甘油脱水酶的研究进展

第32卷 第2期华侨大学学报(自然科学版)Vo l.32 No.2 2011年3月Jo ur nal of H uaqiao U niversity(Natur al Science)M ar.2011

文章编号: 1000-5013(2011)02-0125-05

甘油脱水酶的研究进展

王庆花1,方柏山2

(1.华侨大学化工学院,福建泉州362021;

2.厦门大学化学化工学院,福建厦门361005)

摘要: 甘油脱水酶是微生物发酵法生产3-羟基丙醛和1,3-丙二醇过程中的关键限速酶.文中对甘油脱水酶的结构与功能、作用机制、基因工程研究等情况进行综述,探讨了甘油脱水酶的研究进展并提出一些建议.

关键词: 甘油脱水酶;生物转化法;结构功能;作用机制;基因工程

中图分类号: Q556文献标志码: A

1,3-丙二醇(1,3-PD)作为合成具有优良性质的聚酯和聚氨酯的单体,被认为是本世纪具有广阔应用前景的化工原料.近年来,生物转化法以其利用可再生资源、清洁生产、环境友好型、有利于可持续发展,逐渐成为国内外研究热点.目前,已发现了多种能以甘油为底物发酵生产1,3-PD的菌种,但还没有发现可以利用其他有机物质为底物进行生产的天然菌[1].甘油脱水酶(Glycer ol Dehy dratase, GDH t)是催化甘油转化生成1,3-PD代谢途径中的关键性限速酶.克雷伯肺炎杆菌(K lebsiella p neu-moniae)和丁酸梭状芽孢杆菌(Clostr id ia buty r icum)具有较高的1,3-PD转化率、甘油耐受力和生产强度,备受研究者关注.克雷伯肺炎杆菌编码的是一种依赖辅酶B12的甘油脱水酶,需要在培养基中额外加入价格昂贵的维生素B12.丁酸梭状芽孢杆菌属于严格厌氧菌,其培养条件苛刻,国内研究较少 由于丁酸梭状芽孢杆菌中甘油脱水酶不依赖辅酶[2-3],因而成为新的研究热点.本文主要综述甘油脱水酶(GDH t)的结构与功能、作用机制、基因工程等方面的研究进展

1 甘油脱水酶的结构与功能

1.1 辅酶B12依赖型甘油脱水酶

辅酶B12依赖型GDH t是由 , , 3个亚基组成的二聚体,其结构为( )2[4].辅酶依赖型GDH t 晶体结构中,辅酶B12依赖型的GDH t是 2 2 26个亚基通过非共价键的疏水相互作用缔合成的异六聚体,其中两个 异型三聚体组成了一个对二聚体. 亚基含一个由8个平行的 链构成的丙糖磷酸异构酶(TIM)桶状结构[5] 这个 -桶状结构把活性中心围在中间,所以 亚基是甘油脱水酶最重要的活性中心,活性中心含有必需因子K+的结合位点.维生素B12与GDH t的结合需要K+,而K+的结合能够轻微改变GDH t的空间构象,使其与辅酶结合得更紧密.维生素B12位于TIM桶状结构和 亚基之间.K+离子、底物分子及辅酶的腺苷一侧只与 亚基结合.

底物的结合对酶分子构象产生的变化最大的是在 亚基,其前后倾斜了约3 [4,6].与底物结合后,与辅酶以氢键结合的残基增加了3个,并且键长都明显缩短.这样也导致Co-N键(Co与DBI部分的作用力)被拉长,而Co-N的键长关系到Co-C键的断裂方式(Co-N键的拉长可使Co-C键偏向均裂[7]).Co-C键的均裂是酶促反应的最开始的一步,也是必需的一步.

洪燕等[8-9]通过生物信息学软件分析,证明了 亚基是对辅酶B12失活非常重要的一个区域.GDH t 收稿日期: 2010-06-23

通信作者: 方柏山(1957-),男,教授,主要从事生物反应工程的研究.E-mail:fbs@x .

基金项目: 国家高技术研究发展(863)计划项目(2006A A020103);国家自然科学基金资助项目(20446004,

20676048)

126华侨大学学报(自然科学版) 2011年

的 亚基和 亚基均与辅酶B12结合,辅酶B12的脱氧酰苷基团朝向 亚基,而 亚基主要与辅酶的DBI 部分结合.通过配体与蛋白质结合(Lig and Protein Contacts,LPC)分析, 亚基中有13个氨基酸残基与辅酶的DBI部分以氢键形式结合,底物结合时氢键键长都比未结合时短,作用面积增大,活性中心变窄,作用更强.陈永胜等[10]未检测到甘油脱水酶的单个亚基及亚基两两组合的酶活性,表明甘油脱水酶的单个亚基不能构成活性中心;而将3个亚基按等摩尔比在体外混合则能检测到较低酶活 据此推测,简单的混合未能形成合理的空间构象.

