植物功能基因组研究中的基因敲除技术
基因敲除技术
基因敲除技术gene knockoutgene knockout简介基因敲除技术是一种通过破坏特定基因来研究该基因在细胞或生物体中功能的实验方法。
这项技术在基础研究、疾病模型构建以及药物开发等领域中起着重要作用。
通过敲除特定基因，我们可以揭示该基因在生物体中的功能，对其与相关疾病的关联进行研究，并探索其在生物学过程中的作用机制。
基因敲除技术的原理基因敲除技术是通过引入特定的DNA片段使目标基因发生突变或被删除，从而破坏目标基因的功能。
常用的基因敲除技术包括CRISPR/Cas9、转座子、RNA干扰等。
CRISPR/Cas9CRISPR/Cas9是目前应用最广泛的基因敲除技术之一。
它基于细菌和古菌的天然免疫系统中的一种防御机制。
CRISPR （Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）是一种由短重复序列和变异序列组成的DNA片段。
Cas9是一种具有核酸内切活性的酶。
CRISPR/Cas9技术利用RNA导向的Cas9酶靶向识别和切割特定的DNA序列。
在细胞中引入含有目标基因的RNA分子和Cas9酶后，Cas9酶会与RNA分子结合形成复合物，通过RNA分子的导向，使Cas9酶与目标基因特异性结合，并切割目标基因的DNA序列，导致基因发生突变或敲除。
转座子转座子是一种能在基因组中移动的DNA片段。
转座子可以在基因组中发生插入、删除或重排等事件，从而导致基因的敲除和突变。
转座子技术通过引入含有转座子序列的DNA片段来实现基因敲除。
在细胞中，转座子序列会与基因组发生重组，导致目标基因的敲除或突变。
RNA干扰RNA干扰是一种通过介导靶向特定mRNA分解的机制来抑制基因表达的方法。
在RNA干扰中，特定的siRNA（small interfering RNA）或shRNA（short hairpin RNA）分子与目标mRNA相互作用，导致mRNA的降解，从而抑制特定基因的表达。
植物功能基因组研究中的基因敲除技术
植物功能基因组研究中的基因敲除技术植物基因敲除技术是近年来植物功能基因组研究中的一项重要技术。
通过该技术可以精准地删去植物基因组中的某个基因，从而研究该基因在植物生长、发育和代谢等方面的功能。
下面我们将详细介绍植物基因敲除技术的原理和应用。
一、植物基因敲除技术的原理植物基因敲除技术是通过基因编辑技术实现的。
目前主要有CRISPR/Cas9和TALEN两种技术用于植物基因编辑。
这两种技术都是利用人工合成的核酸序列，精准地识别和切割目标基因的DNA 序列，从而实现基因敲除。
先来介绍一下CRISPR/Cas9技术。
CRISPR是一种天然存在于细菌中的免疫系统。
通过CRISPR系统，细菌可以识别并摧毁侵入其体内的病毒DNA。
科学家们发现，CRISPR系统中有一种酶叫做Cas9，可以切割DNA序列。
利用人工合成的RNA序列，可以将Cas9定位到需要切割的基因上，并切割掉该基因。
这样就实现了精准的基因敲除。
TALEN技术原理类似于CRISPR/Cas9，也是通过人工合成的核酸序列，精准地识别和切割目标基因的DNA序列。
TALEN技术主要是利用一种叫做TALEN（转录激活样核酸酶）的酶来实现基因敲除。
二、植物基因敲除技术的应用植物基因敲除技术已经成为植物功能基因组研究中的一项重要技术。
它可以用于研究植物生长、发育和代谢等方面的功能。
以下是该技术的一些具体应用：1.研究基因功能植物基因敲除技术可以用于研究基因在植物生长、发育和代谢等方面的功能。
通过敲除某个基因，可以观察其对植物生长、发育和代谢等方面的影响。
这种方法可以帮助科学家们更好地了解植物基因的功能。
2.筛选基因植物基因敲除技术可以用于筛选植物基因。
在研究植物新陈代谢方面，需要筛选大量的植物基因，以了解这些基因在植物代谢中的作用。
植物基因敲除技术可以快速地筛选出与目标代谢过程相关的基因，从而加速研究进程。
3.改良植物品种植物基因敲除技术可以用于改良植物品种。
基因敲除技术的原理及应用
基因敲除技术的原理及应用1. 什么是基因敲除技术？基因敲除技术是一种用于研究基因功能的重要工具。
它通过针对特定基因进行序列特异性的基因组改变，从而使该基因在细胞或有机体中无法正常表达。
基因敲除技术可以通过多种方法实现，包括CRISPR/Cas9技术、RNA干扰技术等。
2. 基因敲除技术的原理基因敲除技术的原理是通过引入带有特定敲除序列的DNA或RNA分子，干扰目标基因的正常表达，从而导致该基因在细胞或有机体中无法产生功能性蛋白质或RNA。
具体的原理可以通过以下步骤进行解释：•设计敲除序列：根据目标基因的DNA序列，设计敲除序列，一般是由数十个碱基组成的寡核苷酸序列。
这个敲除序列将与目标基因的DNA序列互补匹配。
•传递敲除序列：将设计好的敲除序列导入目标细胞或有机体中。
传递方式可以包括转染、电穿孔等多种方法。
•敲除序列与目标基因结合：敲除序列与目标基因的DNA序列互补配对，形成双链结构。
这种配对会触发细胞内的DNA修复系统。
•DNA修复系统介入：细胞内的DNA修复系统会介入敲除序列与目标基因的配对，将目标基因的DNA序列修复或剪切。
•基因无法表达：通过以上步骤，目标基因的DNA序列被修复或剪切，导致基因在细胞或有机体中无法正常表达。
3. 基因敲除技术的应用基因敲除技术在生物学研究和生物医学领域有着广泛的应用。
下面列举几个常见的应用领域：•基因功能研究：通过敲除目标基因，研究其对细胞生理过程和有机体发育的影响，揭示基因功能与疾病发生之间的关系。
•疾病模型构建：利用基因敲除技术，构建动物模型来模拟人类遗传疾病，研究病理机制、筛选新药物。
•基因治疗：通过基因敲除技术，研究特定疾病相关基因的功能，为基因治疗提供理论和实验依据。
•农业转基因研究：基因敲除技术在农业领域可以用于研究植物基因的功能，提高作物抗病虫害能力、调控植物生长和发育等。
4. 基因敲除技术的优势与局限性基因敲除技术具有以下优势：•高效性：基因敲除技术可以精确地靶向特定基因，对其进行敲除，从而实现高效的基因敲除。
拟南芥植物基因功能研究
拟南芥植物基因功能研究拟南芥，是一种小型模式植物，也是植物学家和遗传学家研究植物的重要模型，由于其小、易培养和基因组小且功能多样，拟南芥被广泛应用于植物基因功能研究领域。
基因功能是指基因在生物体内的作用及其调控机制。
