实验报告-硝酸还原酶活性的测定

首都师范大学生命科学学院实验报告

课程名称植物生理实验实验时间2010.3.31 成绩

姓名唐倪文班级3 学号1090800032 实验题目硝酸还原酶活性的测定

一、实验原理

硝酸还原酶是植物氮素作用中的关键性酶，硝酸还原酶作用于NO

3

-使之还原为

NO

2

-。

NO

3- + NADH++ H+ → NO

2

-+ NAD++ H

2

O

产生的NO

2

-可以从植物组织渗透到外界溶液中，积累在溶液中。因此，测定反

应液中NO

2

-含量的增加即表明酶活性的大小。

NO

2

-含量的测定----磺胺法

NO

2

-与磺胺和 -萘胺在酸性条件下生成粉红色化合物，用比色法在520nm下读取光密度值。

二、实验用品

1.材料：完全营养的小麦苗，缺氮培养的小麦苗

2.仪器和用具：722型分光光度计，剪刀，真空泵，电子天平，温箱，烧杯，移液枪，tip头（两种规格：1000μl，200μl）

三、实验步骤

1.分别配制反应液于小烧杯中

(1)0.1M磷酸缓冲液5ml + 蒸馏水5ml

(2)0.1M磷酸缓冲液5ml + 0.2MKNO

3

5ml

2. NO

2

-的获得

(1)称取新鲜叶片0.5g共四份,剪成小片,分别置于小烧杯内的反应液中。

(2)在真空干燥器中抽气20min,使叶片沉于溶液底部,溶液即可渗入组织内取代其

中的空气,内部产生的NO

2

-可渗透到外部溶液中。

3.将小烧杯转到30℃温箱,使其不见光,保温20min。

4.用5μg/ml NaNO

2

母液配制标准梯度溶液5、4 、 3 、 2 、 1 、 0.5 、0.1、0 μg/ml。

5.吸取不同浓度的NaNO

2

1ml于试管中，加入磺胺试剂2ml及α-萘胺试剂2ml，混合均匀，在60℃水浴中保温20min，于比色杯中，在520nm下进行比色，读取光

密度，然后做出光密度—浓度曲线，以光密度为纵坐标，NaNO

2

浓度为横坐标。具体步骤及结果如下表和下图所示。

试剂管号

1 2 3 4 5 6 7 8 NaNO

2

母液(ml) 0 0.02 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 蒸馏水(ml) 1 0.98 0.9 0.8 0.6 0.4 0.2 0

1％磺胺(ml) 2 2 2 2 2 2 2 2

0.2％α-萘胺

(ml)

2 2 2 2 2 2 2 2

每管亚硝酸氮含

量（μg）

0 0.1 0.5 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0

每管NaNO

2

浓度

（μg/ml）

0 0.1 0.5 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 光密度0 0.015 0.052 0.104 0.202 0.302 0.396 0.493 标准曲线：

5. 吸取反应液各1 ml于试管中加入磺胺和 -萘胺各2 ml,60℃水浴20min,生成

粉红色化合物.用比色法在520nm下读取光密度值，从标准曲线上查得NO

2

-的含量，小麦幼苗完全培养液缺N培养液

KNO

3H

2

O KNO

3

H

2

O

小麦鲜重(g) 0.51 0.51 0.49 0.48 光密度0.178 0.176 0.065 0.039 亚硝酸钠浓度

（μg/ml）

1.791 1.771 0.654 0.392

亚硝态氮含量

（μg）

1.791 1.771 0.654 0.392 酶活性105.39 104.18 40.04 24.50

6.计算酶活性,以每小时每克鲜重所产生的NO

2-微克数表示（ NO

2

- /h.g）。

完全培养液，KNO

3

酶活性=[(1.791/1)*10]/[0.51*(20/60)]= 105.39

完全培养液，H

2

酶活性=[(1.771/1)*10]/[0.51*(20/60)]= 104.18

缺N培养液，KNO

3

酶活性=[(0.654/1)*10]/[0.49*(20/60)]= 40.04

缺N培养液，H

2

O

酶活性=[(0.392/1)*10]/[0.48*(20/60)]= 24.50 将结果填入上表。

四、实验结果分析

①在完全培养液和缺N培养液中，加KNO

3普遍都要比加H

2

0的酶活性高，说明KNO

3

为酶促反应提供了底物，让酶促反应进行彻底。

②在完全培养液和缺N培养液中，加KNO

3相互比较，加H

2

0的相互比较，完全培养

液的酶活性都要高，说明N诱导了硝酸还原酶，使之活性增大。

五、思考题

1.依据原理，测硝酸还原酶活性的实质是以什么物质的含量来表示的？哪一步影响NO

2

-的浸出量？

答：①实质是以亚硝酸根（NO

2-）的含量来表示的。因为NO

2

-可以从组织内渗到外

界溶液中并积累，因此测定反应溶液中NO

2

-的含量的增加，即表明酶活性的大小。

②真空泵抽气影响NO

2

-的浸出量。因为反复抽气放气，溶液可渗入叶组织取代叶片空气，叶片便沉于溶液底部，酶促反应可以相对完全的进行。

2.为什么做两组溶液，一组培养液中加入H

20和一组培养液中加入KNO

3

的作用是？

答：①培养时做完全培养和缺N培养是因为硝酸还原酶是诱导酶。

②实验时一组加KNO

3一组加H

2

0是因为KNO

3

为酶促反应提供底物，让反应得

以彻底进行。

3.实验前要使材料经一定时间光照，其作用是？

答：让材料进行一段时间光合作用，积累有机物。

4.小烧杯置于30℃，不见光保温的原因是？

答：酶促反应在暗反应下进行，以防光照下叶绿体形成还原型铁氧还蛋白，促使

亚硝酸镁把NO

2-还原成NH

3

。暗反应下反应可阻止NO

2

-的继续反应。

5.第一次30min和第二次20min的作用是？

答①阻止NO

2

-的继续反应

②让NO

2

-和磺胺，α-萘胺反应充分，显色完全。显色反应的速度与重氮化作用及偶联作用的速度有关，温度、酸浓度等都影响显色，同时也影响灵敏度。