可测定总靶标蛋白的含量。
③夹心法（Sandwich ELISA）：夹心法分为双抗体夹心法和双抗原夹心法，适用于检测具有多个识别位点的大分子蛋白等。
双抗体夹心法ELISA：此方法常用于检测抗原。
将抗体固定在固相载体上，加入待测抗原，与抗体特异性结合，再加入酶标抗体检测，并利用底物显色，即可测定总靶标蛋白的含量。
Elisa 实验原理及实验开发
其免疫原性。理论上讲，对于蛋白质类抗原或抗体的最佳包被pH应该比其PI高1-2个单位， 这是因为在PI以及更低的pH条件下，蛋白质总是倾向于将亲水基团暴露在外而将疏水基团 包裹在内部，而在偏碱性的条件下，有利于疏水基团的暴露，从而增强其与固相载体的结 合。然而实际操作中，每种蛋白质的PI都是很难确定的，所以包被缓冲液首选公认比较好 的50mM pH9.6的碳酸盐缓冲液。另外，也可以尝试20mM pH8.5 Tris-HCl，或者10mM pH7.2 PBS。
最常用于抗原检测，且为多价 抗原检测。但不适用于半抗原 以及小分子单价抗原，因其不 能形成两位点的夹心。
可适用比较不纯的样本，而且数据
再现性很高；
取决于试剂盒的选择
适用于小抗原
可用于小分子的抗原和半抗原 的定量测定，以及抗体亲和力 测定。小分子激素、药物等的 测定多用此方法。
9
ELISA Protocol- Sandwich
1.0
0.5
0.0
0
1
2
3
4
5
log(Concentration)
18
ELISA validation and optimization
影响ELISA结果的参数很多，包括抗体的浓度、孵育的时间、孵育的温度、封闭 液的质量和浓度、检测试剂的质量和浓度等等。 1. Optimizing Capture Antibody Concentration 2. Optimizing Sample Concentration 3. Optimizing the Detection Antibody Concentration 4. Optimizing the Enzyme Conjugate Concentration
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酶
体结合的共价结合 的基团。
用酶标记的抗体（或抗原）建立的免疫测定法，可以使结果 得以放大，保证了测定方法的灵敏度。
5
特异性强：ELISA的特异性来自抗体或抗原的选择性
抗原与抗体结合反应具有专一性， 其实质是抗原分子表面的抗原决 定簇与抗体的抗原结合位点的在 化学结构和空间构象呈互补关系， 所以抗原抗体反应具有高度特异 性。
直接法
操作手续简短，节省时间； 因无须使用二抗可避免交互反应
标记一抗，灵活性差，费用高；主要用于测定样品中的抗体量，
无信号放大，灵敏度低
例如感染后的血清抗体水平
间接法 夹心法 竞争法
信号放大，灵敏度提高：多个二抗
会与一抗结合；
与直接法相比，用时较长；
灵活性高：相同的二抗可以用于多 二抗可能导致交叉反应
比例，因此，可以按底物显色的程度显示试验结果。
3
ELISA特点： ➢ 灵敏度高 ➢ 特异性强 ➢ 可定性和定量 ➢ 用途广泛、易于操作、通量高
4
灵敏度高：ELISA测定法的灵敏度来自于与抗体（或抗原）结合的酶。
高活性
具有可与抗原、抗
一个酶蛋白分子每分钟可 以催化103-104个底物分子 转化为有色产物。
注意： （1）有些厂商生产的BSA里含有较高浓度的牛抗体，在实验中可能与二抗进行 结合从而造成假阳性的情况。 （2）有研究表明，封闭剂的封闭效果与分子量大小成反比，如果传统的封闭 剂起不到很好的封闭效果时，可以选用分子量更小的封闭剂（如酪蛋白）。 （3）如果检测体系是生物素-链霉亲和素体系，不能使用脱脂奶粉作为封闭剂， 因为脱脂奶粉中含有生物素，会对检测系统产生干扰。
Elisa 实验原理及实验开发
2020.12.31
Content
ELISA pPrinciple ELISA Types
ELISA Protocol ELISA Validation and Optimization
ELISA Troubleshooting
2
ELISA principle
ELISA是以免疫学为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作 用相结合起来的一种敏感性很高的实验技术。