而拟南芥基因功能研究这个领域，对于理解生物学的基本规律、开拓新的研究方法和实现绿色农业发展等方面都具有重要作用。
一、拟南芥基因组研究的目的1.发现新基因同人类基因组一样，拟南芥基因组虽然只有25,000个基因，但包含了植物生命中各个关键环节中的基因，例如开花、果实发育、细胞分裂和形态构成等。
拟南芥也被视为是研究其他植物领域的垫脚石，拟南芥基因组研究的一个目的就是通过在其基因组中发现新基因，对于扩大人类对植物基因工程的认知具有重要意义。
2.揭示基因调控机制在拟南芥中，基因的调控是非常复杂的，包括转录和后转录调控。
这些调节机制的研究，能够让我们更进一步地了解到，不同的基因所在的生物体部分是如何相互作用的，那会使我们有机会研究这些交互可能会导致的不良病状。
3.寻找抗病基因病原体和虫害对植物的危害，一直是植物学家们所担心的一个问题，而找出植物的制药基因，能够从分子基础上开展对植物抵抗病原体的研究，也能够为解决粮食安全问题提供更多的资源。
二、拟南芥基因功能研究方法由于拟南芥基因组具有可塑性和许多实验工具，开展拟南芥的基因功能研究显得异常的简单。
目前，关于拟南芥功能的研究方法，主要包括以下几种：1. 整合遗传和基因组学方法先通过遗传学方法，确定目标基因，再进一步使用基因组学技术确立其在基因组上的位置。
这种方法的优点在于定位准确，可以将与给定特征相关的基因数量缩小到较小的范围。
2.基因敲除技术基因敲除是利用RNA 骨架扰动小分子介导的细胞自身保护机制，通过基因克隆进行敲除，破坏载体、导致细胞死亡的一种方法。
该方法将基因关掉，根据有没有出现问题来了解基因起了哪些作用。
3.遗传页面显微镜遗传页面显微镜用于观察拟南芥基因生成物的进化变化，以及基因功能的变化，为了更好地确定基因的发生方式和发生地点。
基因功能研究技术之基因敲除及基因编辑技术ppt课件
点突变 Left arm Right arm
Donor plasmid
同源重组发生率升高几个数量级
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TALEN的最前沿
2011年8月， Nature Biotechnology 上同时发表了用TALEN 技术 进行基因敲除的4篇研究文章，另加一篇综述。
• 一篇人类干细胞 《Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases》
• 但是，该技术制备复杂，成本昂贵，而且其技术 专利被少数几家商业公司控制。
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（二）
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崭新的技术解决经典的挑战
崭新的技术 - TALEN 经典的挑战 – 染色体DNA序列的人工编辑修改
• （点）突变：Silent；Missense； Nonsense；Frame shift （基因敲除， Knockout） • 片段删除 • 片段插入 目的与用途：生物模型；表达工具；基因治疗
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条件型基因打靶的优势： 1. 克服了重要基因被敲除所导致的早期致死 2. 并能客观、系统地研究基因在组织器官发生、发育以及
疾病发生、治疗过程中的作用和机制
这一技术亦存在一些缺点： 1. 费用太高 2. 周期较长 3. 许多基因在剔除后并未产生明显的表型改变，可能是这
些基因的功能为其他基因代偿所致
• 5' - ATAACTTCGTATA - ATGTATGC - TATACGAAGTTAT - 3' • 3' - TATTGAAGCATAT - TACATACG - ATATGCTTCAATA - 5'
9
• Cre-LoxP系统的特性
植物基因敲除技术步骤
植物基因敲除技术步骤植物基因敲除技术是一种重要的遗传工程技术，它可以通过靶向编辑基因组来实现对特定基因的敲除，从而研究该基因在植物发育、生长、抗逆性等方面的功能。
以下是关于植物基因敲除技术的详细步骤：第一步：选择目标基因需要选择要进行敲除的目标基因。
这一步需要对目标基因的功能有一定的了解，通常会根据研究的目的和需求来选定目标基因。
选定目标基因后，可以进行接下来的技术操作。
第二步：设计CRISPR/Cas9系统CRISPR/Cas9系统是当前应用最广泛的基因编辑技术之一。
在进行基因敲除时，需要设计特定的CRISPR引导RNA（gRNA），使其能够与目标基因的特定序列结合，从而实现Cas9蛋白对目标基因的靶向切割。
设计gRNA需要考虑靶向性和特异性，确保其能够精准地引导Cas9蛋白对目标基因进行切割。
第三步：构建敲除体系在确定了CRISPR/Cas9系统的设计后，需要构建敲除体系。
这一步通常包括将设计好的gRNA序列与Cas9蛋白共转染进入靶向植物细胞中，以实现CRISPR/Cas9系统在目标基因上的导向切割作用。
构建敲除体系还需考虑到转染方法和适当的转染浓度，以确保CRISPR/Cas9系统的有效导入和作用。
第四步：筛选突变体在CRISPR/Cas9系统的介导下，目标基因会发生切割并可能导致突变。
在转染后，需要对植物细胞进行筛选，找到含有目标基因敲除突变的细胞。
通常，可以利用转基因技术将CRISPR/Cas9系统与荧光标记等标记基因结合，从而对转染细胞进行筛选，并分离出含有目标基因敲除的细胞。
第五步：验证敲除效果针对潜在的敲除植株，需要进行验证敲除效果的实验。
这一步通常包括对植株进行PCR、测序等分子生物学方法的检测，以确认目标基因是否已经成功敲除。
还可以利用基因组学方法进行更深入的敲除效果验证，确认目标基因的确已被成功敲除。
第六步：进行功能研究一旦确定了目标基因的敲除效果，接下来可以进行目标基因的功能研究。
基因工程技术应用方法详解
基因工程技术应用方法详解基因工程技术是一种利用人为手段改变生物体的遗传构成和功能的技术。
它包括了从基础研究到应用开发的各个方面，被广泛应用于生物医学、农业、工业等领域。
本文将详细解释基因工程技术的应用方法，探讨不同的技术方法在不同领域中的应用。
1. 重组DNA技术重组DNA技术是基因工程技术的核心内容之一。
通过该技术，可以将来自不同生物体的DNA片段进行重新组合，形成具有新功能的基因。
