MTT法测定细胞生长曲线

MTT实验原理、步骤、注意事项

MTT实验原理；步骤；注意事项；一、原理MTT全称为3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide，汉语化学名为3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。

是一种黄颜色的染料。

MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。

其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。

二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm 波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。

在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。

该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。

它的特点是灵敏度高、经济。

缺点：由于MTT经还原所产生的甲瓒产物不溶于水，需被溶解后才能检测。

这不仅使工作量增加，也会对实验结果的准确性产生影响，而且溶解甲的有机溶剂对实验者也有损害。

MTT 溶液的配制方法：通常，此法中的MTT 浓度为5mg/ml。

因此，可以称取MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸缓冲液（PBS）或无酚红的培养基中，用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌，放4℃避光保存即可。

在配制和保存的过程中，容器最好用铝箔纸包住。

实验的时候我一般关闭超净台上的日光灯来避光，觉得这样比较好。

需要注意的是，MTT法只能用来检测细胞相对数和相对活力，但不能测定细胞绝对数。

在用酶标仪检测结果的时候，为了保证实验结果的线性，MTT 吸光度最好在0-0.7 范围内。

MTT一般最好现用现配，过滤后4ºC避光保存两周内有效，或配制成5mg/ml保存在-20度长期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。

我一般都把MTT粉分装在EP管里，用的时候现配，直接往培养板中加，没必要一下子配那么多,尤其当MTT变为灰绿色时就绝对不能再用了。

MTT法原理、步骤以及注意事项

MTT法原理、步骤以及注意事项MTT原理MTT全称为3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide，汉语化学名为 3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。

是一种黄颜色的染料。

MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。

其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。

二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm波长处（也有用570nm波长的，我目前用的都是570nm)测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。

在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。

该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。

它的特点是灵敏度高、经济。

缺点：由于MTT经还原所产生的甲瓒产物不溶于水，需被溶解后才能检测。

这不仅使工作量增加，也会对实验结果的准确性产生影响，而且溶解甲的有机溶剂对实验者也有损害。

MTT 溶液的配制方法通常，此法中的MTT 浓度为5mg/ml。

因此，可以称取MTT 0.5克，溶于100 ml 的磷酸缓冲液（PBS）或无酚红的培养基中，用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌，放4℃ 避光保存即可。

在配制和保存的过程中，容器最好用铝箔纸包住。

实验的时候我一般关闭超净台上的日光灯来避光，觉得这样比较好。

需要注意的是，MTT法只能用来检测细胞相对数和相对活力，但不能测定细胞绝对数。

在用酶标仪检测结果的时候，为了保证实验结果的线性，MTT 吸光度最好在0-0.7范围内。

MTT一般最好现用现配，过滤后4℃避光保存两周内有效，或配制成5mg/ml 保存在-20度长期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。

简述mtt法能绘制细胞生长曲线的原理

简述mtt法能绘制细胞生长曲线的原理
MTT法（即3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide）是一种常用的细胞代谢活性检测方法，常用于测定细胞增殖与毒性的活性。

