测定糖化酶活性的方法
糖化酶发酵、提取及活力测定
SHANDONGＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹＯＦＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ发酵工艺学实验报告糖化酶发酵、提取及活力测定实验学院：生命科学学院专业班级：生物工程1602项目组成员：刘松良、张金中、蔡超、何建雨、周钻钻指导教师：王丽娟2018年6月糖化酶发酵、提取及活力测定实验何健雨王丽娟生命科学学院生工1602班1. 实验目的(1)了解黑曲霉生长特性,学习糖化酶发酵工艺；(2)了解黑曲霉生长特性,学习糖化酶发酵工艺。
(3)学习并掌握糖化酶活力测定方法2. 实验原理葡萄糖淀粉酶( glucoamylase,EC.3.3.13)系统名为淀粉a-1,4-葡聚糖葡萄糖水解酶,俗称糖化酶,是国内酶制剂中产量最大的品种。
糖化酶对淀粉分子的作用是从非还原性末端切开a-1,4键,也能切开a-1,3键和a-1,6键,生成葡萄糖。
生产糖化酶常用的菌种是黑曲霉,将活化好的黑曲霉制成孢子悬浮液,转接接到三角瓶直接进行发酵,或转接到三角瓶作为种子,进行一次扩大培养后,再转接到发酵罐进行糖化酶发酵。
黑曲霉糖化酶是一种胞外酶。
首先采用过滤法将菌体等杂质除去,继而对滤液进行浓缩,最后用有机溶剂如乙醇将酶沉淀出来,对沉淀物进行干燥,加工成成品。
糖化酶有催化淀粉水解的作用,能从淀粉分子非还原性末端开始,分解a-1,4键,生成葡萄糖。
葡萄糖分子中含有的醛基能被次碘酸钠氧化,过量的次碘酸钠钠,酸化后析出碘,再用硫代硫酸钠标准溶液标定,计算酶活力。
酶活力定义:1g固体酶粉(或1mL液体酶),于559CpH4.6的条件下,1h分解可溶性淀粉产生1mg葡萄糖,即为一个酶活力单位,以U/mL(U/g)表示。
3. 实验材料优质大麦芽粉、大米粉、酒花；耐高温-α淀粉酶、糖化酶；乳酸（磷酸）；0.025 mol/L碘液；温度计（100℃）、恒温水浴锅、糖度计、布氏漏斗、分析天平、纱布、玻璃仪器。
4. 方法步骤待测酶液的制备:称取酶粉1-2g,精确至0.0002g,先用少量的乙酸缓冲液溶解,并用玻璃棒捣研,将上请液小心倾入容量瓶中。
糖化酶活性检测试剂盒说明书__微量法UPLC-MS-4240
糖化酶活性检测试剂盒说明书微量法UPLC-MS-4240100T/48S试剂名称规格保存条件提取液液体70mL×2瓶2-8℃保存试剂一粉剂×2瓶2-8℃保存试剂二液体18mL×1瓶2-8℃保存标准品粉剂×1支2-8℃保存溶液的配制：1、试剂一：临用前取1瓶加入10mL提取液，充分混匀后沸水浴直至溶解（约10min），2-8℃保存4周；2、标准品：10mg无水葡萄糖，临用前加1mL提取液溶解为10mg/mL的葡萄糖标准品备用，2-8℃保存两周；糖化酶，即葡萄糖淀粉酶（EC3.2.1.3），又称γ-淀粉酶。
糖化酶是由一系列微生物分泌的，具有外切酶活性的胞外酶，主要作用是从淀粉、糊精、糖原等碳链上的非还原性末端依次水解α-1,4糖苷键，切下一个个葡萄糖单元，对于支链淀粉，当遇到分支点时，它也可以水解α-1,6糖苷键由此将支链淀粉全部水解成葡萄糖。
多应用于酒精、白酒、抗生素、氨基酸、有机酸，甘油，淀粉糖等工业中，是我国重要的工业酶制剂之一。
糖化酶将可溶性淀粉生成葡萄糖，碱性条件下，葡萄糖与3,5-二硝基水杨酸共热后生成红棕色化合物，在540nm 处有最大光吸收，在一定范围内葡萄糖的量与反应液颜色深浅成正比，以此测定糖化酶的活力。
Soluble Starch Glycosylase GlucoseGlucose+3,5-Dinitrosalicylic Acid3-Amino-5-Nitrosalicylate（540nm）注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。
如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
天平、低温离心机、可见分光光度计/酶标仪、微量玻璃比色皿/96孔板、恒温水浴锅、研钵/匀浆器，超声破碎仪、冰和蒸馏水。
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）1.按照组织质量（g）：提取液体积（mL）为1：5~10的比例（建议称取约0.1g，加入1mL提取液）加入提取液，冰浴匀浆后于4℃，10000g离心10min，取上清置于冰上待测。
糖化酶活力测定(精)
糖化酶活力测定1. 定义1g 固体酶粉(或 1ml 液体酶,于 40℃、 pH 值为 4.6的条件下, 1h 分解可溶性淀粉产生 1mg 葡萄糖,即为 1个酶活力单位,以 u/g(u/ml表示。
2. 原理糖化酶有催化淀粉水解的作用,能从淀粉分子非还原性末端开始,分解α-1,4-葡萄糖苷键生成葡萄糖。
葡萄糖分子中含有醛基, 能被次碘酸钠氧化, 过量的次碘酸钠酸化后析出碘,再用硫代硫酸钠标准溶液滴定,计算酶活力。
3. 试剂和溶液(1乙酸-乙酸钠缓冲溶液(pH 为 4.6。
称取乙酸钠(CH3COONa·3H2O 6.7g ,溶于水中,加冰乙酸(CH3COOH 2.6ml ,用水定容至 1000ml 。
配好后用 pH 计校正。