其免疫原性。理论上讲，对于蛋白质类抗原或抗体的最佳包被pH应该比其PI高1-2个单位， 这是因为在PI以及更低的pH条件下，蛋白质总是倾向于将亲水基团暴露在外而将疏水基团 包裹在内部，而在偏碱性的条件下，有利于疏水基团的暴露，从而增强其与固相载体的结 合。然而实际操作中，每种蛋白质的PI都是很难确定的，所以包被缓冲液首选公认比较好 的50mM pH9.6的碳酸盐缓冲液。另外，也可以尝试20mM pH8.5 Tris-HCl，或者10mM pH7.2 PBS。
10
1. 样品准备 样品可以是细胞培养上清、细胞裂解液、条件培养基、血浆、血清、组织提取物、 体液等。 注意的点： （1）尽量冰上操作，避免蛋白降解； （2）收集样品时，高速离心去除杂质； （3）样品分装，储存于-80℃，避免反复冻融。
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2.包被：将抗原或抗体固定在固相载体上，是ELISA操作中非常关键的一步，包 被的好坏直接影响到ELISA的灵敏度和特异性。 影响因素： (1) 固相载体的选择，常见的固相载体材料有聚苯乙烯（PS）、聚丙烯（PP）、环
种一抗
此方法是检测抗体最常用的方 法，用于检测抗体的效价、血 清的效价以及单克隆抗体的筛 选。 临床中，是检测标志性抗体的 重要手段。
特异性高：两种抗体特异性识别同 一抗原的不同表位； 灵敏度高及灵活性高：直接法、间 接法都可以用； 适用于成分复杂的样品
设计要求高：找到两种特异性 识别同一抗原的不同表位的抗 体，且两种抗体能很好的协同 工作
最常用于抗原检测，且为多价 抗原检测。但不适用于半抗原 以及小分子单价抗原，因其不 能形成两位点的夹心。
可适用比较不纯的样本，而且数据
再现性很高；
取决于试剂盒的选择
适用于小抗原
可用于小分子的抗原和半抗原 的定量测定，以及抗体亲和力 测定。小分子激素、药物等的 测定多用此方法。
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ELISA Protocol- Sandwich
有时提高缓冲液的离子浓度也可以提高抗原或抗体的疏水性，此时可以尝试向缓冲溶液中 加入0.6M左右的NaCl。
(4) 最佳包被量，通过实验优化确定最佳包被浓度。对于要求不是很严格的实验来说，
一般按照1-10ug/ml，每孔50-100ul左右的蛋白类抗原或抗体包被比较合理。
13
3. 封闭 抗原或抗体包被完成后，固相载体表面仍然存在未被占用的位点，这些位点还可 以继续结合抗原或抗体，为了排除这些位点对后续步骤的干扰，需要引入一些无 关的物质将这些位点占用。
6
用途广泛：大多数蛋白质、细菌、病毒、细菌外毒素等都是抗原。 由于各种抗原成分，包括小分子的半抗原，均可用于制备特异性的抗血清或抗体， 利用此抗体作为试剂就可以检测标本中相应的抗原，因此免疫测定的应用范围极广。
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ELISA types
四大类型： 直接法 间接法 夹心法 竞争法
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类型
优点
缺点பைடு நூலகம்
应用范围
基于三点：
➢ 抗原或抗体能以物理性地吸附于固相载体表面。
➢ 抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物，而此种酶结合物仍能保持 其抗原或抗体的免疫学特性和酶的酶学活性。
➢ 酶结合物与相应抗原或抗体结合后，可根据加入底物的颜色反应来判定是否
有免疫反应的存在，而且颜色反应的深浅与标本中相应抗原或抗体的量成正
蛋白质抗原或抗体来说适当的提高温度有利于包被的进行，但是温度过高会影响抗原或抗 体的结构。一般包被都在37℃进行1-3h，如果包被的温度较低，则需要延长包被时间，例 如4℃包被过夜。包被的时间不能过短，否则包被不能充分进行。
(3) 包被缓冲液，包被缓冲液一个主要作用就是提高抗原或抗体的疏水性但不至于破坏
烃（COC/COP）等，他们都能非特异性的吸附蛋白质，靠的是蛋白质分子上的疏 水基团与固相载体表面疏水基团间的作用力。这种物理吸附并未发生化学特性的 改变，所以抗原或抗体被吸附到固相载体表面上后仍然保持其特性。聚苯乙烯因
其价格低廉、对蛋白的吸附能力强，所以应用最为广泛。
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(2) 包被的温度与时间，一般来讲，温度越高，蛋白质的疏水作用越明显，因此对于