MTT法的原理是通过将MTT激发后生成的水溶性产物还原成紫色的颗粒沉淀，进而通过溶解颗粒沉淀来评估细胞数量和代谢活性。

主要步骤如下：
1. 细胞接种：将待测细胞接种在含有MTT试剂的培养皿中。

2. 细胞培养：细胞在MTT试剂中进行培养，培养期间细胞会代谢活跃并增殖。

3. 溶解颗粒沉淀：经过一定时间的培养后，MTT试剂会被还原成紫色的颗粒沉淀。

将培养皿中的培养液倒掉，然后加入溶解剂（如酒精或二甲基亚硫酸钠溶液）溶解颗粒沉淀。

4. 颜色测定：溶解颗粒沉淀溶解后的溶液会变成紫色，利用酶标仪或多孔板读取器测定溶液的光密度。

MTT法通过测定光密度来间接评估细胞的增殖与活性。

细胞越多，MTT试剂被还原成颗粒沉淀就越多，溶解后的溶液光密度就越高，说明细胞数目越多，代谢活性越高。

因此，通过测定光密度的变化可以绘制细胞生长曲线，反映细胞增殖与活性的变化情况。

MTT法观察细胞生长曲线

MTT法绘制生长曲线一细胞生长曲线：A、目的：学习细胞生长曲线的测定方法，观察细胞生长基本规律。

B、背景知识细胞生长曲线是观察细胞生长基本规律的重要方法。

只有具备自身稳定生长特性的细胞才适合在观察细胞生长变化的实验中应用。

因而在细胞系细胞和非建系细胞生长特性观察中，生长曲线的测定是最为基本的指标。

原理（选填项目）：细胞生长曲线的测定一般可利用细胞计数法进行。

C、材料（一）仪器1. 净化工作台2. 离心机3. 恒温水浴箱4. 冰箱（4℃、-20℃）5. 倒置相差显微镜6. 培养箱（37℃、5%CO2、饱和湿度）（二）玻璃器皿1. 吸管（弯头）2. 培养瓶3. 玻璃瓶（250ml、100ml）4. 废液缸（三）塑料器皿1. 吸头2. 枪头3. 24培养板4. 胶塞（四）其他物品1. 微量加样枪2. 红血球计数板（五）试剂1. D-Hanks液2. 小牛血清3. RPMI16404. 双抗（青霉素、链霉素）5. 0.08%胰酶（四）、操作步骤1. 取生长状态良好的细胞，采用一般传代方法进行消化，制成细胞悬液；2. 计数，精确地将细胞分别接种于21～30个大小一致的培养瓶内或培养孔（以24孔培养板为宜），每瓶或孔细胞总数要求一致，加入培养液的量也要一致。

3. 每天或每隔一天取出3瓶（孔）细胞进行计数，计算均值。

培养3～5d常要给未计数的细胞换液。

4. 以培养时间为横轴，细胞数为纵轴（对数），描绘在半对数座标纸上，连接成曲线后即成该细胞的生长曲线。

9（五）、注意事项1．细胞生长曲线虽然最为常用，但有时其反映数值不够精确，可有20～30%的误差，需结合其它指标进行分析。

2．现在很多实验室利用培养板采用MTT法进行生长曲线测定，较为简便。

3．标准的细胞生长曲线近似“S”形，一般在传代后第一天细胞数有所减少，再经过几天的潜伏适应期，然后进入对数生长期，达到平台期后生长稳定，最后到达衰老。

4．在生长曲线上细胞数量增加1倍时间称为细胞倍增时间，可以从曲线上换算出。

MTT分析法

悬浮细胞：MTT分析法是以活细胞代谢物还原剂3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide, MTT 噻唑蓝为基础。

MTT为黄色化合物，是一种接受氢离子的染料，可作用于活细胞线粒体中的呼吸链，在琥珀酸脱氢酶和细胞色素C的作用下tetrazolium环开裂，生成蓝色的for mazan结晶，formazan结晶的生成量仅与活细胞数目成正比（死细胞中琥珀酸脱氢酶消失，不能将MTT还原）。

还原生成的for mazan结晶可在含50%的N, N-二甲基甲酰胺和20%的十二甲基磺酸钠（pH 4.7）的MTT溶解液中溶解，利用酶标仪测定490 nm处的光密度OD值，以反映出活细胞数目。

也可以用DMSO来溶解。

MTT粉末和溶液保存时都需要避光，用铝箔纸包好就可以。

实验的时候建议关闭超净台上的日光灯来避光。

步骤如下：1:接种细胞：用含10％胎小牛血清的培养液配成单个细胞悬液，以每孔 1000－10000个细胞接种到96孔板，每孔体积200ul。

2:培养细胞：同一般培养条件，培养3－5天（可根据试验目的和要求决定培养时间）。

3: 呈色：培养3-5天后，每孔加MTT溶液（5mg/ml用PBS <ph=7.4>配）20ul. 继续孵育4小时，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液。