这一技术的应用十分广泛，其中最为重要的应用之一是制造转基因植物。
通过将植物中特定功能的基因导入到目标植物中，实现了抗虫、抗病、耐旱等性状的改良。
此外，重组DNA 技术还用于生产蛋白质药物，如重组人胰岛素等。
2. 基因敲除技术基因敲除技术是指通过人为手段将特定的基因进行靶向删除，以观察该基因对生物体发育、生长和功能的影响。
这一技术主要通过基因编辑工具如CRISPR-Cas9实现。
基因敲除技术在生物学研究中起到了至关重要的作用，可帮助科学家理解基因的功能与调控机制。
此外，基因敲除技术在研发新药时也具有重要意义，通过针对特定基因敲除进行药物研究，可以发现新的靶点并开发更有效的药物。
3. 基因克隆技术基因克隆技术是指将某个感兴趣的基因从基因组中抽离出来，并通过DNA复制的方法制备多个相同的复制体。
这一技术广泛应用于蛋白质表达和功能分析。
通过基因克隆技术，可以大量制备目标基因的重组蛋白，以用于研究该蛋白的结构和功能。
此外，基因克隆技术还可以用于基因组库的构建，以便对特定基因进行高通量筛选和分析。
4. 基因编辑技术基因编辑技术是指通过直接修改基因组中的特定序列，实现对目标基因的精确编辑。
最著名的基因编辑技术是CRISPR-Cas9系统，它可以用于精确修复基因中的错误、敲除不需要的序列以及在特定位点插入新的基因片段。
这一技术在医学领域的应用前景巨大，可以开发出治疗基因缺陷病和遗传性疾病的潜在疗法。
5. 基因测序技术基因测序技术是指对生物体的基因组进行全面或局部的DNA序列测定。
基因敲除技术的基本原理和应用
基因敲除技术的基本原理和应用1. 基因敲除技术的概述基因敲除技术是一种通过人为干预来改变生物体特定基因表达的方法。
它是基于基因组工程技术的基础上发展起来的。
2. 基因敲除技术的基本原理基因敲除技术的基本原理是通过人为设计和构建特定的DNA序列，通过转染或转化将其导入到目标细胞中，从而抑制或破坏目标基因的正常功能，进而实现对目标基因的敲除。
3. 基因敲除技术的方法3.1 siRNA敲除法siRNA（small interfering RNA）是一种通过RNA干扰机制来靶向特定基因的技术。
它通过设计合成与目标基因互补的双链小分子RNA，并通过导入细胞内抑制目标基因的表达。
3.2 CRISPR-Cas9系统CRISPR-Cas9系统是一种新兴的基因编辑工具，可以实现高效、精准地靶向敲除目标基因。
该系统包括CRISPR RNA (crRNA) 和转录单元结合酶Cas9。
通过引导RNA与Cas9结合，可精确指导Cas9蛋白靶向到特定的DNA序列，从而实现基因敲除。
3.3 TALEN技术TALEN（Transcription activator-like effector nuclease）技术是一种利用转录激活样结构域的蛋白质与核酸酶结合来敲除基因的方法。
它可以实现对特定DNA序列的敲除，具有较高的精准性和特异性。
4. 基因敲除技术的应用4.1 功能基因研究基因敲除技术可以帮助研究人员确定特定基因在生物体发育、生长、代谢等方面的作用。
通过敲除特定基因，可以观察到其缺失对生物体功能的影响，从而揭示出该基因的功能和作用机制。
4.2 疾病模型研究基因敲除技术可以构建疾病模型，帮助研究人员深入了解某些疾病的发生机制。
通过敲除与特定疾病相关的基因，在动物模型中观察到与人类疾病相似的表型，可以用来研究疾病的发展过程和潜在治疗方法。
4.3 基因治疗基因敲除技术可用于基因治疗，即通过敲除异常基因来恢复或调节正常基因的功能。
植物遗传学中的基因编辑技术
植物遗传学中的基因编辑技术植物遗传学旨在理解植物的遗传变异和传递机制，以及通过操控植物基因来改良植物性状。
近年来，基因编辑技术的引入为植物遗传学领域带来了一次革命性的变革。
本文将探讨植物遗传学中的基因编辑技术及其应用。
一、基因编辑技术概述基因编辑技术是一种通过精确改变DNA序列的方法，用于操控生物体基因组。
最常用的基因编辑技术是CRISPR-Cas9系统，该系统是利用一种来自细菌的天然防御系统，通过引入特定的CRISPR RNA和Cas9酶，可以实现对植物基因组中目标位点的精确编辑。
二、应用于植物遗传学的基因编辑技术1. 基因敲除基因敲除是指通过基因编辑技术将目标基因的DNA序列发生删除或破坏，从而使得该基因在植物中无法被正常表达。
这种方法被广泛应用于研究植物基因的功能和调控机制。
2. 基因敲入基因敲入是指通过基因编辑技术将外源基因导入到植物基因组中，实现对目标基因的精确插入。
这种方法可以用于增加或改变植物的特定性状，如增加植物的抗病性或提高其产量。
3. 基因定点突变基因定点突变是指通过基因编辑技术精确改变植物基因组中的单个碱基，从而实现对目标基因功能的调控。
这种方法可以帮助研究人员深入理解基因功能，并为植物育种提供新的手段。
三、基因编辑技术的优势与挑战1. 优势（1）高效性：基因编辑技术可以实现对植物基因组的精确编辑，相较于传统的遗传改良方法更为高效。
（2）精确性：基因编辑技术能够精确地修改植物基因组中的目标位点，避免对其他基因的影响。
（3）多样性：基因编辑技术可以应用于不同植物物种，并可以编辑多个基因，这为植物育种提供了更多可能性。
2. 挑战（1）目标位点选择：选择适当的目标位点进行基因编辑是一个挑战，需要充分考虑基因的功能和调控机制。
（2）离靶效应：基因编辑技术的离靶效应可能对植物的基因组产生意外的影响，因此需要对其进行严格监测和评估。
（3）法规与伦理：基因编辑技术的应用涉及到法规和伦理问题，需要制定相关准则来规范其使用。
基因敲除技术的研究与应用
基因敲除技术的研究与应用基因敲除（Gene Knockout）是一种基因工程技术，可以去除生物体内的特定基因，以研究这个基因对生物体生长、发育以及其他生物学进程的作用。
该技术对临床疾病和农业品种改进产生了重要影响，因此应用广泛。
从基因敲除技术的原理上来看，该技术通过破坏或取代目标基因来模拟基因突变。
通常是通过导入易于集成到生物体的方法，如诱导突变或基因敲击在对研究过程中具有重要意义的模式和无脊椎动物中实现这一点。
但现代的科学技术使其在哺乳动物中也具有了应用的可能性。
基因敲除技术最常用于研究一个基因在发育过程中的作用，或研究一个基因与特定疾病之间的关系。
例如近年来在使用基因敲除技术研究疾病的过程中发现了许多新的基因，并将这些基因归于某些疾病。
