抗体制药课件第三章ppt课件
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因免疫后第3天B淋巴细胞的增殖率最高，是处于迅速分裂期的细胞，有 利于融合后增殖。
福氏完全佐剂是由矿物油、乳化剂和杀死的分枝杆菌组成的油包水型的乳化 佐剂，对于刺激细胞免疫和某些实验性免疫尤其有效。
为促进B淋巴细胞转化，提高脾细胞分泌抗体的能力，可在注射抗原的同时 加入细菌脂多糖。
2、体外免疫 （1）特点
（二）免疫动物品系的选择
①多采用与骨髓瘤细胞供体相同品系的动物做为免疫动物。因种系距离越远， 产生的杂交瘤越不稳定。
常采用Bal B/C小鼠和Lou大鼠。
②应考虑所选动物对所用抗原能否产生良好的免疫应答，若不能，应改用其 他品系的小鼠或大鼠。
（三）动物免疫 1、体内免疫法
适用于抗原量多，免疫原性强的情况，常用8~12周龄的雌性鼠。
所有的抗体均是Ig，但并非所有的Ig都是抗体。Ig是化学结构的概念，抗 体是生物学功能的概念。
3、多克隆抗体：针对多种抗原决定簇的抗体。
由于病原菌含有多种抗原决定簇的抗原物质，由此刺激而产生的抗体制 剂是多种抗体的混合物（其产量低，难以满足临床需要）。
4、单克隆抗体（Monoclonal Antibody，McAb）：采用B淋巴细胞杂交 瘤技术，由纯一的单克隆细胞系产生的，针对一个抗原决定簇的，结构和特 异性完全相同的高纯度抗体称单克隆抗体。
1、化学合成法制备高纯度的单一抗原 在已知抗原的化学组成和结构的情况下进行。
2、由病原菌、病毒或肿瘤细胞制备 只能得到部分纯化，甚至是极不纯的抗原混合物。
3、用整个细胞或病毒为免疫原刺激动物细胞产生免疫反应
动物产生免疫反应后取其B淋巴细胞，B淋巴细胞融合杂交后，再经筛选、 克隆化，鉴别筛选出纯一的单克隆杂交瘤细胞系。
特点：
a、具有高度的特异性，均一性。
b、来源稳定，可大量生产，为抗体制备和应用提供了全新的手段。
二、临床实践中的作用
1、用于疾病的诊断 a、利用单克隆抗体检测与某些疾病相关的抗原，辅助临床诊断。 b、用放射性标记的单克隆抗体进行肿瘤显像，做免疫定位诊断。
2、McAb制剂用于疾病的治疗
a、针对分化抗原CD3的单克隆抗体对器官移植排斥反应有显著的抑制效果。
③在5%CO2，37℃下培养4~5天。
④分离脾细胞，进行细胞融合。
3、其它免疫方法 近年来，其它免疫方法研究的较多，有脾内免疫、腹贮植入、淋巴结注射、
足垫注射等方法。 其目的主要是减少抗原用量和注射次数，缩短免疫周期。
（四）骨髓瘤细胞的来源和特性
1、来源
（1）骨髓瘤细胞的来源应同免疫动物的种属一致，一般不选择产生自身免 疫球蛋白的细胞系。
刺激产生免疫反应
诱发产生骨髓瘤细胞
↓
↓制备
取鼠脾脏→ B淋巴细胞 × 骨髓瘤细胞(HGPR缺陷
↓
↓融合（PEG）
制取B淋巴细胞
分装多孔板选择性培（HAT）
↓
↓亲株死亡
B淋巴细胞培养
杂交瘤细胞生长繁殖
↓Biblioteka Baidu
↓有限稀释、克隆化
制取多克隆抗体 分离出单克隆细胞系 → McAb
二、McAb制备的基本技术
（一）抗原的制备 制备针对特定抗原的单克隆抗体，首先要制备用于免疫的适当抗原。
可用培养基内酚红指示剂监测，开始生长时呈橙色，由于细胞生长，PH降 低，当变为纯黄色时需补加新鲜培养基降低细胞密度，正常培养基颜色维持 在黄橙色之间。
a、所用抗原量少（只需几µg），免疫期短，仅4~5天，干扰因素少。 b、融合后产生的杂交瘤细胞不够稳定。
适用于不能采用体内免疫法的情况，如制备人源性McAb；或者抗原的 免疫原性极弱且能引起免疫抑制时使用。
（2）基本方法 ①采用4~8周龄BaL B/C小鼠的脾脏制成单细胞悬液。 ②加入抗原使其浓度达到0.5~5µg/ml。
单克隆抗体是将能产生抗体的B淋巴细胞与具有无限增殖能力的骨髓细胞进 行原生质体融合，通过有限稀释法及克隆化使杂交瘤细胞成为纯一的单克隆 细胞系而产生的。
一、McAb制备的一般程序
B淋巴细胞 × 骨髓瘤细胞
↓融合
杂交瘤细胞
↓有限稀释 ↓克隆化
纯一的单克隆细胞系 ↓