每孔加150ul DMSO，振荡10 分钟，使结晶物充分融解。

4：比色：选择490nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。

注意事项：1、选择适当得细胞接种浓度。

2、避免血清干扰：一般选小于10％的胎牛血清的培养液进行试验。

在呈色后尽量吸尽孔内残余培养液。

3、设空白对照：与试验平行不加细胞只加培养液的空白对照。

其他试验步骤保持一致，最后比色以空白调零。

MTT比色法测定细胞生长曲线、细胞生长曲线拟合、细胞群体倍增时间的简化计算解析

1.MTT比色法测定细胞生长曲线 2.细胞生长曲线的拟合及细胞群体倍增时间的简化计算
1.MTT比色法测定细胞生长曲线
2018/10/31
细胞生长曲线
• 细胞生长曲线是测定细胞绝对生长数的常用方法，也是判定细胞活力的重要指标，是培养细胞生物学特性的基本参数之一。
一般细胞传代之后，经过短暂的悬浮然后贴壁，随后度过长短不同的迟缓期（潜伏期），即进入大量分裂的对数生长期。在细胞达到饱和密度后，停止生长，进入稳定期，然后退化衰亡。
t 24h( Lg 2 / [ Lg (a eb t ln 2 ) Lg (a eb t0 ln 2 )] t 24h( Lg 2 / [ Lg (a 2 ) Lg (a 2
bt b t0
)])
t (24h( Lg 2 / b((t t0 ) Lg 2)
t[24h( Lg 2 / (b t Lg 2)]
• 1.标准曲线的测定:
• 例如：用培养液将待检细胞重悬，得到细胞悬液，按照4x10^4/ml细胞密度梯度 ,分别接种于 96孔板 ,每孔 100μl,重复 3孔;采用 MTT法测量吸光值A值,同一浓度下测得的A值为该浓度下3孔的平均值。依检测结果 ,得到吸光值 A值与细胞浓度的对应关系，绘出标准曲线。
2018/10/31
• • •
2.细胞生长曲线拟合及细胞群体倍增时间的简化计算
2018/10/31
• 曲线拟合
• 曲线拟合（curve fitting）是指选择适当的曲线类型来拟合观测数据，并用拟合的曲SS是世界上最早的统计分析软件，由美国斯坦福大学的三位研究生Norman H. Nie、C. Hadlai (Tex) Hull 和 Dale H. Bent于1968年研开发成功，同时成立了SPSS公司，并于1975年成立法人组织、在芝加哥组建了SPSS总部。 • 1984年SPSS总部首先推出了世界上第一个统计分析软件微机版本SPSS/PC+，开创了SPSS微机系列产品的开发方向，极大地扩充了它的应用范围，并使其能很快地应用于自然科学、技术科学、社 2018/10/31

细胞生长曲线测定

细胞生长曲线测定细胞生长曲线目录概念方法概念方法展开编辑本段概念细胞生长曲线是测定细胞绝对生长数的常用方法，也是判定细胞活力的重要指标，是培养细胞生物学特性的基本参数之一。

一般细胞传代之后，经过短暂的悬浮然后贴壁，随后度过长短不同的潜伏期，即进入大量分裂的指数生长期。

在细胞达到饱和密度后，停止生长，进入平顶期，然后退化衰亡。

为了准确描述整个过程中细胞数目的动态变化，典型的生长曲线可分为生长缓慢的潜伏期，斜率较大的指数生长期，呈平台状的平顶期及退化衰亡4个部分。

以存活细胞数(万／mL)对培养时间(h或d)作图，即得生长曲线。

编辑本段方法计数法1．取生长良好接近汇合的细胞，用胰酶消化，用新培养基制成细胞悬液后计数(见四、细胞传代培养的实验步骤)。

如是非粘壁细胞，则离心弃旧培养基后，换上一定量的新鲜培养基然后制成细胞悬液计数。

2．根据细胞计数结果按每个小方瓶5×104／mL作传代培养接种细胞，共接种21瓶细胞。

3．24 h后开始计数细胞，以后每隔24 h计数一次，每次取3瓶细胞，分别进行计数。

计算平均值。

连续计数7 d。

4．根据细胞计数结果，以单位细胞数(细胞数／mL)为纵坐标，以时间为横坐标绘制生长曲线。

MTT法1．制备1 mL细胞悬液。

空白对照以1 mL培养基代替细胞悬液。

加入0．1 mL MTT于37℃孵育4 h。

使MTT还原为蓝紫色甲月赞结晶。

2．加1 mL DTW脱色液，37℃至少静置30 min(甚至过液)，使甲质颗粒充分溶解。

3．吸取200 μL该溶解液至96孔板孔中，在酶标仪上读取OD 值，检测波长570 nm，参考波长630 nm。

4．每隔24 h测量一个点，每个点为3个平行样品的平均值。

细胞增殖检测MTT法

细胞增殖检测：MTT法MTT分析法以活细胞代谢物还原剂3-（4，5）-dimethylthiahiazo （-z-y1）-3，5-di- phenytetrazoliumromide，MTT噻唑蓝为基础。

MTT为黄色化合物，是一种接受氢离子的染料，可作用于活细胞线粒体中的呼吸链，在琥珀酸脱氢酶和细胞色素C的作用下tetrazolium环开裂，生成蓝色的formazan结晶，formazan结晶的生成量仅与活细胞数目成正比（死细胞中琥珀酸脱氢酶消失，不能将MTT还原）。

还原生成的formazan结晶可在含50%的N，N-二甲基甲酰胺和20%的十二甲基磺酸钠（pH 4.7）的MTT溶解液中溶解，利用酶标仪测定490 nm处的光密度OD值，以反映出活细胞数目。

也可以用DMSO 来溶解。

MTT粉末和溶液保存时都需要避光，用铝箔纸包好就可以。

实验的时候我一般关闭超净台上的日光灯来避光，觉得这样比较好。

一、步骤1、接种细胞用含10%胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液，以每孔1000－10000个细胞接种到96孔板，每孔体积200ul。

2、培养细胞同一般培养条件，培养3－5天（可根据试验目的和要求决定培养时间）。

3、呈色培养3－5天后，每孔加MTT溶液（5mg/ml用PBS 配）20ul.继续孵育4小时，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液。