在临床研究中，基因敲除技术被用于研究疾病治疗。
通过敲除或抑制特定的基因，可以找到治疗该疾病的更好方法。
基因敲除技术也广泛应用于植物基因组，以改善植物品种的产量、耐病性、营养价值和逆境耐受性。
例如，在水稻中，通过敲除某些基因可以提高其产量和逆境耐受性。
在苹果中，一些基因已经被敲除以增加果实的风味和营养成分。
除此之外，基因敲除技术还可以通过研究基因之间的相互作用来了解重要的生物学进程。
例如，在细胞生长和分化的过程中，基因敲除技术被用于研究细胞分化过程中的基因途径。
然而，基因敲除技术并非没有缺点或风险。
例如，敲除基因可能会产生不期望的结果，如改变其他基因的表达或特征。
同样，人类研究工作的自由与否也受到伦理和道德宣言的制约。
总之，基因敲除技术是一种强大的基因工程工具，可以用于研究特定基因与生命过程和疾病之间的关系。
尽管存在一些潜在的缺点，但该技术在改善人类健康和植物品种及增加农业生产方面具有广泛的应用前景。
CRISPRCas9基因敲除研究进展
902021年 第1期CRISPR/Cas9基因敲除研究进展白祥慧（青海师范大学生命科学学院，青海 西宁 810008）摘 要：功能基因组学的发展促进基因敲除技术的进步，基因敲除技术从载体的构建到细胞筛选再到动物模型都取得长足进步。
基因敲除手段种类繁多，其中CRISPR/Cas9作为常用的基因编辑技术，具有高效、便捷、精确等优点，在农业、医学、生物学的模型构建中被广泛运用。
随着科研工作的逐渐深入，CRISPR/Cas9技术逐渐渗透到植物和微生物研究领域中。
文章综述近年来CRISPR/Cas9的应用，为科研工作的开展提供参考。
关键词：CRISPR/Cas9；基因；敲除中图分类号：S 852 文献标识码：A 文章编号：1672-9692（2021）01-0090-03Research progress of CRISPR/Cas9 gene knockoutBai Xianghui(College of Life Science, Qinghai Normal University, Qinghai Xining 810008)Abstract: The development of functional genomics has promoted the development of gene knockout technology, which has made great progress from vector construction to cell screening to animal models. There are many kinds of gene knockout methods, among which CRISPR/Cas9, as a common gene editing technology, has the advantages of high efficiency, convenience and accuracy, making it widely used in the construction of models in agriculture, medicine and biology. CRISPR/Cas9 technology has gradually infiltrated the field of plant and microbial research as scientific work demands. In the paper, the application of CRISPR/Cas9 in recent years is briefly reviewed to provide reference for the development of scientific research.Key words: CRISPR/Cas9; Gene; Knockout收稿日期：2020-11-17作者简介：白祥慧，硕士在读，研究方向为动物生理。
植物基因敲除技术步骤
植物基因敲除技术步骤植物基因敲除技术是现代植物遗传学领域的一项重要研究工具，它通过利用CRISPR/Cas9等工具精确地切断植物基因，从而实现对植物基因组的精准编辑和改造。
下面我们将详细介绍植物基因敲除技术的步骤，希望对您有所帮助。
植物基因敲除技术步骤一、制备CRISPR/Cas9载体1.选择合适的CRISPR/Cas9载体：首先需要确定用于植物基因敲除的CRISPR/Cas9载体，一般选择含有Cas9核酸酶、sgRNA以及适当的植物选择标记的载体。
2.将目标基因sgRNA序列插入载体：利用分子克隆技术，将设计好的sgRNA序列插入CRISPR/Cas9载体中，确保sgRNA能够专一且高效地识别目标基因序列。
二、转化植物细胞1.选择合适的植物材料：根据研究需要选择适宜的植物组织或细胞系，比如拟南芥、水稻、玉米等。
2.利用农杆菌介导转化技术：将制备好的CRISPR/Cas9载体利用农杆菌介导转化技术导入植物细胞中，促使其整合到植物基因组中。
三、筛选敲除突变体1.培养转化的植物细胞：将转化的植物细胞进行培养，培养条件包括合适的培养基、光照和温度等。
2.筛选突变体：利用PCR、Southern blot等技术筛选出含有目标基因敲除的突变植株，确认其为敲除突变体。
四、鉴定敲除突变体1.验证基因组序列：对候选的敲除突变体进行测序鉴定，确认目标基因已被成功敲除。
2.确认敲除效果：通过表型观察、生物化学分析等方法，评估目标基因敲除对植物的影响，确认敲除效果。
通过以上步骤，可以实现对植物基因的精准敲除，为研究植物基因功能、开发新品种以及改良农作物品质提供了重要的技术手段。
植物基因敲除技术的不断完善和广泛应用，将为农业生产和生物科学研究带来更多的机会和挑战。
植物基因组解析及功能基因挖掘
植物基因组解析及功能基因挖掘植物基因组解析及功能基因挖掘是生物学领域的重要研究方向之一。
随着高通量测序技术的发展，我们能够快速、高效地获取植物基因组的序列信息，并进一步挖掘其中的功能基因。
本文将以植物基因组解析与功能基因挖掘为主题，介绍其重要性、方法和应用。
一、植物基因组解析的重要性植物基因组解析的重要性在于为我们深入了解植物的基因组结构和功能基因提供了重要的基础。
通过解析植物基因组，我们可以揭示植物基因的组织和调控方式，进而了解植物的形态特征、适应环境的机制以及与其他生物的亲缘关系等。
