RNA的制备及纯度的鉴定ppt

生物制药09303 第七组 指导老师：陈芬
（一） 操 作 方 法
1.背景知识
6.思考问题
2.基本原理
RNA的制备及 纯度的鉴定
5.注意事项
3.仪器试剂
4.工艺过程
背景知识
核糖核酸，简称RNA，主要以单链的形式存在于生物体
内,其高级结构很复杂,它们既担负着储藏及转移遗传信
息的功能,又能作为核酶在细胞内发挥代谢功能。生物体
RNA质量分数 样品液RNA 含量（g/mL） 总体积（mL ） 100 % 6 新鲜肝重（g） 10
操作参照表
管号
0
1 0.2 1.8 2
2 0.4 1.6 2
3 0.8 1.2 2
4 1.0 1.0 2
5 1.2 0.8 2
6 1.6 0.4 2
7 2.0 0 2
RNA标 0 准液/ml 蒸馏水 2 /ml 地衣酚 2 试剂/ml
RNA提取流程
2克动物肝脏组织
研碎
加氯仿异戊醇震荡 离心取上清液
加20mlSDS缓冲盐溶液
加2%乙酸钾乙醇溶液
倒入磨口具塞锥形瓶
放置沉淀离心
加同体积含水酚溶液
洗涤沉淀离心干燥
室温剧烈震荡10分钟
将RNA溶于蒸馏水
水浴分层并离心
得上清液
离心得粗品
• 二.实验过程
• 1.取2g动物肝脏组织，剪成小块，在乳钵种研碎，加 20mLSDS-缓冲盐溶液（见试剂1.）使成均浆，倒入磨口 具塞锥形瓶内，再加同样体积的含水酚溶液，室温下剧烈 振荡10分钟。 • 2.置冰浴中分层，在0-4℃下，以4000rpmn离心15分钟。 吸出上清液，加等体积氯仿－异戊醇，室温下剧烈振荡10 分钟，以4000rpm离心5分钟，或在室温下放置10分钟使 分层。吸出上清液（若有必要，该操作可反复多次），加 2倍体积2% 乙酸钾的乙醇溶液，在冰浴中放置1小时使 RNA沉淀，此沉淀液可在冰箱内较长期存放。
• 3.若要得到干燥制品，可将沉淀液以4000rpm离心10分钟 ，倾去上清液。沉淀用少许75%乙醇、95%乙醇、无水乙 醇各洗1次，同上法离心，倾去乙醇后，空气干燥。 • 4.将RNA（准确称取30mg左右RNA干燥制品）溶于5～10mL 蒸馏水中，离心除去不溶性杂质，得RNA粗品。 • 5.RNA纯度的鉴定 • 一、RNA标准曲线的制定 取8支试管，编号，按表加入试剂。加毕，摇匀，置沸水 浴中加热15min，冷却，测OD670值。以OD670值为纵 坐标，RNA含量（ug/ml）为横坐标绘制标准曲线。
实验器材与试剂
器材：乳钵 、磨口 具塞锥形瓶 (500ml) 天平 、 离心 机（4000rpm）动物肝脏 、紫外可 见分光度计、恒温水浴锅
试剂：
1.SDS-缓冲盐溶液［0.3%SDS-0.1mol/L氯化钠 -0.05mol/L， pH5.0乙酸盐缓冲液］称取1.5gSDS，2.92g氯化钠，2.05g乙酸钠 溶于水中，用乙酸调至pH5.0，最后定容至 500ml。 2.含水酚液：使用前将苯酚重蒸(酚的沸点为181.8℃)并用SDS－缓 冲盐溶液使其饱和。 3.氯仿-异戊醇液：氯仿：异戊醇=24:1(V/V)。 4.含2%乙酸钾的95%乙醇溶液。 5.75%乙醇，95%乙醇、无水乙醇。 6.乙醚 7.RNA标准溶液（须经定磷确定其纯度）：取酵母RNA配成200 g/mL的溶液。 8.地衣酚试剂：先配制0.1%三氯化铁的浓盐酸（分析纯）溶液，实 验前用此溶液作为溶剂配成 0.1%地衣酚溶液。
• 2 掌握RNA纯度鉴定的原理和基本操作 • 3 进一步熟悉可见分光光度计的使用
实验原理
• 细胞内大部分RNA 均与蛋白质结合在一起，以核蛋白的 形式存在。因此分离RNA时必须使RNA 与蛋白质解离， 并除去蛋白质。 • 最常用含水的酚溶液除去蛋白质，去污剂和酚均能抑制 RNA酶活力，有利于制备核酸大分子，以酚水两相系统 分离RNA是将细胞或细胞器置于含有SDS的缓冲盐溶液 中，加等体积水饱和的酚，通过剧烈振荡，然后离心形成 上层水相和下层酚相。 • 实验所用的0.15mol/L缓冲盐溶液系统可使大部分核糖核 蛋白解离，在用酚处理时脱氧核糖核蛋白变性；在低温条 件下，从水相中除去，这样得到的RNA 制品中混杂的 DNA量极低