(2硫代硫酸钠标准溶液(Na2S2O3, 0.05mol/L。
(3碘溶液(1/2I2, 0.1mol/L。
(4氢氧化钠溶液(NaOH , 0.1mol/L。
(5 200g/L可溶性氢氧化钠溶液。
(6硫酸溶液(2mol/L。
(7 20g/L可溶性淀粉溶液。
(8 10g/L淀粉指示液。
4. 仪器和设备恒温水浴锅、秒表、比色管、玻璃仪器。
5. 步骤(1 待测酶液的制备称取酶粉 1~2g , 精确至 0.0002g (或吸取液体酶 1.00ml , 先用少量的乙酸缓冲液溶解, 并用玻璃棒捣研, 将上清液小心倾入容量瓶中。
沉渣部分再加入少量缓冲液,如此捣研 3~4次,最后全部移入容量瓶中,用缓冲液定容至刻度(估计酶活力在 100~250u/ml范围内,摇匀。
通过 4层纱布过滤,滤液供测定用。
(2测定于甲、乙两支 50ml 比色管中,分别加入可溶性淀粉 25ml 及缓冲液 5ml ,摇匀后,于 40℃恒温水浴中预热 5min 。
在甲管(样品中加入待测酶液 2ml , 立刻摇匀, 在此温度下准确反应 30min , 立刻各加入氢氧化钠溶液 0.2ml , 摇匀,将两管取出迅速冷却,并于乙管(空白中补加待测酶液 2ml ,吸取上述反应液与空白液 5ml ,分别置于碘量瓶中,准确加入碘溶液 10ml ,再加氢氧化钠溶液 15ml ,摇匀,密塞,于暗处反应15min 。
实验十九 (6) 糖化型淀粉酶活力测定
糖用次碘酸钠法定量测定。以单位时间内分解α–
１，４糖苷键生成葡萄糖所需的酶量为酶的活力 单位。
二、实验原理
糖化型淀粉酶可催化淀粉水解生成葡萄糖。本实验在一定条件下用一定量的糖化 型淀粉酶作用于淀粉，然后用碘量法测定所生成的葡萄糖的含量来计算淀粉酶的 活力。 碘量法定糖原理： 淀粉经糖化酶水解生成葡萄糖，葡萄搪具有还原性，其羰基易被弱氧化剂次碘酸 钠所氧化：
实验十九
糖化型淀粉酶活力测定
一、实验目的
1、 学习碘量法测定葡萄糖含量的原理。
2、 了解糖化型淀粉酶活力的测定方法和操作。
糖化酶在工业生产中的应用
糖化酶是淀粉糖化发酵生产酒精和葡萄糖浆的主要酶类。 特别是酿酒酵母利用淀粉原料发酵时，淀粉液化后的糖化 作用是必不可少的工序，因为大多数酿酒酵母只能利用可 发酵的糖进行酒精发酵。 糖化酶不仅用于酒类、酒精生产和葡萄糖浆的制取，还 广泛地用于抗生素、氨基酸、有机酸的生产。糖化酶是我 国产量最大、应用最广的酶制剂之一。
三、试剂与仪器
1.糖化酶试剂： 2. 仪器
2%可溶性淀粉溶液
0.1 mol/L的HAc-NaAc缓冲液(pH4.6) 0.1 mol/L碘液； 0.1 mol/L氢氧化钠溶液 20%氢氧化钠溶液
酸式滴定管
滤纸 烧瓶 漏斗 移液管
2.0 mol/L硫酸溶液
0.05 mol/L硫代硫酸钠溶液 0.5%淀粉指示剂。
COONa
3NaOI ＝NaIO3+2NaI
NaIO3+5NaI+3H2SO43Na2SO4+3H2O+3I2
未与葡萄糖作用的次碘酸钠在碱性溶液中歧化生成NaI和NaIO3，当酸化时NaIO3 又恢复成I2析出，用Na2S2O3标准溶液滴定析出的I2，从而可计算出葡萄糖的含量。 I2＋2Na2S2O3 = Na2S4O6 ＋ 2NaI
糖化酶
我国糖化酶的研究概况糖化酶是世界上生产量最大应用范围最广的酶类，介绍了糖化酶的结构组成、特性、生产、提取、活力检测以及提高酶活力的研究。
主要的内容包括：一、糖化酶的简介糖化酶是应用历史悠久的酶类，1 500年前，我国已用糖化曲酿酒。
本世纪2O年代，法国人卡尔美脱才在越南研究我国小曲，并用于酒精生产。
50年代投入工业化生产后，到现在除酒精行业，糖化酶已广泛应用于酿酒、葡萄糖、果葡糖浆、抗菌素、乳酸、有机酸、味精、棉纺厂等各方面，是世界上生产量最大应用范围最广的酶类。
糖化酶是葡萄糖淀粉酶的简称(缩写GA或G)。
它是由一系列微生物分泌的，具有外切酶活性的胞外酶。
其主要作用是从淀粉、糊精、糖原等碳链上的非还原性末端依次水解a一1，4糖苷键，切下一个个葡萄糖单元，并像B一淀粉酶一样，使水解下来的葡萄糖发生构型变化，形成B—D一葡萄糖。
对于支链淀粉，当遇到分支点时，它也可以水解a一1，6糖苷键，由此将支链淀粉全部水解成葡萄糖。
糖化酶也能微弱水解a一1，3连接的碳链，但水解a一1．4糖苷键的速度最快，它一般都能将淀粉百分之百地水解生成葡萄糖。
二、糖化酶的结构组成及分类糖化酶在微生物中的分布很广，在工业中应用的糖化酶主要是从黑曲霉、米曲霉、根霉等丝状真菌和酵母中获得，从细菌中也分离到热稳定的糖化酶，人的唾液、动物的胰腺中也含有糖化酶。
不同来源的淀粉糖化酶其结构和功能有一定的差异，对生淀粉的水解作用的活力也不同，真菌产生的葡萄糖淀粉酶对生淀粉具有较好的分解作用。
糖化酶是一种含有甘露糖、葡萄糖、半乳糖和糖醛酸的糖蛋白，分子量在60 000 到1 000 000间，通常碳水化合物占4％ 18％。
但糖化酵母产生的糖化酶碳水化合物高达80％，这些碳水化合物主要是半乳糖、葡萄糖、葡萄糖胺和甘露糖。
三、糖化酶的特性1、糖化酶的热稳定性在糖化酶的热稳定性机理及筛选热稳定性糖化酶菌株上。
工业上应用的糖化酶都是利用它的热稳定性。
一般真菌产生的糖化酶热稳定性比酵母高，细菌产生的糖化酶耐高温性能优于真菌。
糖化酶活力测定