每孔加150ul DMSO，振荡10分钟，使结晶物充分融解。

4、比色选择490nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。

二、注意事项1、选择适当得细胞接种浓度。

2、避免血清干扰：一般选小于10%的胎牛血清的培养液进行试验。

在呈色后尽量吸尽孔内残余培养液。

3、设空白对照：与试验平行不加细胞只加培养液的空白对照。

其他试验步骤保持一致，最后比色以空白调零。

MTT实验吸光度最后要在0-0.7之间，超出这个范围就不是直线关系，IC50是半抑制率，意思是抑制率50％的时候药物的浓度。

MTT试验方法

MTT试验方法MTT法原理、步骤以及注意事项(2009-05-28 11:18:56)标签：杂谈分类：实验操作技能MTT原理MTT全称为3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide，汉语化学名为3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。

是一种黄颜色的染料。

MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。

其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。

二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm 波长处（也有用570nm波长的，我目前用的都是570nm)测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。

在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。

该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。

它的特点是灵敏度高、经济。

缺点：由于MTT经还原所产生的甲瓒产物不溶于水，需被溶解后才能检测。

这不仅使工作量增加，也会对实验结果的准确性产生影响，而且溶解甲的有机溶剂对实验者也有损害。

MTT 溶液的配制方法通常，此法中的MTT 浓度为5mg/ml。

因此，可以称取MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸缓冲液（PBS）或无酚红的培养基中，用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌，放4℃避光保存即可。

在配制和保存的过程中，容器最好用铝箔纸包住。

实验的时候我一般关闭超净台上的日光灯来避光，觉得这样比较好。

需要注意的是，MTT法只能用来检测细胞相对数和相对活力，但不能测定细胞绝对数。

在用酶标仪检测结果的时候，为了保证实验结果的线性，MTT 吸光度最好在0-0.7 范围内。

MTT一般最好现用现配，过滤后4℃避光保存两周内有效，或配制成5mg/ml保存在-20度长期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。

MTT原理方法及操作步骤

MTT原理、步骤、结果分析方法及注意事项MTT原理MTT全称为3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide，汉语化学名为 3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。

是一种黄颜色的染料。

MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。

其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。

二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。

在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。

该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。

它的特点是灵敏度高、经济。

缺点：由于MTT经还原所产生的甲瓒产物不溶于水，需被溶解后才能检测。

这不仅使工作量增加，也会对实验结果的准确性产生影响，而且溶解甲的有机溶剂对实验者也有损害。

MTT 溶液的配制方法通常，此法中的MTT 浓度为5mg/ml。

因此，可以称取MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸缓冲液（PBS）或无酚红的培养基中，用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌，放4℃避光保存即可。

在配制和保存的过程中，容器最好用铝箔纸包住。

实验的时候我一般关闭超净台上的日光灯来避光，觉得这样比较好。

需要注意的是，MTT法只能用来检测细胞相对数和相对活力，但不能测定细胞绝对数。

在用酶标仪检测结果的时候，为了保证实验结果的线性，MTT 吸光度最好在0-0.7 范围内。

MTT一般最好现用现配，过滤后4ºC避光保存两周内有效，或配制成5mg/ml保存在-20度长期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。

我一般都把MTT粉分装在EP 管里，用的时候现配，直接往培养板中加，没必要一下子配那么多,尤其当MTT变为灰绿色时就绝对不能再用了。

MTT法检测细胞活性并绘制生长曲线综述

关于选择MTT法检测睾丸支持细胞细胞数目并绘制生长曲线综述李锦阳作者简介:李锦阳,男,大学本科,学生摘要:目的：绘制睾丸支持细胞的生长曲线，确定其对数增长期准确时间范围，确定出最适宜染毒时间。

方法：MTT法大致检测活细胞数目，根据细胞数目绘制睾丸支持细胞生长曲线。

关键词:MTT 生长曲线睾丸支持细胞细胞增殖前言:20世纪60年代以来，随着组织培养技术的不断完善和细胞系（株）的不断建立，利用细胞系（或原代细胞）进行离体细胞生物测量的方法随之出现。

细胞计数是离体细胞测量培养并绘制细胞生长曲线的基础，也是细胞培养技术中一项耗费时间精力比较大的步骤。

噻唑蓝法（3-4,5diem ethylthiazol-2,5 dipheuyltetrazoliumbrom ide，M TT）是Tim Mosman（1983）首创的一种利用比色测定活细胞量的方法，由于该法灵敏准确、经济简便因而被广泛应用于生物学和医学研究中，现在许多实验采用MTT进行细胞计数，测量细胞生长曲线，大大提高了细胞计数的效率。