McAb
抗原
矿物油
↓
↓
注射活鼠
注射BalB/c小鼠
（1）颗粒性抗原（细胞抗原） 免疫原性强，可不加佐剂，直接注入腹腔刺激动物免疫。
①初次免疫，腹腔注射107个细胞。 ②3周后，追加免疫1~2次，腹腔注射1~5×106个在缓冲盐溶液中洗过的细
胞。 ③融合前4~5天，静脉注射1~5×106个细胞。
（2）可溶性抗原 ①按每只小鼠10~100µg抗原与福氏完全佐剂等量混合皮下注射。 ②3~4周后，100µg抗原在福氏完全佐剂中追加一次。 ③采集脾细胞前3天由静脉注射最后一次100µg抗原。
1、抗体（Antibody，Ab）：指能与相应抗原特异性结合的具有免疫功能的 球蛋白。
抗体产生的原因：机体免疫系统因病原菌、病毒感染，受抗原物质刺激 后产生B淋巴细胞，被活化的B淋巴细胞经增殖、分化产生浆细胞，浆细胞 合成和分泌抗体。
2、免疫球蛋白（Immunoglobulin，Ig）：具有抗体活性及化学结构与抗 体相似的球蛋白统称为免疫球蛋白。
（2）鼠类骨髓瘤细胞系主要来自于Bal B/C小鼠，少数来自于Lou大鼠。 这些细胞系能够在D-15或其他培养基中保存，在用于融合前应保持其活力 较高，目前这类细胞系有商品供应。
常用的鼠类骨髓瘤细胞系有NS-1、X45、X63 、P3.653和SP2/O等。其
最适培养的细胞密度为2~5×10 5细胞/ml，细胞密度过高易引起细胞死亡。
b、以McAb作为载体的导向药物可对肿瘤进行定向治疗。
近年来通过对McAb的改造，消除其鼠源性（免疫原性）并降低其分子量， 只保留其同抗原特异性结合的活性，再用其制备导向药物用于肿瘤治疗，进 而提高了免疫导向疗法的效果，使该领域得以迅速发展，目前成为抗体应用 研究的热点。
第二节 单克隆抗体的制备
第三章 抗体制药
第一节 概述
一、抗体的概念 最早应用的预防和治疗传染病的抗体药物为抗毒素血清（1890，
Behring）。 1937年Tiselius等人用电泳法将血清蛋白分为白蛋白、α-球蛋白、β-球
蛋白、γ-球蛋白（丙种球蛋白），并证明抗体活性主要存在于丙种球蛋白组 分。因此，在相当一段时间内，丙种球蛋白成为抗体的同义词。
福氏完全佐剂是由矿物油、乳化剂和杀死的分枝杆菌组成的油包水型的乳化 佐剂，对于刺激细胞免疫和某些实验性免疫尤其有效。
为促进B淋巴细胞转化，提高脾细胞分泌抗体的能力，可在注射抗原的同时 加入细菌脂多糖。
2、体外免疫 （1）特点
（二）免疫动物品系的选择
①多采用与骨髓瘤细胞供体相同品系的动物做为免疫动物。因种系距离越远， 产生的杂交瘤越不稳定。
常采用Bal B/C小鼠和Lou大鼠。
②应考虑所选动物对所用抗原能否产生良好的免疫应答，若不能，应改用其 他品系的小鼠或大鼠。
（三）动物免疫 1、体内免疫法
适用于抗原量多，免疫原性强的情况，常用8~12周龄的雌性鼠。
所有的抗体均是Ig，但并非所有的Ig都是抗体。Ig是化学结构的概念，抗 体是生物学功能的概念。
3、多克隆抗体：针对多种抗原决定簇的抗体。
由于病原菌含有多种抗原决定簇的抗原物质，由此刺激而产生的抗体制 剂是多种抗体的混合物（其产量低，难以满足临床需要）。
4、单克隆抗体（Monoclonal Antibody，McAb）：采用B淋巴细胞杂交 瘤技术，由纯一的单克隆细胞系产生的，针对一个抗原决定簇的，结构和特 异性完全相同的高纯度抗体称单克隆抗体。
1、化学合成法制备高纯度的单一抗原 在已知抗原的化学组成和结构的情况下进行。
2、由病原菌、病毒或肿瘤细胞制备 只能得到部分纯化，甚至是极不纯的抗原混合物。
3、用整个细胞或病毒为免疫原刺激动物细胞产生免疫反应
动物产生免疫反应后取其B淋巴细胞，B淋巴细胞融合杂交后，再经筛选、 克隆化，鉴别筛选出纯一的单克隆杂交瘤细胞系。
特点：
a、具有高度的特异性，均一性。
b、来源稳定，可大量生产，为抗体制备和应用提供了全新的手段。
二、临床实践中的作用
1、用于疾病的诊断 a、利用单克隆抗体检测与某些疾病相关的抗原，辅助临床诊断。 b、用放射性标记的单克隆抗体进行肿瘤显像，做免疫定位诊断。