3.取上述反应液5ml于三角瓶中，加入0.1N碘液 5ml，缓慢加入0.1N NaOH溶液 5ml ，(注意： 加碱速度不能过快,否则过量NaIO 来不及氧 化C6H12O6 而歧化为不与C6H12O6反应的 NaIO3 和NaI ,使测定结果偏低) 摇匀，在暗处 放置15min后加入1N硫酸2ml；
测定糖化酶的方法有次碘酸钠法、兰–爱 农法（ＳＰ法） 、Schoorl法（ＤＵ法）和 对硝基苯酚葡萄糖法（ＮＰＧ法）等方法。 本试验测定糖化酶活力采用次碘酸钠法。糖 化酶以可溶性淀粉为底物在一定条件下进行 反应,反应生成得葡萄糖用次碘酸钠法定量测 定。以单位时间内分解α–１，４糖苷键生 成葡萄糖所需的酶量为酶的活力单位。当酶 的反应条件不相同时,酶活力单位定义也有所 差别。糖化酶的最适pH范围是4～5,最适应温 度范围是50～60℃。
因此，1mol葡萄糖与1molI2 相当。
6.析出的;2Na2S2O3 =Na2S4O6 +2NaI
没有葡萄糖的情况
1.I2 与 NaOH作用: I2 +2 NaOH=NaIO +NaI +H2O
2、NaIO在碱性条件下发生歧化反应:
3 NaIO=NaIO3 +2 NaI 3、总反应
6.析出的I2 可用标准Na2S2O3 溶液滴定之: I2 +2Na2S2O3 =Na2S4O6 +2NaI
三、试剂与器材
1.糖化酶试剂； 2.微量滴定管、滴定台、试剂瓶、试管、三角
瓶、pH计、电子天平； 3.试剂
2%可溶性淀粉溶液；pH4.6、0.1mol/L的醋 酸缓冲液； 0.1N碘液；0.1N氢氧化钠溶液； 1N硫酸溶液； 0.1N硫代硫酸钠溶液；0.5% 淀粉指示剂。
实验十四糖化酶活力的测定[最新]
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实验十四糖化酶活力的测定一、实验目的1、学习糖化型淀粉酶(或液体曲)酶活力的测定方法。
2、了解糖化型淀粉酶活力大小对工艺生产的指导意义。
二、实验原理糖化型淀粉酶可催化淀粉水解生成葡萄糖。
本实验在一定条件下用一定量的糖化型淀粉酶作用于淀粉，然后用碘量法测定所生成的葡萄糖的含量来计算淀粉酶的活力。
碘量法定糖原理：淀粉经糖化酶水解生成葡萄糖，葡萄搪具有还原性，其羰基易被弱氧化剂次碘酸钠所氧化：I2+2NaOH=NaIO+NaI+H2ONaIO+C6H12O6=NaI+CH2OH(CHOH)4COOH+NaI体系中加入过量的碘，氧化反应完成后用硫代替硫酸钠滴定过量的碘，即可推算出酶的活力。
I2＋2Na2S2O3 = Na2S4O6＋2NaI三、仪器、原料和试剂仪器吸管(25mL，5mL，2mL，10mL)、定碘瓶(500mL)、碱式滴定管、烧杯、恒温水浴锅、分析天平。
原料：AS3.4309黑曲霉斜面试管菌；麸皮、稻壳。
试剂1. 2％可溶性淀粉溶液：准确称取2克可溶性淀粉(预先于100~105℃烘干至恒重约2小时)，加少量蒸馏水调匀。
倾入80毫升左右的沸蒸馏水中，继续煮沸至透明，冷却后用水定容至100毫升。
2. 0.05 mol/L碘液：称取25克碘化钾溶于少量水中，加入12.7克碘，溶解后定容至1000毫升。
3. pH4.5的1mol/L醋酸缓冲液：称取8.204克无水醋酸钠，先在少量水中溶解，定容至1000毫升。
取分析纯冰醋酸5.78毫升定容至1000毫升。
以上两种溶液按醋酸和醋酸钠的体积比为25：22混合即为所要求之缓冲液。
4. 0.1 mol/L氢氧化钠溶液：称取分析纯氢氧化钠4克溶解并定容至1000毫升。
5. 1 mol/L硫酸：吸取分析纯浓硫酸(比重1.84)55.5毫升，缓缓如入944.5毫升水定容至1000毫升。
6. 0.01 mol/L硫代硫酸钠：称取26克硫代硫酸钠(Na2S2O3·5H2O)和0.4克碳酸钠，用煮沸冷却的蒸馏水溶解并定容至1000毫升，配制后放置三天再标定。
05-01-037DNS法测定糖化酶活力(精)精选全文
可编辑修改精选全文完整版3,5-二硝基水杨酸(DNS)法测定糖化酶活力一、原理糖化酶有催化淀粉水解的作用，能从淀粉分子非还原性末端开始，分解α-1,4-葡萄糖苷键生成葡萄糖。
在煮沸条件下，葡萄糖在碱性介质中被3,5-二硝基水杨酸(DNS)氧化成葡萄糖酸，而3,5-二硝基水杨酸被还原成红褐色的3-氨基-5-硝基水杨酸。
在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系，利用分光光度计，在540nm波长下测定光密度值，查对标准曲线并计算，便可求出淀粉经糖化酶水解后产生的葡萄糖总量。
由于多糖水解为单糖时，每断裂一个糖苷键需加入一分子水，所以在计算多糖含量时应乘以0.9。
反应过程如下：二、仪器、试剂1、仪器1)具塞玻璃刻度比色管：25mL×19；2)烧杯：100mL×4；3)三角瓶：100mL×1；4)容量瓶：100mL×3，50mL×3；5)刻度吸管：1mL×4；2mL×3；10mL×1；6)沸水浴；7)冰浴；8)扭力天平；9) UV —2802SH 型紫外可见分光光度计 尤尼柯（上海）仪器有限公司； 2、试剂1) 1mg/mL 葡萄糖标准液准确称取80℃烘至恒重的分析纯葡萄糖100mg ，置于小烧杯中，加少量蒸馏水溶解后，转移到100mL 容量瓶中，用蒸馏水定容至100mL ，混匀，4℃冰箱中保存备用。