目前国内外研究睾丸支持细胞生长曲线的报道尚属少见，因此目前为止，无法准确获悉睾丸支持细胞的体外细胞培养的对数期。

而细胞增殖的对数期是细胞染毒的最佳时期，确定了睾丸支持细胞的增殖对数期将会大大方便今后的研究工作者。

原理：四唑盐是一种能接受氢原子的染料，简称MTT。

活细胞的线粒体中的琥珀脱氢酶能使外源性的MTT还原为难溶性的蓝紫色结晶物并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。

二甲基亚砜能溶解细胞中的紫色结晶物，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，经过换算，可间接反映细胞数量。

在一定细胞数范围内，MTT结晶物形成的量与细胞数成正比。

方法：①配置MTT溶液：称取250mgMTT，放入小烧杯中，加50ml培养液或平衡盐溶液在电磁力搅拌机上搅拌30min，用0.22um的微孔滤器除菌，分装，4℃保存备用，两周内有效。

②接种细胞：将已经制成细胞悬液的睾丸支持细胞和其中混杂的生精细胞计数，使之达到每孔1000~10000的细胞浓度接种与96孔培养板中（每孔体积200ul），按照观察期限7天，共计分装7个板（注意每隔48小时左右换液一次，避免细胞因营养物消耗完毕影响生长，造成测定误差）③培养细胞：将培养板移入CO2孵箱中，在37℃、5% CO2及饱和湿度条件下培养。

MTT法

MTT法（四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法）检测细胞增殖曲线，研究对细胞存活的影响：取对数生长期的细胞，经0.25％胰蛋白酶消化，制成单细胞悬液计数，(共36－40ml培养液)→调整细胞浓度为5×103个细胞／ml，反复吹打使细胞均匀，接种于96孔培养板中，每孔100ul（细胞数为 500个培养箱孵育过夜后，36小时后弃原培养液，以细胞/孔）， 37℃，5%CO2无血清培养基清洗2遍，分组加药，加入不同浓度药液（0、10、100、1000、10000）培养液100ul(入无血清培养基中)，每种浓度设立8个平行对照（商），并设正常对照（无药对照）及空白对照（不加细胞只加培养液，其他步骤一样，最后比色调零用），置正常培养条件下培养。

→加药后的第24、48、72、96、120、144h分别取出一板，弃去培养液，每孔加入5mg/ml的MTT溶液20μl，继续培养4小时，→小心吸弃孔内上清培养液，每孔加入DMSO 100－200μl（白），振荡摇匀，10分钟充分溶解结晶物，→室温静置20－30分钟后选择490nm（570nm白、张），在酶联免疫检测仪（96孔酶标仪）上测定各孔吸光度（OD）值，并计算细胞存活率，即：细胞存活率=试验组吸光度值/对照组吸光度值×100%1．碘化丙啶（PI）：用PBS溶为1mg/ml，4℃避光保存。

2. MTT溶液(5mg/ml)：50mgMTT粉剂溶于10mlPBS中，以孔径为0.22um滤器过滤除菌。

呵呵以前做过的，大概的实验方法如下，不知道对你是否有用1）收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，分于96孔板，每孔180μl，3000-10000个/孔。

2）置37℃、5%CO2温箱培养使细胞贴壁，培养6-24小时。

3）加入待筛样品20μl，继续培养44小时。

4）小心吸去上清，加入80μl新鲜RPMI 1640培养液，再加入20 ul MTT溶液（5 mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4 h。

MTT使用讨论总结(附MTS测定方法)

本实验室也有人据此而仅采用眙盼蓝计数法测定细胞增殖程度，做药物对细胞株生长的影响时，我想细胞增殖程度应该是比较重要的指标，怎可马虎行事。

请高手指点迷津！bengbu_bli 用普通血球计数板计数增殖细胞的数量，只要检测的细胞样本数量不是非常大，只要能够数得过来，而且一般来讲，都是熟练者计数的话，应该是比MTT法要准确的多。

据了解，国外许多档次不低的杂志都是认可这种经典或传统计数细胞的方法的。

midas丁香园主任是的，只要idea巧妙有创意，而用于证明他们的方法都是次要的！diandian眙盼蓝、MTT确实不是一个好的方法，国外的许多杂志已不太使用，国内还认可的。

关键是整篇文章的思路和结构，好的idea是很重要的。

我的一个师姐的文章就被提出眙盼蓝、MTT的问题，但最后编委认为整篇文章的思路很好，也就不计较眙盼蓝、MTT的问题了。

实属兴运。

杂志Cancer Research Therapywm_ni丁香园主任国内由于实验条件的问题，应用H3的还是不多，而以MTT为主，以我的经验眙盼蓝计数法误差确实很大，所以不知道bengbu_bli的观点源自何处，另外如果有一个好的idea，如果不能用好的方法去证实，实在是一种遗憾，当然发不发还是要看编辑了。