2、McAb制剂用于疾病的治疗
a、针对分化抗原CD3的单克隆抗体对器官移植排斥反应有显著的抑制效果。
③在5%CO2，37℃下培养4~5天。
④分离脾细胞，进行细胞融合。
3、其它免疫方法 近年来，其它免疫方法研究的较多，有脾内免疫、腹贮植入、淋巴结注射、
足垫注射等方法。 其目的主要是减少抗原用量和注射次数，缩短免疫周期。
（四）骨髓瘤细胞的来源和特性
1、来源
（1）骨髓瘤细胞的来源应同免疫动物的种属一致，一般不选择产生自身免 疫球蛋白的细胞系。
刺激产生免疫反应
诱发产生骨髓瘤细胞
↓
↓制备
取鼠脾脏→ B淋巴细胞 × 骨髓瘤细胞(HGPR缺陷
↓
↓融合（PEG）
制取B淋巴细胞
分装多孔板选择性培（HAT）
↓
↓亲株死亡
B淋巴细胞培养
杂交瘤细胞生长繁殖
↓Biblioteka Baidu
↓有限稀释、克隆化
制取多克隆抗体 分离出单克隆细胞系 → McAb
二、McAb制备的基本技术
（一）抗原的制备 制备针对特定抗原的单克隆抗体，首先要制备用于免疫的适当抗原。
可用培养基内酚红指示剂监测，开始生长时呈橙色，由于细胞生长，PH降 低，当变为纯黄色时需补加新鲜培养基降低细胞密度，正常培养基颜色维持 在黄橙色之间。
a、所用抗原量少（只需几µg），免疫期短，仅4~5天，干扰因素少。 b、融合后产生的杂交瘤细胞不够稳定。
适用于不能采用体内免疫法的情况，如制备人源性McAb；或者抗原的 免疫原性极弱且能引起免疫抑制时使用。
（2）基本方法 ①采用4~8周龄BaL B/C小鼠的脾脏制成单细胞悬液。 ②加入抗原使其浓度达到0.5~5µg/ml。
单克隆抗体是将能产生抗体的B淋巴细胞与具有无限增殖能力的骨髓细胞进 行原生质体融合，通过有限稀释法及克隆化使杂交瘤细胞成为纯一的单克隆 细胞系而产生的。
一、McAb制备的一般程序
B淋巴细胞 × 骨髓瘤细胞
↓融合
杂交瘤细胞
↓有限稀释 ↓克隆化
纯一的单克隆细胞系 ↓
McAb
抗原
矿物油
↓
↓
注射活鼠
注射BalB/c小鼠
（1）颗粒性抗原（细胞抗原） 免疫原性强，可不加佐剂，直接注入腹腔刺激动物免疫。
①初次免疫，腹腔注射107个细胞。 ②3周后，追加免疫1~2次，腹腔注射1~5×106个在缓冲盐溶液中洗过的细
胞。 ③融合前4~5天，静脉注射1~5×106个细胞。
（2）可溶性抗原 ①按每只小鼠10~100µg抗原与福氏完全佐剂等量混合皮下注射。 ②3~4周后，100µg抗原在福氏完全佐剂中追加一次。 ③采集脾细胞前3天由静脉注射最后一次100µg抗原。
1、抗体（Antibody，Ab）：指能与相应抗原特异性结合的具有免疫功能的 球蛋白。
抗体产生的原因：机体免疫系统因病原菌、病毒感染，受抗原物质刺激 后产生B淋巴细胞，被活化的B淋巴细胞经增殖、分化产生浆细胞，浆细胞 合成和分泌抗体。
2、免疫球蛋白（Immunoglobulin，Ig）：具有抗体活性及化学结构与抗 体相似的球蛋白统称为免疫球蛋白。
（2）鼠类骨髓瘤细胞系主要来自于Bal B/C小鼠，少数来自于Lou大鼠。 这些细胞系能够在D-15或其他培养基中保存，在用于融合前应保持其活力 较高，目前这类细胞系有商品供应。
常用的鼠类骨髓瘤细胞系有NS-1、X45、X63 、P3.653和SP2/O等。其
最适培养的细胞密度为2~5×10 5细胞/ml，细胞密度过高易引起细胞死亡。
b、以McAb作为载体的导向药物可对肿瘤进行定向治疗。
近年来通过对McAb的改造，消除其鼠源性（免疫原性）并降低其分子量， 只保留其同抗原特异性结合的活性，再用其制备导向药物用于肿瘤治疗，进 而提高了免疫导向疗法的效果，使该领域得以迅速发展，目前成为抗体应用 研究的热点。
第二节 单克隆抗体的制备
第三章 抗体制药
第一节 概述
一、抗体的概念 最早应用的预防和治疗传染病的抗体药物为抗毒素血清（1890，
Behring）。 1937年Tiselius等人用电泳法将血清蛋白分为白蛋白、α-球蛋白、β-球
蛋白、γ-球蛋白（丙种球蛋白），并证明抗体活性主要存在于丙种球蛋白组 分。因此，在相当一段时间内，丙种球蛋白成为抗体的同义词。