污染更为有效。
• 3：在提取核酸时，如样品浓度低，则应增加有机溶
剂沉淀时间，－70℃下>30min;－20℃过夜将有助于
增加核酸的沉淀量。 • 4: RNA通常用分光光度计定量，测量在260 nm处的 吸收值（A260）。通常分光光度计A260的读数要介 于0.15-1.0之间才是可靠的，因此RNA提取结束后，
实验步骤
• 一.实验前的准备 • mRNA的分子结构容易受到RNA 酶的攻击反应而 降解,加上RNA 酶极为稳定而且广泛存在,因此在 提取过程中应严格防止RNA 酶的污染并设法抑制 其活性。 • 所用的玻璃器皿需要置于干燥烘箱中 200.0° C烘 烤两小时以上,凡是不能用高温烘烤的材料如塑料 容器等可用0.1%的焦碳酸二乙酯（DEPC）水溶 液处理，再用蒸馏水冲净。
注意事项
• 1：在操作中当加入变性剂氯仿后，为了保证核酸样
品的完整性，操作要轻，尤其在提DNA时，更要避
免剧烈操作
• 2：在沉淀核酸时可用乙醇与异丙醇，乙醇的极性要 强于异丙醇，所以一般用2V乙醇沉淀，但在多糖、 蛋白含量高时，用异丙醇沉淀可部分克服这种污染 ，尤其用异丙醇在室温下沉淀对摆脱多糖、杂蛋白
内共有三种RNA，即编码特定蛋白质序列的信使RNA；
能特异性解读mRNA中的遗传信息、将其转化成相应氨
基酸后加入多肽链中的转运RNA；直接参与核糖体中蛋
白质合成的核糖体RNA。
• mRNA的选择性拼接
合成类RNA
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
RNA的生物合成
RNA/DNA诊断仪
实验目的
• 1 掌握从动物组织中提取RNA的基本原理和操作
二、制品的测定 取0.2~0.5ml制品液于试管中，加蒸馏水稀释至2ml，然后加 2ml地衣酚试剂摇匀，于沸水中煮沸15分钟，冷却，测OD670 。根据测得的吸光度，从标准曲线上查出相当该吸光度的RNA 的含量。 三、 RNA含量的计算 根据测得的光吸收值，从标准曲线上查出相当该光吸收值的 RNA含量。按下式计算出制品中RNA的百分含量： 样品液RNA含量(ug/ml)=标准曲线查到的值× 稀释倍数
要根据大概产量稀释到适当浓度范围，再用分光光度
计测量。A260为1相当于RNA的浓度为40 µg/ml。
问题及答案
• 一、提取制备RNA常用的方法有那几种？
主要有苯酚、异硫氰酸胍、CTAB、LiCl密度梯度、Trizol 等方法。
• 二、制备RNA应注意哪些问题.
1.整个过程应注意预防RNA酶的污染 2.匀浆后加氯仿之前样品可以在-60至-70℃保存至少一 个月。
•
RNA制品继续用氯仿－异戊醇处理，可以进一步除去其 中含有的少量蛋白质。最后用乙醇使RNA自水溶液中沉 淀下来。
• 实验所得制品的核酸含量可用地衣酚显色法测定RNA含 量 。RNA与浓盐酸共热时，即发生降解，形成的核糖继 而转变为糠醛，后者与3，5-二羟基甲苯（地衣酚）反应 呈鲜绿色，该反应需用三氯化铁或氯化铜作催化剂，反应 产物在670nm处有最大吸收。RNA在20～250 g范围内， 光吸收与RNA的浓度成正比。
• 三、地衣酚反应中，干扰RNA的测定因素有哪些 ？如何能减少他们的影响？
1.DNA，地衣酚反应特异性较差，凡戊糖均有此反应， DNA及其他杂质也有影响。故一般测定RNA时，可先测定样 品中DNA含量，再算出RNA含量。 2.蛋白质，本法较灵敏。样品中蛋白质含量高时，应先 用5%三氯醋酸溶液将蛋白质沉淀后再测定，否则将发生干 扰。