MTT法测细胞增殖

MTT法细胞增殖2015.05.13 热娜1.方法步骤（from 吴荃论文）a. 接种细胞：用含10%胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液，以每孔1000-10000个细胞接种到96孔板，每孔体积200ul。

b. 培养细胞：同一般培养条件，培养3-4天（可根据实验目的和要求确定培养时间）。

c. 呈色：培养3-4天后，每孔加MTT溶液（5mg/ml，用PBS；ph=7.4；配）20ul，继续孵育4小时，种植培养，小心吸弃孔内培养上清液，对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液。

每孔加150ul DMSO，震荡10min，使结晶物充分融解。

d. 比色：选择570nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。

2.MTT原理MTT全称为3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-yl)-3,5-di-phenytetrazoliumromide ，是一种接受氢离子黄颜色的染料。

MTT分析法以活细胞代谢物还原剂3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-yl)-3,5-di-phenytetrazoliumromide ，MTT噻唑蓝为基础。

活细胞线粒体中琥珀酸脱氢酶能够代谢还原MTT，同时在细胞色素C的作用下，生成蓝色（或蓝紫色）不溶于水的甲臜（Formazan）, 甲臜的多少可以用酶标仪测定570nm处的光密度OD值推测出活细胞的数目。

由于死细胞中不含琥珀酸脱氢酶，因此加入MTT不会有反应。

3.MTT溶液的配制方法通常，此法中的MTT浓度为5mg/ml。

因此，可以称取MTT 0.5g，溶于100ml 的磷酸缓冲液（PBS）或无酚红的培养基中，用0.22um 滤膜过滤以除去溶液里的细菌，放4度避光保存即可。

在配制和保存的过程中，容器最好用铝箔纸包住。

（实验的时候我一般关闭超净台上的日光灯来避光，就得这样比较好。

）需要注意的是，MTT法只能用来检测细胞相对数和相对活力，但不能检测细胞绝对数。

细胞增殖检测-MTT

细胞增殖检测—MTT（一）MTT检测1、试剂及仪器磷酸盐缓冲液，胎牛血清，EDTA-胰酶，DMEM培养基，RPMI1640培养基，DMEM/F-12，α-MEM培养基，青霉素-链霉素（双抗），15ml离心管，1000ml移液枪，200ul移液，10ul 移液枪，200ul排枪，MTT，酶标仪，倒置显微镜，低速离心机，T25瓶，96孔板，计数仪，计数板等。

2、原理MTT是一种接受H+染料，活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT 还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。

二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在特定波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。

3、实验步骤：（1）接种细胞：用10%FBS的培养基配成单细胞悬液，以每孔1000-10000个细胞接种到96孔板，每孔200ul。

（2）培养细胞（悬浮细胞可直接加MTT，贴壁细胞等贴壁可加）（3）MTT配置：a.称取MTT 粉末，MTT 一般以粉末形式保存，需精密称取适量的MTT 粉末。

b.溶解MTT：将称取的MTT 粉末溶解于PBS（磷酸盐缓冲液）或无血清培养基中，搅拌使其充分溶解。

通常MTT 的终浓度为5mg/ml。

c.过滤除菌：使用0.22μm 的微孔滤膜过滤溶液，以去除可能存在的细菌和杂质。

d.分装保存：将过滤后的MTT 溶液分装至无菌的小瓶或离心管中，避光保存在-20℃冰箱中。

（4）呈色：每孔加（5mg/ml，用PBS配置）20ul，孵育4h，小心吸弃上清，每孔加150ulDMSO，摇床上振荡10min。

（5）比色：选择490nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，以时间为X轴，吸光值为Y轴绘制细胞生长曲线。

