基于易错PCR技术的α淀粉酶基因的定向进化研究

２０１０Ｎ０．２

·９４·ＳｅｒｉａｌＮｏ．２１５ＣｈｉｎａＢｒｅｗｉｎｇＩ衄。ｖａｔｉ。ｎ

ａｎｄＫｎ。、Ⅳ１ｅｄｇｅＴｒ嬲ｓ衔

基于易错ＰＣＲ技术的仅一淀粉酶基因的定向进化研究

张建云１，谷立坤协，陈红歌２

（１．河南工程学院资源与环境工程系，河南郑州４５１１９１；２．河南农业大学生命科学学院，河南郑州４５０００２）摘要：采用基因体外定向进化策略巾易错Ｐｃ刚支术，用碱基类似物５挨脱氧尿苷三磷酸（５．ＢｒｄＵＴＰ）部分取代脱氧胸苷三磷酸（ｄ１１限），对野油菜黄单胞菌的Ｏｔ．淀粉酶基因进行了体外诱变。通过鉴别培养基进行筛选，得到５个具有高酶活的诱变基因，利用生物学软件ＤＮＡｓｔａｒＮ出发基因序列进行比较，分析了突变位点和酶功能变化的相应关系。结果显示：基因诱变后酶活的改变主要是由淀粉酶基因空间结构的改变向引起的，而不是由启动了的变化引起的。

关键词：定向进化：碱基类似物；诱变；ａ．淀粉酶基凶

中图分类号：Ｑ５５６文献标识码：Ａ文章编号：０２５４—５０７１（２０１０）０２—００９４＿０３

Ｄｉｒｅｃｔｅｄｅｖｏｌｕｔｉｏｎｉｎｖ／ｔｒｏｏｆｏｒ－ａｍｙｌａｓｅｇｅｎｅｂｙｅｒｒｏｒ－ｐｒｏｎｅＰＣＲ

ＺＨＡＮＧＪｉａｎｙｕｎｌ，ＧＵＬｉｋｕｎ”，ＣＨＥＮＨｏｎｇｇｅ２

（１．ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＲｅｓｏｕｒｃｅａｎｄＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔＳｃｉｅｎｃｅ，ＨｅｎａｎＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｚｈｅｎｇｚｈｏｕ４５１１９１。Ｃｈｉｎａ；

２，ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＬｉｆｅ

Ｓｃｉｅｎｃｅ，ＨｅｎａｎＡｇｒｉｃｕｌａｎａｌＵｎｉｖｅｍｉｔｙ，Ｚｈｅｎｇｚｈｏｕ４５０００２，Ｃｔｍａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｒａｎｄｏｍｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓｏｔ－ａｍｙｌａｓｅｇｅｎｅｉｎｖｉｔｒｏｗａｓｃｏｎｄｕｃｔｅｄｂａｓｅｄｅｒｒｏｒ－ｐｒｏｎｅＰＣＲｓｔｒａｔｅｇｙ．５－ＢｒｄＵＴＰｐａｒｔｌｙｒｅｐｌａｃｅｄｎ限ｗｈｅｎｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｔａｒｔｅｄ．Ｂｙｕｓｉｎｇｓｅｌｅｃｔｉｖｅｍｅｄｉｕｍ，ｗｅｓｃｒｅｅｎｅｄｆｉｖｅｍｕｔａｔｅｄｇｅｎｅｓｗｉｔｈｈｉｇｈｅｒｅｎｚｙｍｅａｃｔｉｖｉｔｙ．ＴｈｅｏｂｔａｉｎｅｄｓｅｑｕｅｎｃｅｓｗｅｒｅａｌｉｇｎｅｄｗｉｔｈｔｈｅｔｈｅｏｒｉｇｉｎａｌｇｅｎｅｂｙｔｈｅｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓｏｆｔｗａｒｅＤＮＡｓｔａｒ．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｃｈａｎｇｅｓｏｆｅｎｚｙｍｅａｃｔｉｖｉｔｙａｆｔｅｒｍｕｔａｔｉｏｎｍａｉｎｌｙｃａｕｓｅｄｂｙｔｈｅｃｈａｎｇｅｓｏｆｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆａ－ａｍｙｌａｓｅｇｅｎｅ，ｎｏｔｃａｕｓｅｄｂｙｔｈｅｃｈａｎｇｅｓｏｆｔｈｅｐｒｏｍｏｔｅｒ．

Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｄｉｒｅｃｔｅｄｅｖｏｌｕｔｉｏｎ；５－ＢｒｄＵＴＰ；ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ；ａ－ａｍｙｌａｓｅ

ｄ．淀粉酶（ａｌｐｈａ－Ａｍｙｌａｓｅ）为１，４一仪一Ｄ一葡萄糖苷水解酶，作用淀粉时可从分子内部切开Ｏｔ一１，４键生成小分子糊精和还原糖，产物末端葡萄糖残基Ｃｌ碳原子为仅一构型，故称Ｏｔ．淀粉酶。ｄ一淀粉酶在动物、植物、微生物【１】中均能产生，但大量生产主要还是靠微生物发酵闭。微生物中许多种类均能产生饯．淀粉酶，其中有关的属有：Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓｓｐ．Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｓｐ．Ｔｈｅｌ＂ｍＯＣＯＣＣＵｓｐ．［３１等，从淀粉酶的发现至今ｄ．淀粉酶的种类已越来越多。ａ一淀粉酶能水解淀粉中的仅一ｌ，４葡萄糖苷键，导致淀粉迅速被液化，可被广泛应用于葡萄糖生产、啤酒酿造、酒精工业、发酵行业问以及纺织行业等。因此有关仅．淀粉酶的研究也是酶类中最活跃的研究领域之一。许多研究者通过筛选和育种工作，改变菌种特性，提高丫ｄ一淀粉酶活力，但由于多次使用同种诱变剂，使负变率加大，并且可能发牛平顶效应。近年来基因一Ｉ：程的飞速发展，为（Ｉｔ一淀粉酶的研究开辟了新的道路［５－６１。

酶分子的定向进化不需要事先Ｊ，解酶的空间结构和催化机制，人为地创造特殊的进化条件，模拟自然进化机制（随机突变、基因重组、门然选择），在体外改造酶基因，并定向选择（或筛选）｝Ｈ所需性质的突变酶１７．８１。易错ＰＣＲ技术是在采）｜ｊＴａｑ酶进行ＰＣＲ扩增同的毖阗时，通过调整反应条件（如提高酶离子浓度，改变体系中４种ｄＮＴＰ的浓度等），改变Ｔａｑ酶的突变频率，从而向目的基因中以一定频率引入突变，构建突变库，然后选择或筛选需要的突变体。ＣＨＥＮＫ等［９１用此策略定向进化枯草杆菌蛋白酶Ｅ获催化活性提高２５６倍的突变体。

本研究使用碱基类似物５．溴脱氧尿营三磷酸为诱变剂，利用热稳定性的Ｔａｑ聚合酶不具备校对功能的特点而引入突变，经多轮诱变后，获得５株酶活性显著提高的诱变株。

碱基类似物掺入诱变简便、快捷，成为基因体外定向进化的又一新策略∞。研究进一步验证了这一方法的可行性，并为研究仅．淀粉酶基因突变位点和酶功能的关系提供了材料，从而为深入研究ｄ．淀粉酶基因的进化和诱变育种打下了基础。

１材料与方法

１．１试验材料

１．１．１质粒和试剂

大肠杆菌（Ｅｓｃｈｅｔｉｃｈｉａｃｏｂ３ＤＨ５０ｔ菌株和ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ质粒（２．９６ｋｂ）均ｒｆｌ本实验室保存；含野油菜黄单胞菌（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓｃａｍｐｅｓｔｒｉｓｐｖｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）ｃｔ一淀粉酶基冈的质粒ＰＨＮＨ００３：南术实验室构建（ｄ一淀粉酶基冈人小为１８０８ｂｐ）；限制性内切酶，Ｔ４ＤＮＡ连接酶、ＤＮＡｍａｒｋｅｒｓ：均购ｆＩＴａｋａｒａ公叫：ＴａｑＤＮＡ聚介酶、肤ＲＮＡ酶、ｄＮＴＰ、矿油、ＩＰＴＧ、Ｘ—ｇａｌ、ＳＤＳ、ＴＲＩＳ、ＥＢ：购自上海生工生物工程公司。１．１．２培养基

ＬＢ培养基：在９５０ｍＬ去离子水中加入蛋白胨１０９，酵母

收稿日期：２００９．１１－０８

基金项目：河南省科技厅科技攻关项目（０９２１０２２１０２１２）

作者简介：张建云（１９７９．），女，河南南召人，讲师，研究方向为应用微生物技术；谷立坤·，讲师，通讯作者。