β-葡聚糖测定方法

β-葡聚糖酶活力测定方法(NY/T911-2004)

∙ 1.原理

β-葡聚糖酶能将木聚糖降解成还原性糖。还原性糖在沸水浴条件下可以与3,5-二硝基水杨酸（DNS)试剂反应显色反应。反应液颜色的深度与酶解产生的还原糖量成正比，而还原糖的生成量又与反应液中β-葡聚糖酶的活力成正比。因此，通过分光比色测定反应液颜色的强度，可以计算反应液中β-葡聚糖酶的活力。

∙ 2. 操作

∙ 2.1.标准葡萄糖曲线的制作

2.1.1 吸取PH5.5的0.1M乙酸-乙酸钠+缓冲溶液4.0mL,加入DNS试剂5.0mL，

沸水浴加热5min。用自来水冷却至室温，用水定容至25.0mL,制成标准空白样。

2.1.2 分别吸取葡萄糖溶液1.00mL、2.00mL、

3.00mL、

4.00mL、

5.00mL、

6.00mL

和7.00mL,分别用PH5.5的0.1M醋酸缓冲溶液定容至100mL,配制成浓度为

0.10mg/mL、0.20mg/mL、0.30mg/mL、0.40mg/mL、0.50mg、0.60mg/mL和0.70mg/mL

葡萄糖标准溶液。

2.1.3 分别取上述浓度系列的葡萄糖标准溶液各2.00mL（做两个平行），分别

加入到刻度试管中，再分别加入2.0mL缓冲液94.4)和5.0mLDNS试剂。电磁振荡3s-5s,沸水浴加热5min。然后用自来水冷却到室温，在用水定溶液至25mL。

以标准空白为对照调零，在540min处测定吸光度A值。

以葡萄糖糖浓度为Y轴、吸光度A值为X轴，绘制标准曲线。每次新配制DNS试剂均需要重新绘制标准曲线

∙ 3. 酶样测定

吸取10.0mLβ-葡聚糖溶液,37℃平衡20min。

吸取10.0经过适当稀释的酶液，37℃平衡10min。

∙吸取2.00mL经过适当稀释的酶液（已经过37℃平衡），加入到刻度试管中，再加入5mLDNS试剂，电磁振荡3s-5s。然后加入8.0g/lβ-葡聚糖溶液2.0ml，37℃保温30min,沸水浴加热5min。用自来水冷却至室温，加水定容至25mL，电磁振荡3s-5s。以标准空白样(2.1.1)为空白对照，在540min处测定吸光度A

。

B

∙

∙吸取2.00mL经过适当稀释的酶液（已经过37℃平衡），加入到刻度试管中，再加入8.0g/lβ-葡聚糖溶液2.0ml(已经过37℃平衡),电磁振荡3s-5s。37℃保温30min。加入5mLDNS试剂,电磁振荡3s-5s，以终止酶反应。沸水浴加热5min.

用自来水冷却至室温，加水定容至25mL,电磁振荡3s-5s。以标准空白样(2.1.1)为空白对照，在540min处测定吸光度A。

∙ 3. 计算

∙ 3.1酶活定义：

∙ 1g酶粉或1ml酶液在37℃、pH为5.50的条件下，每分钟从浓度为5mg/mL的β-葡聚糖溶液中降解释放1umol还原糖所需的酶量为一个酶活力单位U。

∙ 3.2 用于酶解反应的稀释酶液中β-葡聚糖酶的活力按式（1）和式（2）计算：

X

D =【(A

E

- A

E

)*K+C

】/(M*t)*1000 (1)

式中：

X

D

-稀释酶液中β-葡聚糖酶的活力，U/ml；

A

E

-酶反应液的吸光度；

A

B

-酶空白样的吸光度；

K-标准曲线的斜率；

C

-标准曲线的截距；

M-葡萄糖的摩尔质量，M(C

6H

12

O

6

)=180.2g/mol；

t-酶解反应时间，min；

1000-转化因子，1mmol=1000umol。

∙ X D值应在0.04U/m~0.08U/ml之间。如果不在这个范围内，应重新选择酶液的稀释度，再进行分析测定。

∙ X=X D*D f (2)

式中：

X-试样中β-葡聚糖酶的活力，U/g(或UmL)；

∙ D f-试样的稀释倍数

酶活力的计算保留三位有效数字。

4.试剂

∙ 4.1 标准葡糖糖溶液：葡萄糖80℃烘干至恒重。标准称取1.000g无水葡萄糖，加PH5.5的0.1M醋酸缓冲溶液溶解，定容至100ml。

4.2 8.0g/lβ-葡聚糖溶液：称取β-葡聚糖0.40g，乙醇

5.0ml润湿β-葡聚糖，

再加入40mlPH5.5醋酸缓冲液，磁力搅拌，同时缓慢加热，至β-葡聚糖完全溶解后，停止加热，继续搅拌30min，用PH5.5的0.1M醋酸缓冲溶液定容至50ml。

4.3 DNS显色剂

4.4 0.1M乙酸-乙酸钠缓冲溶液（PH

5.5）

称取三水乙酸23.14，加入冰乙酸1.70mL。再加水溶解，定容至2000mL。