2) 3,5-二硝基水杨酸（DNS ）试剂将6.3g DNS 和262mL 2M NaOH 溶液，加到500mL 含有185g 酒石酸钾钠的热水溶液中，再加5g 结晶酚和5g 亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加蒸馏水定容至1000mL ，贮于棕色瓶中备用。
三、操作步骤1、葡萄糖标准曲线的绘制取7支25mL 具塞刻度比色管编号，按表1分别加入浓度为1mg/mL 的葡萄糖标准液、蒸馏水和3,5-二硝基水杨酸（DNS ）试剂，配成不同葡萄糖含量的反应液。
糖化酶综合实验
实验四糖化酶综合实验（一）糖化酶摇瓶实验一、实验目的掌握糖化酶摇瓶实验的基本操作。
二、实验原理摇瓶培养是实验室常用的通风培养方法，通过将装有液体培养物的三角瓶放在摇床上振荡培养，以满足生物生长、繁殖及产生许多代谢产物对氧的需求。
三、实验材料1.菌种：黑曲霉（糖化酶生产常用菌种）2.培养基：玉米粉、豆饼粉、麸皮、水3.器材：500ml三角瓶、玻片四、方法步骤1. 配制培养基玉米粉 6%，豆饼粉 2%，麸皮 1%。
补足水分，原料浸入水中。
8层纱布+牛皮纸包扎，0.1MPa下灭菌30min。
500ml三角瓶 1瓶/小组，装液量分别为100ml 2个小组、200ml 2个小组2. 接种成熟斜面，在无菌条件下，注入10ml无菌水，振荡成孢子悬浮液。
待发酵培养基灭菌后冷却到30～32℃时，分别将孢子悬浮液接入三角瓶中，接种量为2ml，做好标记3. 培养将三角瓶固定在摇床上，培养温度为31℃，转速为200rpm，培养时间为96h4. 显微镜观察菌丝形状，测量发酵液pH，测定糖化酶活力五、实验结果1.比较两种不同装液量条件下的菌体形状特征、酶活力，将结果填入分析：由于摇瓶培养的时间未达到96小时。
所以，培养瓶内壁只出现少量黑色菌落。
但相对于100ml培养基中的菌体要多一些。
说明培养基量的多少会影响菌体的生长，培养基量多则营养多更有利于菌体快速旺盛生长，增殖。
因此，观察到的菌丝相对于100ml培养基中的菌丝多而粗。
培养时间一定要遵循菌体的生长曲线时间，不能过早或过晚结束培养。
应按照各种菌体与产物的模式，适时停止培养收集产物酶。
本实验摇瓶培养才72小时，未能使菌体充分生长，即菌数少，产酶量低，或培养时间还未达到菌体大量产酶的时段，这将影响后续酶的分离提取及活力测定。
培养基应适量，在不浪费原料的同时有能使菌体快速生长，并且控制培养基的量，将减轻酶分里提取的工作量。
（二）糖化酶活力测定一、实验目的掌握糖化酶活力测定的原理与方法。
大曲糖化力测定方法
大曲糖化力测定方法
大曲糖化力测定方法是用于评估大曲中糖化酶的活性和效果的方法。
主要通过测定大曲在特定条件下对淀粉的糖化程度来确定糖化力。
以下是一种常用的大曲糖化力测定方法的步骤：
1. 准备样品：从大曲中取出一定量的颗粒或粉末样品，并对其进行研磨，使其尽可能均匀。
2. 制备试样：将一定量的样品（通常是5-10g）与适量的水混合，并在一定温度下搅拌一段时间，以使大曲中的酶完全溶解。
3. 糖化反应：将制备好的试样加入含有淀粉的反应液中，反应液的温度通常为50-60°C。
然后用水浴或恒温箱等设备将反应
液保持在一定温度下，进行糖化反应。
4. 反应时间：根据需要可设置不同的反应时间，常见的糖化反应时间为24-48小时。
5. 终止反应：用热水或其他方法迅速升温至85-95°C，以终止
糖化反应。
6. 反应产物分析：采用不同的分析方法，如高效液相色谱、薄层色谱等，对反应液中产生的糖类进行分析，并计算糖化率或糖化度。
通过这些步骤，可以获得大曲样品的糖化力数据，用于评估其对淀粉的糖化效果。
糖化酶执行标准
糖化酶执行标准本标准规定了糖化酶的酶活力定义和测定方法、酶活力单位定义、糖化酶的活性范围、糖化酶的底物特异性、糖化酶的活性稳定性、糖化酶的存储条件及保质期、糖化酶的外观及物理性质、糖化酶的使用方法及注意事项。
本标准适用于糖化酶的生产、检验和使用。
1.酶活力定义和测定方法糖化酶的酶活力定义为：在规定的反应条件下，每分钟催化底物生成1μmol葡萄糖所需的酶量。
糖化酶活力的测定方法为：将一定量的糖化酶加入底物溶液中，在规定的温度和时间下反应，用葡萄糖氧化酶-DNS法测定反应生成的葡萄糖含量，计算出酶的活力。
2.酶活力单位定义糖化酶的酶活力单位（U）定义为：在规定的反应条件下，每分钟催化底物生成1μmol葡萄糖所需的酶量。
3.糖化酶的活性范围糖化酶的活性范围为：适宜温度范围为40℃-85℃，适宜pH范围为4.0-6.5。
4.糖化酶的底物特异性糖化酶的底物特异性为：能水解淀粉的α-1,4-葡萄糖苷键，生成葡萄糖，但不能水解纤维素和其他多糖。
5.糖化酶的活性稳定性糖化酶的活性稳定性为：在规定的储存条件下，糖化酶的活力保持稳定，有效期不低于2年。
6.糖化酶的存储条件及保质期糖化酶的存储条件为：密封、干燥、阴凉、避光。
糖化酶的保质期为：在上述存储条件下，有效期不低于2年。
7.糖化酶的外观及物理性质糖化酶应为无色至淡黄色的固体或液体，无异味。
其物理性质包括：相对分子质量低于100kDa，溶解性良好，不溶于有机溶剂和水。
8.糖化酶的使用方法及注意事项使用方法：将所需用量的糖化酶加入底物溶液中，搅拌均匀，按照规定的温度和时间进行反应。