此外，植物基因组解析还可以为植物育种和基因工程提供理论依据和技术支持，推动农业领域的发展。
二、植物基因组解析的方法目前，植物基因组解析的主要方法是高通量测序技术。
高通量测序技术的出现，使得我们能够在较短的时间内获取大量的基因组序列数据，快速解析植物基因组。
其中，最常用的高通量测序技术包括Illumina测序和PacBio测序。
Illumina测序以其高通量、低成本和高准确性的特点，成为了目前最常用的测序平台。
而PacBio测序则以其长读长的特点，可以提供更长的基因组序列，对植物基因组解析中的复杂区域具有重要意义。
此外，还有一些其他的测序技术，如Nanopore测序和454测序，也在植物基因组解析中得到了一定的应用。
三、功能基因挖掘的意义和方法功能基因挖掘是在植物基因组解析的基础上，进一步分析和挖掘基因的功能和作用。
功能基因挖掘的意义在于揭示植物基因的功能，理解植物生长发育和适应环境的分子机制，为农业生产和基因工程研究提供理论和技术支持。
功能基因挖掘的方法主要有三种：生物信息学分析、转基因和基因敲除实验。
生物信息学分析是通过基因组序列数据进行计算，预测基因的结构和功能。
转基因是通过外源基因的导入，观察基因功能的变化和效果。
基因敲除则是通过基因编辑技术来删去某个特定基因，观察植物表型的变化，并进一步分析这个基因在植物生长和发育过程中的功能。
基因敲除技术及其应用_黄敏
第8卷第4期广东轻工职业技术学院学报V o.l 8 N o.42009年12月J OURNAL OF GUANGDONG I N DU STRY TECHN I CAL COLLEGE D ec . 2009收稿日期:2009-09-20作者简介:黄 敏(1979)),女,讲师。
基因敲除技术及其应用黄 敏(广东轻工职业技术学院食品与生物工程系,广东广州510300)摘 要:基因敲除技术是建立在同源重组技术之上,可对基因组进行定位修饰的实验方法。
本文简述了基因敲除技术的基本原理、打靶策略、筛选机制,在动植物和微生物中常用的基因敲除方法以及基因敲除的应用。
关键词:基因敲除;同源重组;打靶策略;筛选机制中图分类号:Q 343 文献标识码:A 文章编号:1672-1950(2009)04-0011-04基因敲除(gene knockout)是基因打靶(gene tar -ge ti n g )技术的一种。
基因打靶,是20世纪80年代后期发展起来的现代分子生物学重要实验技术之一。
早在80年代初,人们就开始研究在哺乳动物基因组中,存在使外源DNA 与现存同源序列同源重组的可能性。
1985年,Sm ithies 及其同事的研究使之得到确证。
同期的相关研究证明了鼠多能干细胞系具有诱发小鼠产生种系组织的能力,甚至在长期培养后仍存在,导入这些细胞器系的突变可以传给后代。
而基因敲除是用含有已知的外源性DNA 片段与受体细胞基因组中序列相同或非常相近的基因发生同源重组,整合至受体细胞基因组中并得以表达的一种外源性DNA 导入技术,它能精确地定点修饰和改造基因DNA 片段,改变细胞的基因型。
基因敲除技术的特点是能把外源基因引入基因组DNA 的特定片断上,引入的新基因会随基因组DNA 的复制而稳定复制,因而可在活体内对某一特定基因的功能进行研究。
它是在胚胎干细胞技术和同源重组技术基础上发展起来的,具有位点专一性强、打靶后目的片段可以与染色体DNA 共同稳定遗传的特点,目前已成为一种较理想的改造生物遗传物质的实验方法。
基因敲除
二、基因敲除的方法
利用随机插入突变进行基因敲除。 特点：依赖于细胞内自然发生的同源染色体 的随机交换，但在体细胞内，基因同源重组 利用同源 大规模的随机插入突变理论上可实现在基因 的效率特别低( 低于 10－ 6) 。增加了实际操 重组 作的工作量，限制了该项技术的应用 组范围内敲除任一基因目。 传统基因 敲除方法 该基因敲除( gene knock －out) 技术，是在转染 细胞中发生外源打靶基因与核基因组目标基因 之间的 DNA 同源重组，能够使外源基因定点 地整合到核基因组的特定位置上，从而达到改 应用随机 特点：可以分为 T-DNA 插入突变和转座子插 变细胞遗传特性的目的。 插入突变 入突变，两者是在植物中使用广泛的基因敲 除手段
二、基因敲除的方法
CRISPER/Cas系统的由来：
CRISPR（clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats） 广泛存在于细菌和古细菌的基因组中，是细菌和古细菌的一种适应性免疫系统， 该系统可以介导外源 DNA 的降解，从而抵御病毒等外来入侵者。 1987年日本学者首次在大肠杆菌中发现该间隔重复序列。 2002年，Jansen 等将其正式命名为 CRISPR，基因编码的蛋白质统称为 CRISPR 附属蛋白（CRISPR-association proteins，Cas）。
CRISPR/Cas系统的分类：
TypeⅠ TypeⅡ TypeⅢ三种不同类型 TypeⅡ系统的主要特征是包含一个标志性的Cas9蛋白(分子质 量很大的多功能蛋白)参与crRNA的成熟以及降解入侵的噬菌 体DNA或是外源质粒。
CRISPR/Cas的基因座结构
5'端为tracrRNA基因
CRISPR cas9基因敲除原理及其应用
CRISPR cas9基因敲除原理及其应用CRISPR Cas9 (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) 是一种新兴的基因编辑技术，它利用CRISPR系统和Cas9酶实现对基因组的精确编辑。
本文将对CRISPR Cas9的基本原理进行详细介绍，并探讨其在生物学研究、医学治疗和农业育种等领域的应用前景。
一、CRISPR Cas9基因敲除原理CRISPR Cas9基因敲除是利用CRISPR-Cas9系统对目标基因进行精确编辑的一项技术。
CRISPR是细菌和古细菌天然免疫系统中的一种防御机制，能够通过记录并抵御外源DNA入侵来保护细菌免受病毒感染。
而Cas9是CRISPR系统中的核酸酶，具有裁剪并去除外源DNA的功能。
CRISPR Cas9基因敲除的基本步骤如下：1.设计合适的引导RNA（gRNA），通过与目标基因序列特异性结合，将Cas9酶精确引导到目标基因的靶位点。