MTT法测定生长曲线标准化流程sop

MTT法测定生长曲线标准化流程（SOP）一、基本原理及实验目的MTT比色试验是一种检测细胞存活和生长的方法。

其原理是活细胞中某些物质能和MTT反应。

方法是利用DMSO溶解此结晶后，再用酶联免疫检测仪在490nm波处检测吸光度值。

此方法在生气活性因子的活性检测、抗肿瘤药物筛选、细胞毒性实验以及肿瘤放射敏感性测定等实验中广泛应用。

它具有灵敏度高、重复性好、经济、快速等优点。

二、主要仪器及试剂1．MTT溶液：称取100mgMTT粉末加入20mlPBS中，搅拌30min，使之充分溶解，过滤除菌，分装，4℃保存，2周内有效。

2．0.25%胰酶、含血清培养基、DMSO。

3．96孔板、移液器、离心管、血球计数板、酶联免疫检测仪等。

三、操作步骤1.常规消化细胞，离心收集细胞沉淀。

2.含血清培养基重悬，制成单细胞悬液。

3.细胞计数。

4.按一定的倍数稀释细胞悬液，调整细胞浓度至1×104个/ml.5.用移液器吸取约200ul稀释后的细胞悬液，加入96孔板，每板接种5孔，共接种9块96孔板。

并设置一对照孔，只加培养基。

6.放入孵箱常规培养，以后每隔两天换液1次。

7.第2天选择某一固定时间取出一块96孔板，每孔加入MTT溶液20ul。

8.37℃孵育4h后，小心吸弃孔内上清。

9.每孔加入150ul DMSO，震荡10min，使结晶充分溶解。

10.在酶联免疫检测仪上选择490nm 波长测定测定吸光度值，计算5孔的平均值。

11.以后每隔24h取出一块96孔板重复6～9的操作。

12.利用作图软件（如Excel等），以时间为横轴、吸光度值为纵轴绘制生长曲线。

四、结果判读实验所得的曲线应当是一条类似“S”形的曲线。

前1～3天内细胞处于潜伏期，随后进入对数生长期，最后的几天进入平台期。

因为在相同体积内细胞数与吸光度值成正比，所以在对数生长期，曲线的斜率越大说明细胞的群体倍数时间越短。

五、注意事项1.接种细胞时选择合适的细胞浓度。

MTT法检测细胞活性及其应用

MTT法检测细胞活性与其应用一、实验目的1.掌握MTT法的基本原理和操作,学会应用MTT法解决简单的实际问题.2.巩固动物细胞培养的知识,熟练相关操作.3.学会酶联免疫检测仪〔简称酶标仪〕的操作方法.二、实验原理1.MTT法又称MTT比色法,是一种检测细胞存活和生长的方法.其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒〔Formazan〕并沉积在细胞中,而死细胞无此功能.二甲基亚砜〔DMSO〕[三联溶液]能溶解细胞中的甲瓒,用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值,可间接反映活细胞数量.在一定细胞数范围内,MTT结晶形成的量与细胞数成正比.该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以与肿瘤放射敏感性测定等.它的特点是灵敏度高、经济.2.细胞冻存与复苏的基本原则是慢冻快融,实验证明这样可以最大限度的保存细胞活力.目前细胞冻存多采用甘油或二甲基亚砜作保护剂,这两种物质能提高细胞膜对水的通透性,加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外,减少细胞内冰晶的形成,从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤.复苏细胞应采用快速融化的方法,这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化,避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤.3.从动物机体中取出的相关组织通过胰蛋白酶或胶原蛋白酶可以将其分散成单个细胞.再放于适宜的培养基中,可以使这些细胞生长繁殖以供实验所需.该实验对无菌要求极高,以培养出满足实验条件的细胞.4.酶联免疫检测仪测定的原理是在特定波长下检测被测物的吸光值.酶标仪实质就是一台变相的专用光电比色计或分光光度计.三、实验材料,器材与试剂材料：Hela细胞〕,冰箱〔4℃、-20℃、-70℃〕,器材：恒温水浴锅,超净工作台,培养箱〔37℃,5%CO2液氮冰箱,灭菌锅,烧杯,培养瓶,滴管,酒精灯,镊子,离心机,24孔培养板,96孔培养板,摇床,酶标仪,倒置显微镜,移液枪〔带枪头〕,15mL离心管,冻存管〔1-2mL〕,红血球计数板,记号笔,0.22μm滤膜,铝箔纸.试剂：二甲基亚砜〔分析纯〕,甘油,10%胎牛血清,胰蛋白酶〔0.5%〕,双抗〔青霉素,链霉素 1万单位/mL〕,磷酸缓冲液〔配制见附录1〕,MTT〔 3-〔4,5-二甲基噻唑-2〕-2,5-二苯基四氮唑溴盐,商品名：噻唑蓝.〕〔配制见附录2〕,DMEM 培养液<配制见附录3>,无菌水,抗肿瘤药物〔具体待定〕四、实验步骤A.Hela细胞复苏1.从液氮容器中取出从液氮容器中取出冻存管,直接浸入37℃温水中,并不时摇动令其尽快融化；2. 从37℃水浴中取出冻存管,打开盖子,用吸管吸出细胞悬液,加到离心管并滴加10倍以上DEME培养液,混匀；3. 离心,1000rpm,5min；4. 弃去上清液,加入含10%胎牛血清的DMEM培养液重悬细胞,计数,调整细胞密度至1×104个/mL,部分接种培养瓶,37℃培养箱静置培养；5. 次日更换一次培养液,继续培养,此后定期更换培养液,维持细胞正常活性.B.MTT检测复苏细胞的细胞活性Hela细胞计数用血细胞计数板的四个角上的方块.1. 接种培养瓶同时,将其余部分接种于96孔细胞培养板,7组,每组5孔,每孔100μL,37℃培养箱静置培养；2.培养24h后,向每孔内加入用磷酸缓冲液配制的0.5%MTT〔5mg/mL〕20uL,37℃培养箱内培育；3.4h后终止培养,将孔内培养液小心吸出.每孔加入150μL二甲基亚砜,置摇床上低速振荡10min,使结晶物充分溶解.同时每行第一孔设置为调零孔〔培养基、MTT、二甲基亚砜〕.用酶标仪OD570nm处测量各孔吸光值；C.细胞生长曲线制作接B.2,B.3步骤,连续测量7天,根据测量结果绘制细胞生长曲线.[横坐标生长时间,纵坐标吸光度值.]D.探究某药物对于细胞活性的影响1.将之前培养于培养瓶中的细胞用0.5%胰蛋白酶洗脱,加入DEME培养液制成细胞密度为1×106个/mL的细胞悬液；2.设置空白对照组与5个不同药物梯度的实验组,分别加载96孔培养板内〔5个梯度剂量按药物种类待定〕,每个剂量分别设置5个平行孔,每孔加入细胞悬液100μL〔在加药的前一天下午完成铺板〕；3.次日上午按预先设置的药物梯度加药,后置37℃培养箱培养24h；4.每孔加入20μLMTT溶液,继续培养4h〔若药物能与MTT反应,可以先离心后弃去上清液,用PBS冲洗2-3遍后再加入MTT溶液〕5终止培养,小心吸去孔内培养液；6.每孔加入150μL二甲基亚砜,置摇床上低速振荡10min,使结晶物充分溶解,用酶标仪OD490nm处测量各孔的吸光度；7.同时设置调零孔〔培养基、MTT、二甲基亚砜〕,对照孔〔细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜〕.E.Hela细胞冻存1.配制含10%DMSO或甘油、10～20%小牛血清的冻存培养液；2.取对数生长期的细胞,用胰蛋白酶把单层生长的细胞消化下来,悬浮生长的细胞则直接将细胞移至15ml离心管中；3.离心1000rpm,5min；4.去除胰蛋白酶与旧的培养液,加入适量配制好的冻存培养液,用吸管轻轻吹打使细胞均匀,计数,调节冻存液中细胞的最终密度为5×106/ml～1×107/ml；5.将细胞分装入冻存管中,每管1～1.5 ml；6.在冻存管上标明细胞的名称,冻存时间与操作者；7.冻存：标准的冻存程序为降温速率-1～-2℃/ min；当温度达-25℃以下时,可增至-5℃～-10℃/min；到-100℃时,则可迅速浸入液氮中.也可将装有细胞的冻存管放入-20℃冰箱2h ,然后放入-70℃冰箱中过夜,取出冻存管,移入液氮容器内.五、实验结果Hela细胞复苏情况良好,生长曲线绘制较好,成功验证肿瘤细胞对Hela细胞的作用.六、附录1.磷酸缓冲液配制方法NaCl 8g, KCl 0.2g, Na2HPO41.44g, KH2PO40.24g, 调pH 7.4,定容1L2.0.5%MTT溶液配制方法称取MTT0.5g,溶于100mLPBS中,用0.22μm滤膜除菌,放4℃避光保存.配制和保存过程中,容器最好用铝箔纸包住.。