反应结束后，用葡萄糖氧化酶-DNS法测定生成的葡萄糖含量。
根据测定结果计算出糖化酶的实际用量。
使用时应遵守使用说明和安全规定。
注意事项：操作时应避免直接接触皮肤和眼睛，若不慎接触，应立即用清水冲洗。
储存和使用时应避免污染和交叉污染。
糖化酶活力测定实验报告
华南农业大学综合实验报告实验项目名称：糖化酶活力测定实验项目性质：综合实验计划学时：2学时所属课程名称：食品与发酵工业分析班级：10级生物工程1班姓名：肖佩学号：************指导老师：沈玉栋徐振林一．实验原理采用可溶性淀粉为底物，在一定的pH值与温度下，使之水解为葡萄糖(还原糖)，以直接滴定法测定。
二．试剂及仪器（1）碱性酒石酸铜甲溶液（使用时等体积混合甲、乙溶液）：甲液：称取15.693g硫酸铜(Cu2SO4·5H2O)，0.05g次甲基蓝，用水溶解并稀释定容至1000mL；乙液：称取50g酒石酸钠钾，54g氢氧化钠，4g亚铁氰化钾，用水溶解并稀释定容至1000mL（2）0.1%标准葡萄糖溶液：准确称取1g无水葡萄糖（预先在100-1050C 烘干），用水溶解，加5mL浓盐酸，用水定容至1000mL。
（3）pH4.6乙酸-乙酸钠缓冲溶液：0.2mol/L乙酸溶液：量取11.8mL冰乙酸，用水稀释至1000mL；0.2mol/L 乙酸钠溶液：称取27.2g乙酸钠（CH3COONa·3H2O），用水定容至1000mL；pH4.6乙酸-乙酸钠缓冲液：取0.2mol/L的乙酸溶液和0.2mol/L的乙酸钠溶液等体积混合。
（4）0.1mol/L氢氧化钠溶液：称取4g氢氧化钠，用水溶解并定容至1000mL。
（5）2%可溶性淀粉溶液：准确称取2g可溶性淀粉（预先于10-105 0C烘干），加少量水调匀，倾入80mL沸水中，继续煮沸至透明，冷却后用水定容至100mL。
（6）固体曲（7）滴定管、电子天平、烧杯、恒温水浴锅、脱脂棉、容量瓶、移液管、三角瓶三．测定步骤（1）5%固体曲浸出液制备：称取5.0g固体曲（以绝干曲计），置于250mL 烧杯中，加90mL水和10mL pH4.6乙酸－乙酸钠缓冲溶液，搅匀，于30℃水浴中保温浸1小时，每隔15min 搅拌一次。
用脱脂棉过滤，滤液为5％固体曲浸出液。
9 糖化酶活力测定
（2） C（Na2S2O3）=0.05mol/L 硫代硫酸钠标准滴定溶液
配制：
称取结晶硫代硫酸钠(Na2S2O3· 5H2O)13g和碳酸钠0.1g（硫代硫酸 钠溶液在pH9-10时最稳定）溶于煮沸后冷却的蒸馏水中（无CO2）， 定容至1000mL，即得0.1 mol/L硫代硫酸钠溶液。贮于棕色瓶中密封 保存，配制后应放置一星期标定使用。
第九型淀粉酶（一类酶）：将淀粉水解成麦芽 糖或葡萄糖，包括以下几种：
淀粉 β-淀粉酶： 淀粉-β-1，4-麦芽糖苷酶 淀粉
糖化酶： 淀粉-α-1，4-葡萄糖糖苷酶
麦芽糖
淀粉 异淀粉酶： 淀粉-1，6-葡萄糖苷酶（真菌淀粉酶） 麦芽糖
葡萄糖
概述
糖化酶是由曲霉优良菌种（Aspergilusniger）经深层发酵 提炼而成。糖化酶，又称葡萄糖淀粉酶，它能把淀粉从非 还原性未端水解α-1.4葡萄糖苷键产生葡萄糖，也能缓慢 水解α-1.6葡萄糖苷键，转化为葡萄糖。 本产品广泛用： 生产白酒、黄酒、酒精、啤酒；用于以葡萄糖作发 酵培养基的各种抗生素、有机酸、氨基酸、维生素的发酵； 生产各种规格的葡萄糖。 总之，凡对淀粉、糊精必需进行酶水解的工业上，都 可适用。
（4）分别取上述反应液与空白液各5mL，放入 250mL碘量瓶中，准确加入C(1/2 I2)=0.1mol/L标 准碘液10mL，再加入0.1mol/L氢氧化钠15mL，摇 匀，暗处放反应15min。 （5）取出，加入c（1/2H2SO4）= 2mol/L 硫酸溶液 2mL，用0.05mol/L硫代硫酸钠滴定至淡黄色时， 加入几滴0.5%淀粉指示剂，继续滴定至无色为终 点。
目的
学习糖化型淀粉酶（或液体曲酶）活力的 测定方法 了解糖化型淀粉酶活力大小对工艺生产的 指导意义
测定糖化酶活性的方法
测定糖化酶活性的方法测定糖化酶活性的方法是通过测量糖化酶在一定条件下催化底物转化为产物的速率来确定其活性的一种实验方法。
糖化酶活性可以反映糖化酶催化糖化反应的效果和能力，因此在糖化酶的研究和应用中起到重要的作用。
下面将介绍几种常用的测定糖化酶活性的方法。
1. 连续监测法（Continuous Monitoring）连续监测法是一种通过连续监测糖化酶催化反应中底物消失或产物生成的速率的方法。
常用的连续监测方法包括紫外吸收光谱法、荧光分光光度法和电化学法等。
紫外吸收光谱法是利用糖化酶催化反应底物或产物在特定波长下的吸光度改变，通过测定光强变化来间接测定糖化酶活性。
荧光分光光度法是通过测定糖化酶催化反应中产生的荧光物质的荧光强度变化来测定糖化酶活性。
电化学法是利用糖化酶催化反应中产生的电流变化来直接测定糖化酶活性。
2. 间断监测法（Discontinuous Monitoring）间断监测法是一种通过在催化反应开始与结束时测定底物或产物的浓度变化来测定糖化酶活性的方法。
常用的间断监测方法包括酶抑制法、血红蛋白法和多糖沉淀法等。
酶抑制法是通过在糖化酶催化反应中添加一种特定的抑制剂，抑制糖化酶的活性，然后在一定时间内测定抑制前后底物或产物的浓度变化，从而间接测定糖化酶活性。