2.Cas9酶与gRNA结合后形成复合物，通过靶向性的DNA酶切活性，在目标位点引发DNA双链断裂。
3.在细胞的DNA修复过程中，通过非同源末端连接（Non-Homologous End Joining，NHEJ）机制，导致插入或缺失DNA碱基，从而实现基因的敲除。
二、CRISPR Cas9基因敲除的应用CRISPR Cas9基因敲除技术在生物学、医学和农业领域有着广泛的应用前景。
1.基因功能研究：通过敲除特定基因，科研人员可以深入了解该基因在生物体内的功能以及相关的生理和病理过程。
CRISPR Cas9技术的高效性和精确性使得基因功能研究更加便捷和可靠。
2.疾病治疗：基于CRISPR Cas9技术，科学家可以直接敲除或修复与疾病相关的基因突变，为基因治疗提供了新的途径。
例如，将CRISPR Cas9应用于肿瘤治疗，可以针对肿瘤细胞中的特定基因进行敲除，达到抑制肿瘤生长和扩散的目的。
基因敲除
双链RNA进入细胞
RdRP诱导 扩增 Dicer酶裂解 双链RNA
Dicer酶裂解
siRNA
解开变成单链
结合某些蛋白
复合物
复合物+与siRNA互补的mRNA
以SiRNA作为引物，以 mRNA为模板，在RdRP作 用下合成mRNA互补链
双链mRNA
mRNA被 RNA酶裂解 Dicer酶裂解 siRNA
复合物
聚合酶链式反应
抑制基因表达
对于哺乳动物，如对于一些敲除 后小鼠在胚胎时就会死亡的基因， 可以在体外培养的细胞中利用 RNAi技术研究它的功能
RNAi还被用来研究在发育过程中起作用 的基因，如可用RNAi来阻断某些基因的 表达，来研究他们是否在胚胎干细胞的 增殖和分化过程中其起着关键作用
利用随机插 入突变进行 基因敲除
转座子插人突变
基因捕获法
以农杆菌介导的T一DNA插人突变适用于多 种植物，可以直接在植物基因组DNA中产生稳定 的插人突变，而且插人位点的随机性较强，但是 它只适用于那些容易被T一DNA转化的植物，以 农 杆 菌 介导的T一DNA插人突变适用于多种且常 常会引起的染色体重排现象，使突变体表型与T一 DNA插人无关而难以进行遗传学分析。尽管如此， 近年来将T一DNA插人突变应用于拟南芥还是获 得了广泛的成功。
转座子
转座子是一类在细菌的染色体，质粒或噬菌体之间 自行移动的遗传成分，是基因组中一段特异的具有 转位特性的独立的DNA序列. 转座子是存在于染色体DNA上可自主复制和位移的 基本单位。最简单的转座子不含有任何宿主基因而 常被称为插入序列（IS），它们是细菌染色体或质 粒DNA的正常组成部分 转座(因)子是基因组中一段可移动的DNA序列，可 以通过切割、重新整合等一系列过程从基因组的一 个位置“跳跃”到另一个位置。
基因敲除技术的发展和应用
基因敲除技术的发展和应用基因敲除技术是一种将特定基因从生物体中去除的方法，它是现代生命科学领域中一项重要的技术成果。
通过基因敲除技术，科学家们可以研究某一特定基因对生物体的影响，从而探究其在生命活动中的作用和功能。
近年来，随着技术的不断发展和完善，基因敲除技术已经被广泛应用于医学研究、药物研发、农业生产等多个领域。
一、基因敲除技术的原理及方法基因敲除技术首先要求找到一个目标基因，并使用特定的方法将目标基因从生物体中去除。
常用的基因敲除方法包括：1. CRISPR/Cas9技术CRISPR/Cas9技术是一种先进的基因编辑技术，其原理是结合基因组的特定地点的DNA序列和Cas9蛋白，同时在该位置展开双链切割，以实现基因敲除。
此方法常用于动物实验中，对于细胞实验和基因组编辑具有广泛应用。
2. RNA干扰（RNAi）技术RNA干扰技术是通过合成特定的RNA分子干扰目标基因的正常功能，从而实现基因敲除。
在这种技术中，合成小的RNA分子，称为siRNA，它能够靶向那些启动转录的基因，使这个基因不再表达。
RNAi技术被广泛用于细胞实验，并被视为一种潜在的治疗癌症的技术。
3. Zinc Fingers（ZF）技术锌指蛋白技术是一种利用锌指蛋白靶向DNA序列来实现基因敲除的方法。
锌指蛋白是一种能够结合到DNA特定序列的蛋白质，可用于将DNA 分子切断或将其连接到其他DNA 分子上。
通过上述基因敲除方法，科学家们可以有效地去除目标基因，进而探究该基因在生物体活动中的作用和功能。
二、基因敲除技术在医学研究中的应用基因敲除技术在医学研究中的应用十分广泛。
通过基因敲除技术，科学家们可以研究某一特定基因的功能，以探讨其与某些疾病的关系。
例如，最近的一项研究发现，敲除一个名为Hif1a的基因可以减轻肺纤维化的症状，这为开发新型治疗药物提供了有力的理论基础。
此外，基因敲除技术还被用于肉毒杆菌抗毒素的研究中。
肉毒杆菌是一种由细菌产生的有毒物质，可以严重破坏人体神经系统。
基因敲除技术研究进展及其应用
目录
01 一、基因敲除技术的 基本原理和历史发展
02
二、基因敲除技术的 最新研究进展
03
三、基因敲除技术的 应用实例
04 四、未来展望
05 参考内容
基因敲除技术是一种重要的分子生物学研究工具，它通过删除或灭活特定基 因，研究基因功能以及其对细胞生命活动的影响。近年来，随着基因敲除技术的 不断发展和优化，其在医学、生物学等领域的应用也越来越广泛。本次演示将介 绍基因敲除技术
在工业领域，基因敲除技术主要应用于微生物工程、生物制药等领域。利用 基因敲除技术，科学家们可以改造微生物和菌种，提高微生物的工业发酵效率和 产率，为生物制药和化工生产等领域提供有效手段。
近年来，基因敲除技术的研究进展迅速，新的技术和应用不断涌现。例如， 通过结合基因编辑技术，科学家们可以实现对特定基因的精细调控，从而达到更 高的目标基因敲除效率；此外，利用基因敲除技术，科学家们还成功培育出多种 新型生物材料和工业菌种，为相关领域的发展带来了新的突破。
四、未来展望
随着基因敲除技术的不断发展和优化，未来其在医学、农业、生物学等领域 的应用前景将更加广阔。但同时也面临着一些挑战和问题。首先，如何提高基因 敲除技术的准确性和效率仍然是需要解决的重大问题。其次，如何将基因敲除技 术应用到更多的
生物物种和细胞类型中也是一个具有挑战性的问题。此外，如何在确保有效 性的同时降低基因敲除技术的成本和风险也是一个需要和研究的问题。
1、优点
基因敲除技术具有许多优点。首先，它是一种精确的基因编辑手段，可以准 确地在特定位置敲除或替换基因。其次，基因敲除技术可以用于研究基因的功能 及其对细胞生命活动的影响，有助于深入了解生命的本质和规律。此外，基因敲 除技术还可以用
