标准溶液配制范例

实验一硫酸铜标准曲线的制作

一、目的与要求

1、掌握分光光度比色法的基本原理和应用；

2、熟悉标准曲线的意义及掌握制作方法；

3、了解光谱光度法技术的具体内容及应用；

4、了解回归分析法。

二、原理

光电比色法是根据溶液颜色深浅的比较来测定物质含量的一种方法。因此，在原理上应用了有色溶液对光吸收的物理定律即Lambert-Beer定律。

常用的光电比色法：

1．标准曲线法：分析大批样品时，采用此法比较方便，但需要事先制作一条标准曲线（（或称工作曲线），以供一段时间使用。

配制一系列浓度由小到大的标准溶液，在溶液吸收最大的波长下，测出它们的吸光度。在标准溶液的一定浓度范围内，溶液的浓度与其吸光度之间呈直线关系，即被测物质对光的吸收符合Lambert-Beer定律，则必然会得到一条通过原点的直线，即标准曲线（见图1）。

以各标准溶液的浓度为横坐标，相应的吸光度（A）为纵坐标，在方格坐标纸上绘出标准曲线，在制作标准曲线时，测出的数据至少要有三个落在直线上，这样的标准曲线方可使用。

比色测定待测样品时，操作条件应与制作标准曲线时相同。测出吸光度后，从标准曲线上可以直接查出它的浓度，并计算出待测物质以后只要测定条件不变，将测出的样品溶液吸光订值代入该回归方程式，则可计算出样品溶液的浓度。

2．标准管法（即标准比较法）：在相同的条件下，配制标准溶液和待测样样品溶液的有色溶液，并测定它们的吸光度。由两者吸光度的比较，可以求出待测样品溶液的浓度。

待测样品溶液的浓度=待测样品溶液的吸光度

×标准溶液的浓度标准溶液的吸光度

3．标准系数法（即计算因数法）：此法较上两法更为简单。将多次测定标准溶液的吸光度算出平均值后，按下式求出标准系数。

标准系数=

标准液浓度标准液吸光度

4．回归分析法：将制作标准曲线的各种标准溶液浓度的数值，与其相应的吸光度值，

用数理统计中的回归分析法求出一个回归方程式。以后只要测定条件不变，将测出的样品溶液吸光度值代入该回归方程式，则可计算出样品溶液的浓度。

三、操作与计算

1．硫酸铜贮备标准液的配制（含铜量20000μg/ml）:精确称取CuSO4·5H2O 39.261g，置于100ml烧杯中，用0.05mol/L硫酸溶解后，移入500ml容量瓶中，用少量0.05mol/L硫酸冲洗烧杯3次，洗液一并转入容量瓶中，用0.05mol/L硫酸稀释至刻度，将该液放置阴凉处，如发现沉淀混浊，应重新配制。

2．应用标准液的配制：用5ml移液管，按下表要求，将硫酸铜贮备标准液用 0.05mol/L 硫酸在中号试管内稀释，摇匀，置阴凉处备用。

编号应用标准液浓度

（μg/ml）

贮备标准液

（20000μg/ ml，ml）

0.05mol/L硫酸

（ml）

1 1000 0.25 4.75

2 2000 0.50 4.50

3 3000 0.75 4.25

4 4000 1.00 4.00

3．绘制硫酸铜标准曲线：分别从编号试管中，吸取硫酸铜应用标准液，加到光径1cm 的比色杯中。用分光光度计，以0.05mol/L硫酸作空白调零点，在690nm波长处，测定1-4号试管中溶液的吸光度（A）；每一溶液重复测3次，取其平均值，以各试管浓度为横坐标，各试管溶液的吸光值为纵坐标，用坐标纸绘制出硫酸铜标准曲线。

4．未知硫酸铜溶液浓度的计算：取未知硫酸铜溶液加入比色杯中（若过浓可稀释5-10倍），用分光光度计，在690nm波长处测定吸光度。以此吸光度值可在硫酸铜标准曲线上查出未知硫酸铜溶液的浓度。

思考题：

1．标准曲线是如何设计的，有何临床意义？

2．未知硫酸铜溶液的浓度是如何求出的？

3．何谓回归分析法？

（库热西·玉努斯）

附：光谱光度法分析技术

利用各种化学物质所具有的发射、吸收或散射光谱谱系（带、线）的特征，来确定该物质的性质、结构和含量的技术称为光谱光度分析技术。

光谱光度分析技术包括发射光谱分析、吸收光谱分析和散射光谱分析三大类，与其对应的仪器列表如下（表1）：

表1 光谱光度分析与其对应的仪器

光谱分析类型

对应仪器名称

发射光谱

1、各种摄谱仪

2、火焰光度法

3、原子荧光光谱仪

4、荧光比色计 吸收光谱

1、各种光电比色计

2、各种可见光区及紫外光区分光光度计

3、各种红外光区分光光度计

4、原子吸收分光光度计 散射光谱

1、各种浊度计

2、各种乳光计

3、各种生物光度计

生物体内有许多物质成分含量甚微，不能用重量分析法或溶量分析法去测定，而常用比色法来测定，该法灵敏、迅速、准确，是当前常用的一种定量分析法。 一、比色法原理

比色法是根据溶液颜色深浅的比较来测定物质含量的一种方法，在原理上应用了有色溶液对光吸收的物理定律——Lambert-Beer 定律。 Lambert 定律：

一束单色光线通过一有色溶液后，由于溶液吸收了一部分光能，透过光的强度就会减弱。若溶液的浓度不变，溶液的厚度越大（即在溶液中所经过的途径越长）。透过光的减弱也越显著。

若I 0=光线通过溶液前的强度（入射光强度） Ⅰ=光线通过溶液后的强度（透过光强度） b=溶液的厚度 则 ……①

常数K1的数值随光线的波长和溶液的性质而改变。Lambert 定律适用于一切溶液（图

2）。

Beer 氏定律：

一束单色光线通过一有色溶液后，透过光线强度就会减弱。若溶液的厚度不变，则溶液的浓度越大，透过光线强度减弱就越显著。

若C=溶液的浓度

……………②

Ⅰ。

Ⅰ

图2