血红蛋白法是通过测定糖化酶催化反应中产生的血红蛋白含量的变化来测定糖化酶活性。
糖化酶可以将底物中的血红蛋白逐步降解，通过比较血红蛋白的降解速率来测定糖化酶活性。
多糖沉淀法是通过将糖化酶催化反应中的产物与多糖结合形成沉淀，然后通过测定沉淀的质量来测定糖化酶活性。
3. 反射光度法（Reflectance Photometry）反射光度法是一种通过测量糖化酶催化反应中产生的反射率变化来测定糖化酶活性的方法。
在糖化酶催化反应中，底物被转化为产物后，产物的光学性质会发生变化，测量其反射率的变化可以确定糖化酶活性。
总之，测定糖化酶活性的方法很多，选择合适的方法应根据实验的具体目的、测量条件、仪器设备和操作方便性等因素来综合考虑。
酶活力测定的原理和方法
柱法测定：
• 将一定量的固定化酶装进具有恒温装置 的反应柱中，让条件适宜的底物溶液， 以一定的速率流过酶柱，收集流出的反 应液。按常规方法测定底物的消耗量或 产物的生成量。测定方法与游离酶反应 液的测定方法相同。
连续测定
• 利用连续分光光度法等方法可对固定化酶反应 液进行连续测定，从而连续测定酶活力。测定 时，可将振荡反应器中的反应液用泵连续引到 连续测定仪（例如，双束紫外分光光度计等） 的流动比色杯中进行连续分光测定。或者使固 定化酶柱流出的反应液连续流经流动比色杯进 行连续分光测定。
酶反应的中止
• 使酶停止作用常使用强酸、强碱、三氯 乙酸或过氯酸，亦可用SDS（十二烷基硫 酸钠）使酶失活，或迅速加热使酶变性 等。酶反应的底物或产物一般可用化学 法，放射性化学法，酶偶联法进行测定。
三、连续法测定酶活力
• 连续法测定酶活力，不需要取样中止反应，而 是基于反应过程中光谱吸收，气体体积、酸碱 度、温度、粘度等的变化用仪器跟踪监测反应 进行的过程，记录结果，算出酶活性。连续法 使用方便，一个样品可多次测定，且有利于动 力学研究，但很多酶反应还不能用该法测定。
酶反应速度和底物浓度的关系
V 反应速度
Vmax
1/2Vmax 混合级反应
零级反应
一级反应
Km
[S] 底物浓度
米氏方程
• v=Vmax[S]/(Km+[S]) • Km为酶反应速度达到最大反应速度一半 时的底物浓度，为酶的特征常数。 • 同一酶对不同底物Km不同。 • Km最小的底物为该酶的最适底物。
实验八 糖化型淀粉酶活力的测定
实验八糖化型淀粉酶活力的测定一、目的要求掌握糖化型淀粉酶活力测定的原理和方法。
二、原理糖化型淀粉酶可催化淀粉水解生成葡萄糖。
本实验在一定条件下用一定量的酶作用于淀粉，然后用碘量法测定所生成的葡萄糖的含量，来计算淀粉酶的活力，碘量法测定葡萄糖的原理如下：首先葡萄糖被碘分子在碱性条件下歧化反应产生的次碘酸钠氧化生成葡萄糖酸，在NaOH的作用下，葡萄糖酸生成葡萄酸钠，其次过量的次碘酸钠在酸性条件下重新生成分子碘，用标准浓度的硫代硫酸钠滴定碘。
根据滴定结果按相关公式计算葡萄糖的含量。
I 2 + 2NaOH = NaIO + NaI + H2ONaIO + CHO-(CHOH)4-CH2OH = NaI + HO0C-(CHOH)4-CH2OHHO0C-(CHOH)4-CH2OH + NaOH = NaO0C-(CHOH)4-CH2OH + H2O过量的次碘酸钠加酸后，析出游离的碘，即：2NaIO + H2SO4= I2+ Na2SO4+ H2OI 2 + 2Na2S2O3= Na2S4O6+ 2NaI三、试剂和仪器试剂：1. 0.05 M 硫代硫酸钠溶液2. 0.1 M 碘液3. 2% 可溶解性淀粉（新鲜配制）4. 0.1 M NaOH溶液5. 2 M硫酸溶液6. 20% NaOH溶液7. 0.1 醋酸-醋酸钠缓冲液(pH 4.8)称取醋酸钠(CH3COONa·3H2O)6.7克，又称取冰醋酸2.60 ml, 溶于水并定容至1000 ml, 配制后用pH计校正pH。
8.待测酶9.煮沸酶器材：1. 恒温水浴锅 1 只2. 50 ml烧杯 1 只3. 玻璃棒1支4. 容量瓶 1 只5. 50 ml具塞试管2支6. 滴定管（碱式）1支7．漏斗1只8. 碘量瓶 4 只9. 吸管25 ml 1支5 ml 1支2 ml 2支10 ml 1支15 ml 1支0.2 ml 1支10. 玻璃棒四、操作1. 待测酶液的制备精确称取酶粉2.0克，倒入小烧杯内，用少量pH 4.6醋酸—醋酸钠缓冲液溶解，用玻璃棒搅拌，将上清液小心倾入适当的容量瓶中（容量瓶大小需根据酶活单位决定合适的稀释倍数后选择）沉淀部分再加入少量缓冲液，反复捣研3～4 次。
糖化酶活力测定
糖化酶活力测定1.原理固体曲中糖化酶（包括α-淀粉酶和β-淀粉酶）能将淀粉水解为葡萄糖，进而被微生物发酵，生产酒精。
糖化酶活力高，淀粉利用率就高。
可溶性淀粉经糖化酶催化水解产生葡萄糖，用斐林试剂法测定。
2.试剂（1）20g/L 可溶性淀粉溶液：准确称取绝干计的可溶性淀粉2g（准确至0.001g），于50mL烧杯中，用少量水调匀后，倒入盛有70mL沸水的烧杯中，并用20mL 水分次洗涤小烧杯，洗液合并其中，用微火煮沸到透明，冷却后用水定容至100mL，当天配置使用。
（2）2.5g/L葡萄糖溶液（3）斐林试剂（4）乙酸-乙酸钠缓冲溶液（pH4.6）a.2mol/L 乙酸溶液：取118mL冰乙酸，用水稀释至1000mL。