应用拟南芥植物建立基因敲除模型
应用拟南芥植物建立基因敲除模型拟南芥作为一种模式植物，对于生物科研领域具有重要的意义。
虽然这种植物看起来普普通通，但它的基因组非常简洁，仅有5条染色体，基因数目少，基因结构清晰明了，这使得研究人员更容易进行基因研究。
因此，建立拟南芥植物模型以及研究拟南芥的基因功能，对于推动植物基因研究有着不可忽视的作用。
在现代分子生物学中，基因敲除技术被广泛应用。
该技术通过破坏靶向基因进行基因敲除，以研究基因功能和相关的生物学特性。
基因敲除技术可以被用于很多不同的领域中，例如药物开发、疾病治疗和农业领域。
然而，要成功进行基因敲除实验，需要一个可靠、简便的模型来完成实验操作，而拟南芥植物就是一个非常好的模型。
建立拟南芥的基因敲除模型，需要一系列的步骤。
首先，需要挑选一个合适的基因进行敲除，这可以通过文章阅读、基因数据库查询和生物信息学分析来确定目标基因。
然后，需要构建基因敲除载体，这是一个非常重要的步骤。
基因敲除载体可以采用多种方法来进行构建，包括使用克隆和组装技术来构建DNA重组载体或者直接采用CRISPR/Cas9技术进行特定的基因敲除。
接着，需要将敲除载体转化到拟南芥植物中，通过转基因技术将攻击DNA片段插入到植物细胞DNA中。
最后，利用单倍体转化或者农杆菌介导的植物转化方法将敲除载体载入到拟南芥细胞中，确保准确的基因编辑结果，可以在修改后的表型中得到荧光和光滑分析，证实基因敲除有效。
一旦转化工作完成，优化转化方法，则需要进行遗传分析和验证。
基因敲除模型可以帮助人们快速解决许多基因学问题，从而促进生命科学的进展，也为机体的疾病治疗提供了新的解决方案。
同时，随着基因敲除技术不断发展，不仅在基础科学、农业等领域发挥越来越广泛的作用，而且已经开始向临床研究方向进军。
总之，由于拟南芥植物的基因组特点和研究技术成熟，为建立基因敲除模型提供了有利条件。
盼望着未来拟南芥基因研究取得更多的重要突破。
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CHEN Qi-Jun1, XIAO Yu-Mei2,*, WANG Xue-Chen2,**, ZHOU Hai-Meng1 1Department of Biological Science and Biotechnology, Tsinghua University, Beijing 100084; 2The National Key Laboratory of Plant Physiology and Biochemistry, College of Biological Sciences, China Agricultural University, Beijing 100094
植物生理学通讯 第 ４０ 卷 第 １ 期，２００４ 年 ２ 月
２ 转座子插入突变 使用转座子进行插入突变的优点有：（１ ）
转座子能够在转座酶的存在下从插入位点剪切下 来，造成突变体反转。采用这种方法可进一步确 证突变体表型是否由转座子插入突变引起。（２ ） 大多数转座的位点偏好于连锁位点，所以如果有 一个可转座的元件靠近目的基因，那么可转座的 元件即会高效地移动并插入目的基因。因此，即 使在突变体库中没有发现期望的插入位点，仍可 以采用转座子在连锁位点上的转座获得目的基因被 插入失活的品系。（３ ）当一个基因家族的多个 成员沿染色体串连排列时，可采用复制型的转座 系统（供体位点的转座子元件被复制而不是被剪 切，由复制形成的转座子元件转座到新的位点） 创建该基因家族全部成员均被敲除的突变体。如 果目标是用转座子随机插入的方法获得插入位点在 基因组达到饱和的突变体库，转座位点的偏好性 则是一个明显的缺点。为了解决这个问题，人们 发展了双组分的转座系统，如激活 ／ 解离 （Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ／Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，Ａｃ／Ｄｓ）转座系统和增 强子 ／ 抑制子 － 突变子（Ｅｎｈａｎｃｅｒ／Ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ－ ｍｕｔａｔｏｒ，Ｅｎ／Ｓｐｍ）转座系统。在双组分的转座 系统中，可以用负选（反选）的方法去掉紧密 连锁的转座位点；同时，还可以用负选的方法去 掉转座酶，获得稳定的插入品系。对于一些自身 没有适合的转座系统可用的物种来说，可以采用 来自其它物种的异源转座系统。目前，已将两套 来自玉米的可转座元件 Ａｃ／Ｄｓ 和Ｅｎ／Ｓｐｍ 改造修饰 后用在烟草、番茄和拟南芥等植物中［ ２ ］。 ２ ． １ Ａ ｃ ／ Ｄ ｓ 转座系统 Ａｃ／Ｄｓ系统由自主性元件 （Ａ ｃ ）和非自主性元件（Ｄ ｓ ）构成。Ａ ｃ 元件 编码的转座酶与 Ａｃ和 Ｄｓ元件的末端倒转重复序列 结合，催化 Ａｃ 和 Ｄｓ 元件转座到基因组的新位点， Ｄｓ 元件能够在转座酶的作用下移动。去除 Ａｃ元件 的末端倒转重复序列可使其自身不能转座，但可 以产生转座酶。采用这种改造过的两组分系统可 以产生稳定的插入。这时，通过遗传杂交引入自 主性元件，转座子插入序列可以重新移动。因 此，Ａｃ／Ｄｓ 转座子插入系统只需要少量的转基因 品系（启动品系）作为转座源即可。
定点敲除（即定点突变的方法使目的基因完 全失活）是最直接的研究基因功能的方法，但是 对开花植物而言，现在还没有高效、实用的定点 突变技术。目前较为有效的方法是大规模的随机 插入突变，它为在基因组范围内敲除掉拟南芥任 何一个基因提供了可能。这项技术具有效率高、 基因失活完全、容易分离鉴定被插入引起失活的 目的基因等优点［２］。随机插入突变可分为 Ｔ－ＤＮＡ 插入突变和转座子插入突变。 １ Ｔ － Ｄ Ｎ Ａ 插入突变
农杆菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）介导