1.2 辅酶B12不依赖型甘油脱水酶

辅酶B12不依赖型GDH t为一个单亚基二聚体结构[11].GDH t是一个由单亚基通过非共价键的疏水相互作用缔合成的二聚体,两个单体呈几乎完美的中心对称,其单体由10个 / 桶状结构组成,氨基酸C端作为高度保守区是与再激活酶结合的位点.

构成GDH t单体核心的是两组5个 -平行结构反向平行排成的桶状结构,其外围绕若干 -螺旋 这个 / 桶状结构与丙酮酸甲酸裂解酶(Pyruvate Form ate-Lyase,PFL)和厌氧性核糖核苷酸还原酶(Anaerobic Ribonucleotide Reductase,ARNR)中的 / 桶状结构相似,底物甘油或1,2-丙二醇正是结合在这个桶状结构中.在此结构中,GDH t,PFL和ARNR外围 -螺旋的数量和位置有明显的不同,若取其10个 片状结构进行比对,其均方根偏差(RM SD)为68nm;若比对区域包括这些外围 -螺旋,则均方根偏差大于80nm,即相似性更低.

GDH t与PFL最保守的区域在C端,分别对应前者的氨基酸残基731~782和后者的702~754,其均方根偏差仅为7nm.这个区域包括一个Gly自由基环、一个 -反向平行和4个 -螺旋,其中的两个 -螺旋位于酶的表面.当GDH t以二聚体形式存在时,这个保守区域位于酶的两个相反方向的表面,经过对GDH t和PFL序列和结构进行比对,发现两者侧链氨基酸具有高度保守性.结晶分析发现,侧链的高保守甘氨酸残基都采用顺式构象,GDH t中的R782对应PFL中的R753是其中最保守的残基.从GDH t和PFL的晶体结构分析来看,这两个残基都从C端的 -螺旋向内延伸,从而与C链上距活性甘氨酸仅隔两个氨基酸的残基形成氢键.Jessica等[11]已通过对R782残基进行定点突变证明其参与了酶催化过程中的质子传递,因此有理由相信,前述C端保守区是GDH t与其再激活酶结合的位点.

2 甘油脱水酶的作用机制

辅酶依赖型GDH t的作用机制已研究得比较透彻,其依赖的辅酶有腺苷酰化钴铵素(Adenosy lco-balamin)和甲基钴铵素(Methylco balamin)两种形式.它们的生化作用不同,前者作为一个辅基辅助酶分子催化,而后者则作为催化甲基转移反应的酶分子的分子伴侣.

依赖腺苷酰化钴铵素的酶至少有两种与辅酶B12结合的模式,即:Base-On模式和Base-Off模式.前者是表示在结合过程中辅酶分子的DBI(5,6-二甲基苯并咪唑)部分与Co原子的化学键断裂,而原酶中的一个组氨酸残基取代其与Co原子结合;Base-Off模式是指这种取代不会发生,DBI部分依然与Co原子结合,而DBI部分与原酶中的一些氨基酸残基相结合维持其稳定性.Base-Off模式的典型代表即为依赖辅酶B12型甘油脱水酶(GDH t)和二醇脱水酶(DDH).

在K+和如甘油等底物存在的条件下,辅酶B12与GDH t结合,其Co-C键发生了均裂,产生一个5 -脱氧腺苷自由基团.这个腺苷基团是催化过程中关键的部分,它将甘油的C1原子上的H原子掠夺过来,自己转变成脱氧腺苷,而底物形成了一个甘油基团.与此同时,C2原子上的H与C1原子上的OH交换,形成H OCH2- C H-CH(OH)2中间态 此物将H原子从5 -脱氧腺苷上夺回来后迅速脱水成为1,3-PD,5 -脱氧腺苷自由基,并与钴胺素结合重新生成维生素B12;然后,在第2个底物分子与GDH t结合后,重新可逆均裂,释放自由基团,进行催化.这所有的过程都被认为是在 亚基的TIM 桶区域中进行[5].

Stubbe等[12]报道一类新型的酶 这类酶借助S-腺苷甲硫氨酸(SAM)代替辅酶B12催化反应,称之为SAM依赖型酶[13].它们都含有一个与[4Fe-4S]基团相匹配的3~4个彼此间隔的半胱氨酸残基基团[14-15] 尽管这类酶根据底物不同而需要不同的辅因子,但其催化机理相同[16].