b.mol/L 乙酸钠溶液：称取272g乙酸钠（CH3COOH·3H2O），溶于水并稀释至1000mL。
将a，b等体积混合，即为pH4.6乙酸-乙酸钠缓冲溶液。
（5）0.5mol/L H2SO3 溶液：量取28.3mL 浓硫酸，缓慢倒入水中并稀释至1L。
（6）1 mol/L NaOH 溶液。
3.测定步骤（1）5%干曲浸出液制备称取相当于5g的干曲的曲粉（准确至0.01g）［曲粉量（g）=5×1/（1－水分含量）］，置于250mL烧杯中，加水（90－5×水分%）mL，缓冲液10mL，在30℃水浴中浸出1h，每隔15min 搅拌1次。
然后用干滤纸过滤，弃去最初5mL，接收50mL澄清滤液备用。
（2）糖化液制备吸取20g/L 可溶性淀粉溶液50mL于100mL容量瓶中，在35℃水浴保温20min 后，准确加入酶浸出液10mL，摇匀并立即计时，在35℃水浴中准确保温1h。
立即加入3mL 1mol/L NaOH 溶液，以停止反应。
再冷却到室温，用水定容至刻度线。
此时溶液应呈碱性。
空白液制备：吸取20g/L 可溶性淀粉溶液50mL于100mL容量瓶中，在35℃水浴保温20min后，先加入3mL 1mol/L NaOH 溶液，再准确加入酶浸出液10mL，摇匀并立即计时，在35℃水浴中准确保温1h。
实验三酶的固定化
•
•
• 二、实验材料、仪器与试剂
• （一）实验材料与仪器
• 干燥箱；电子天平；注射器；碘量瓶；磁力搅拌器；pH 计；恒温水浴锅等。
• （二）主要试剂
• 糖化酶；3%海藻酸钠溶液；2%氯化钙溶液。 2％可溶性 淀粉液； pH4.6、0.1mol／L醋酸缓冲液； 0.1mol／L碘 液； 0.1mol／L氢氧化钠溶液； 1mol／L硫酸溶液； 0.05 mol／L硫代硫酸钠溶液； 0.5％淀粉指示剂。
• 四、实验数据基本要求 （一）酶活力计算
在上述条件下，每小时催化淀粉水解生成1mg葡萄糖的 酶量定义为一个酶活力单位。
（二）固定化酶活力回收率计算
固定化酶总活力 活力回收率= 游离酶总活力
（三）固定化酶比活力计算
•
三、实验内容
• （一）固定化酶的制备
• 1、将海藻酸钠溶液于45℃水浴保温。 • 2、取糖化酶2g，悬浮在10ml海藻酸钠溶液中混合均匀。 • 3、用注射器吸取上述悬浮液，逐滴滴入到50 ml氯化钙溶液中，浸泡20 min 左右。 • 4、滤出凝胶珠用蒸馏水洗涤几次，除去凝胶珠表面的酶，得到固定化酶。置 于4℃冰箱中冷藏备用。
• 实验三
酶的固定化
• 一、实验基本原理 • 把糖化酶悬浮在海藻酸钠溶液中。滴入氯化钙பைடு நூலகம்液。 形成海藻酸钠凝胶小球。酶包埋在凝胶的小孔中，制成 固定化酶。 葡萄糖淀粉酶（糖化酶）活性测定原理：在一定条 件下能水解淀粉生成葡萄糖。葡萄糖的醛基被弱氧化剂 次碘酸钠氧化、过量的碘用硫代硫酸钠滴定。从碘的减 少量计算葡萄糖的量，从而计算算酶活力。
• （二）糖化酶活力测定
• 1、吸取2%可溶性淀粉10ml，加入pH4.6、0.1mol／L醋酸缓冲液5ml，混匀后 于40℃水浴预热10min。 • 2、加入酶液1ml（空白实验以煮沸失活的酶液代替正常酶液），于40℃，反 应10min。反应结束时，于沸水浴中煮10min，以终止反应。 • 3、吸取上述反应液5ml于碘量瓶中，加入0.1mol／L碘液及0.1mol／L氢氧化 钠溶液各5ml，摇匀，于室温下在暗处放置15min，加入2ml硫酸酸化。 • 4、以0.5％可溶性淀粉为指示剂，用0.05 mol／L硫代硫酸钠溶液滴定至蓝色 消失为终点。记录硫代硫酸钠溶液消耗的毫升数（A），以及空白实验消耗的 硫代硫酸钠溶液毫升数（B）。
糖化酶检测
糖化酶检测
糖化酶（Glucoamylase），又称为葡萄糖淀粉酶，主要来源于微生物，是一种具有外切酶活性的胞外酶，主要作用是从淀粉、糊精、糖原等碳链上的非还原性末端依次水解α-1,4糖苷键，切下一个个葡萄糖单元，对于支链淀粉，当遇到分支点时，它也可以水解α-1,6糖苷键由此将支链淀粉全部水解成葡萄糖。
糖化酶是我国一种重要的工业酶制剂，被应用于酒精、白酒、抗生素、氨基酸、有机酸，甘油，淀粉糖等工业中。
迪信泰检测平台采用生化法，可高效、精准的检测糖化酶的活性变化。
此外，我们还提供其他糖代谢类检测服务，以满足您的不同需求。
生化法测定糖化酶样本要求：
1. 请确保样本量大于0.2g或者0.2mL。
周期：2~3周
项目结束后迪信泰检测平台将会提供详细中英文双语技术报告，报告包括：
1. 实验步骤（中英文）
2. 相关参数（中英文）
3. 图片
4. 原始数据
5. 糖化酶活性信息。
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对照组
I2 NaIO
完全歧化反应， 无葡萄糖
NaIO3 I2
实验组
I2
NaIO
NaIO另一部分 歧化反应 生成NaIO3
NaIO一部分与 葡萄糖反应
I2
试剂与器材
1.糖化酶试剂；
2.微量滴定管、滴定台、试剂瓶、试管、三角瓶、 pH计、电子天平；
3.试剂
2%可溶性淀粉溶液；pH4.6、0.1mol/L的醋 酸缓冲液； 0.1mol/L碘液；0.1mol/L氢氧化钠 溶液； 2mol/L硫酸溶液； 0.1N硫代硫酸钠溶 液；0.5%淀粉指示剂。
式中:
B——空白滴定消耗的硫代硫酸钠毫升（ml）数；