的 Ｔ － Ｄ Ｎ Ａ 转化可用于不同的植株中进行插入突 变。使用 Ｔ － Ｄ Ｎ Ａ 插入突变的优点有：（１ ） 能 直接在基因组 ＤＮＡ 中产生稳定的插入突变，不需 要额外的步骤来稳定 Ｔ － Ｄ Ｎ Ａ 插入序列；（２ ）尽 管最近的研究表明，Ｔ－ＤＮＡ 标签在拟南芥基因组 中的分布并非完全是随机的，而是偏好插入基因 密度高的染色体区以及基因的 ５’和 ３’调控区［３］， 但这种偏好性并不影响用 Ｔ－ＤＮＡ 插入突变位点来 饱和基因组。另一方面，Ｔ － Ｄ Ｎ Ａ 插入突变也有 不利的因素：它只适用于那些容易被 Ｔ－ＤＮＡ 转化 的植物；Ｔ － Ｄ Ｎ Ａ 整合还会出现一些复杂的模式， 如 Ｔ－ＤＮＡ 边界的质粒序列随 Ｔ－ＤＮＡ 一起整合到基 因组 ＤＮＡ 中，同一植物常常会有多个拷贝的插入 序列等复杂情况的出现，使得用 ＰＣＲ 方法进行的 反向遗传学分析变得困难；此外，它常常会出现 由 Ｔ－ＤＮＡ 整合引起的各种染色体重排现象，以致 突变体表型与 Ｔ－ＤＮＡ 插入无关，而难以对插入位 点进行遗传学分析［ ２ ］ 。尽管如此，但近年来发展 了农杆菌介导的 Ｔ－ＤＮＡ 转化拟南芥的高效方法， 可以快速获得成千上万的拟南芥 Ｔ－ＤＮＡ 插入突变 体［４］，因此 Ｔ－ＤＮＡ 插入突变在拟南芥中得到广泛 利用。
收稿 ２００３－０４－２８ 修定 ２００３－０７－２１ 资助 国家重点基础研究专项经费项目（Ｇ１９９９０１１７００）。 ＊ 同为第一作者。 ＊ ＊ 通讯作者（Ｅ－ｍａｉｌ：ｘｃｗａｎｇ＠ｐｕｂｌｉｃ．ｂｔａ．ｎｅｔ．ｃｎ， Ｔｅｌ：０１０－
６２８９２７０６）。
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用可转座元件插入突变时，应当仔细考虑重
新获得新的插入位点的策略。最常用的两个策略 是正选策略和反选策略。如图 １－ａ 所示，正选策 略是根据转座子元件是否从抗性基因内部剪切掉， 从而使抗性基因恢复抗性可转座的元 件（Ｄ ｓ 元件）的转座作用（即剪切事件）发生 在减数分裂之前，但有时转座子的转座也能在减 数分裂后发生。由于 Ａｃ 和 Ｄｓ 元件均是杂合状态， 经减数分裂后含 Ａｃ 元件和含 Ｄｓ 元件的染色体可能 随机分配到同一个大孢子或小孢子，也可能随机 分配到不同的大孢子或小孢子中。前者由于有 Ａｃ 元件的存在， 因此Ｄｓ元件仍然可以发生转座； 而后 者由于不存在 Ａｃ 元件，所以 Ｄｓ 元件不会发生转 座，造成一些精、卵细胞含有没有转座的 Ｄ ｓ 元 件，从而形成假阳性 Ｆ ２ 代植株。其次，由于大 于 ５０％以上的转座发生在连锁位点，采用这种策 略获得的许多转座子元件与供体位点是连锁的。 这样，为了使转座子插入位点覆盖整个基因组范 围，需要进行大量的筛选工作。不过，如果我 们的目标是把与供体位点连锁的基因作为插入突变 的靶基因时，这种策略尤其有效。因此，这种 策略可以作为一种定点敲除基因的方法。人们正 在系统地构建各种转座子插入突变体中转座子位点 的遗传图谱，将来可以用这些转座子插入突变体 品系在基因组范围内定点敲除目的基因，即采用 转座子距离目的基因最近的插入突变体品系，根 据转座子在连锁位点的转座频率较高的特性，定 点敲除目的基因。
植物生理学通讯 第 ４０ 卷 第 １ 期，２００４ 年 ２ 月
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图１ 可转座元件的标记策略［５］ ａ．正选策略。在同一Ｔ－ＤＮＡ 上，带有一个抗生素抗性基因（３５Ｓ：：ＨＹＧ）的供体Ｄｓ元件插入到第二个抗生素抗性基因３５Ｓ：：ＳＰＴ 的前导序列中。在 Ａｃ 元件存在时，Ｄｓ 被剪切，３５Ｓ：：ＳＰＴ 基因的抗性得以恢复，导致对链霉素产生抗性。对链霉素和潮霉素 （ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ）都具有抗性的 Ｆ２ 代植株含有从 Ｔ－ＤＮＡ 上的原始位点剪切下来的 Ｄｓ 元件。Ｄｓ 元件转座到连锁位点（第 １ 类）和非 连锁位点（第 ２类）的植株被选择。第 ３类植株是可能会被筛选的假阳性植株。当 Ｄｓ元件在卵细胞中被剪切而在精细胞中没有被 剪切（或者相反）时，会导致这种假阳性植株的出现。 ｂ．反选策略。在同一 Ｔ－ＤＮＡ 上，带有一个抗生素抗性基因（１’：：Ｋａｎ）的供体 Ｄｓ 元件与反选标记基因 ２’：：ｉａａＨ 毗邻。反选 标记基因ｉａａＨ编码的产物可将无毒的萘已酰胺（ＮＡＭ）转化为对植物细胞有毒的物质，因此当植株中存在并表达反选标记基因ｉａａＨ 时植株对 ＮＡＭ 复合物敏感。在 Ａｃ 元件存在时，Ｄｓ 被剪切。对卡那霉素（Ｋａｎ）和 ＮＡＭ 都具有抗性的 Ｆ２ 代植株含有 Ｄｓ 元件， 而不含有 ｉａａＨ 基因，因而 Ｄｓ 元件转座到非连锁位点的植株（第 １ 类）被选择。转座到连锁位点的 Ｆ２ 代植株（第 ３ 类）因含有 ｉａａＨ基因而不被筛选。第 ２类植株为可能会被筛选的假阳性植株。当 Ｄｓ转座的连锁位点处于ｉａａＨ基因的内部时，会导致 ｉａａＨ基 因的失活，使植株对 ＮＡＭ 产生抗性，从而导致这种假阳性植株的出现。
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植物功能基因组研究中的基因敲除技术
陈其军１ 肖玉梅２，＊ 王学臣２，＊＊ 周海梦１
１清华大学生物科学与技术系， 北京 １０００８４； ２中国农业大学生物学院植物生理生化国家重点实验室， 北京 １０００９４
Gene Knockout in Plant Functional Genomics
５％￣１５％。要解决这个问题，可以在 Ｔ－ＤＮＡ 上引 入两个拷贝的反选标记基因。但需要注意的是， ２ 个拷贝的标记基因可能会因为共抑制现象，造 成反选标记基因的失活。反选策略中另一个值得 注意的问题是，尽管 Ｄｓ 元件的转座没有明显的位 点特异性，但研究发现，采用反选策略筛选的非 连锁的转座位点在整个基因组中并非是随机分布 的，而是存在明显的“热点”（ｈｏｔｓｐｏｔ ）部位。 例如，在拟南芥 ２号和 ４号染色体的核仁组织中心 插入位点较密集，插入位点偏向于基因的 ５ ’端 等［ ６ ］。 ２．２ Ｅｎ／Ｓｐｍ 转座系统 Ｔｉｓｓｉｅｒ等［７］对上述Ａｃ／Ｄｓ 转座系统进行了改进，设计成 Ｅｎ／Ｓｐｍ 转座系统。 其中一个改进是可以直接对土壤中生长的植物进行 抗性筛选，而不需要在平板上培养和筛选，这就 大大降低了工作量。另一个改进是 Ｅｎ／Ｓｐｍ 系统的 可转座元件 ｄＳｐｍ 和 Ｓｐｍ 转座酶构建到同一 Ｔ－ＤＮＡ 上，反选位点只有一个，因此可以降低筛选后代