A——酶液滴定消耗的硫代硫酸钠毫升（ml）数（取3次滴定的平 均值）；
N——硫代硫酸钠的当量浓度。
180.1——葡萄糖的摩尔质量。
8/5——表示从8ml酶反应体系取出5ml反应液。
2——所加酶液为0.5ml，按定义为1ml。
60/10——表示酶反应时间为10min，按定义为1h。
（2）在上述条件下， 1ml酶液每分钟催化2% 淀粉溶液水解生成1μmol葡萄糖的酶量定义 为1个酶活力单位（U）：
酶活力单位（U/ml）=（B－A）×10-3 ×（N/2）× （8/5）×106×2 ×（1/10）
式中符号与前式相同，
其中：
10-3—— ml换算成L。
106—— μmol换算成mol。
4.以0.5%可溶性淀粉为指示剂（4-5滴即可）， 用0.1N硫代硫酸钠溶液滴定至蓝色消失为终 点。记录0.1N硫代硫酸钠消耗的毫升数：酶 液样品（A）、空白对照（B）；
计算
(1)在上述条件下，1ml酶液每小时催化2%淀粉溶液生 成1mg葡萄糖的酶量定义为1个酶活力单位：
酶活力单位（U/ml）=（B－A）×（N/2） × 180.1×（8/5）×2×（60/10）
具体步骤 1.I2 与 NaOH作用:
I2 +2 NaOH=NaIO +NaI +H2O
2.C6H12O6 与NaIO定量作用: C6H12O6 +NaIO =C6H12O7 + NaI
3. C6H12O6反应完后,剩余的NaIO在碱性条件下发 生歧化反应:
3 NaIO=NaIO3 +2 NaI 4.歧化产物在酸性条件下进一步作用生成I2:
次碘酸钠法：
碘与NaOH作用能生成NaIO，而葡萄糖能定量地 (1:1)被NaIO氧化在酸性条件下，未与C6H12O6 作用的NaIO可转变成I2 析出,因此只要用 Na2S2O3 标准溶液滴定析出的I2 ，便可计算出 未参与反应的NaIO ，由此推导出糖化酶催化 所产生的C6H12O6 的含量。
糖化酶又称葡萄糖淀粉酶,糖化酶是一种习惯 上的名称，学名为α-1,4-葡萄糖水解酶(α-1,4Glucan glucohydrolace)。多应用于酒精、淀 粉糖、味精、抗菌素、柠檬酸、啤酒等工业以
及白酒、黄酒。糖化酶是由曲霉优良菌种 （Aspergilusniger）经深层发酵提炼而成。糖 化酶是食品工业中常用的一种酶。
酶活测定方法
测定糖化酶的方法有次碘酸钠法、兰–爱农法 （ＳＰ法） 、Schoorl法（ＤＵ法）和对硝基苯 酚葡萄糖法（ＮＰＧ法）、3,5-二硝基水杨酸 (DNS) 等方法。
我们采用次碘酸钠法来测定糖 围是4～6, 温度范围是40～60℃）进行反应，生 成的葡萄糖用次碘酸钠法定量测定。以单位时间 内分解α–１，４糖苷键生成葡萄糖所需的酶量 为酶的活力单位。
反应试剂配制方法
（1）2%可溶性淀粉
称取可溶性淀粉2g（预先100℃烘干约2h至恒重），用少量
蒸馏水调匀，徐徐倾入巳沸的蒸馏水中，煮沸至透明，冷却定容至
l00ml，此溶液需当天配制。
（2）0.2mol/L pH4.6 醋酸钠缓冲液
称取醋酸钠(CH3COONa·3H2O)2.722g，用蒸馏水溶解，定容
糖化酶是由一系列微生物分泌的具有外切酶活性的胞外
酶。糖化酶的主要作用是从淀粉、糊精、糖原等碳链上的
非还原性末端（整个碳链只有一个还原端，与之相对的都 是非还原端）依次水解a- 1,4 糖苷键, 切下一个个葡萄糖 单元，并像β- 淀粉酶一样, 使水解下来的葡萄糖发生构型 变化，形成β- D- 葡萄糖。对于支链淀粉，当遇到分支点 时，它也可以水解a- 1,6 糖苷键，由此将支链淀粉全部水 解成葡萄糖。糖化酶也能微弱水解a- 1,3 连接的碳链，但 水解a- 1,4 糖苷键的速度最快，它一般都能将淀粉百分之 百地水解生成葡萄糖。
3.取上述反应液5ml于三角瓶中，加入0.1N碘液 5ml，缓慢加入0.1mol/L NaOH溶液 5ml (注意: 加碱速度不能过快,否则过量NaIO 来不及氧化 C6H12O6 而歧化为不与C6H12O6反应的NaIO3 和NaI ,使测定结果偏低) ，摇匀后在暗处放置 15min后加入2mol/L硫酸2ml；
操作步骤
1. 取7个带塞的试管（其中3个测今年批次的酶 活、另外3个测去年批次的酶活、1个作空白 对照），分别吸取2%可溶性淀粉液5ml，加 入pH4.6醋酸缓冲液2.5ml，混匀后于40 ℃水 浴中预热10min。
2. 加入酶液0.5ml（空白对照组以煮沸失活的酶 液代替）于40 ℃，反应10min；反应结束时， 立即于沸水浴加热5min使酶失活(此时应将试 管的塞子打开）。
至100m1。冰醋酸(CH3COOH) 1.17m1定容至100ml。分别取醋酸钠49ml
和醋酸51ml混匀。缓冲液以酸度计或精密试纸校正pH。
NaIO3 +5NaI +6H2SO4=3I2 +6Na2SO4+3H2O 5.析出的I2 可用标准Na2S2O3 溶液滴定之:
I2 +2Na2S2O3 =Na2S4O6 +2NaI
注：在这一系列的反应中，1mol葡萄糖与1mol NaIO作用，而1molI2产生1molNaIO，因此， 1mol葡萄糖与1molI2 相当。只要得出对照组 和实验组所消耗的硫代硫酸钠体积，两者相减 就可以得出与葡萄糖反应的那部分次碘酸钠的 量，从而可以确定酶解生成的葡萄糖的量，从 而计算出酶活。