MTT实验方法

普通MTT法实验步骤：1：接种细胞：用含10％胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液，以每孔1000-10000个细胞接种到96孔板，每孔体积200ul。

2：培养细胞：同一般培养条件，培养3-5天(可根据试验目的和要求决定培养时间)。

3：呈色：培养3-5天后，每孔加MTT溶液(5mg/ml用PBS配制，pH=7.4)20ul。

继续孵育4 h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液。

每孔加150ul DMSO，振荡10min，使结晶物充分溶解。

4：比色：选择490nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。

药物MTT法实验步骤贴壁细胞：1：收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100ul，铺板使待测细胞调密度1000- 10000 孔，(边缘孔用无菌PBS填充)。

2：5%CO2，37℃孵育，至细胞单层铺满孔底(96孔平底板)，加入浓度梯度的药物，原则上，细胞贴壁后即可加药，或两小时，或半天时间，但我们常在前一天下午铺板，次日上午加药。

一般5-7个梯度，每孔100ul，设3-5个复孔。

建议设5个，否则难以反应真实情况3：5%CO2，37℃孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。

4：每孔加入20ulMTT溶液(5mg/ml，即0.5%MTT)，继续培养4h。

若药物与MTT能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用PBS冲2-3遍后，再加入含MTT的培养液。

5：终止培养，小心吸去孔内培养液。

6：每孔加入150ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。

在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。

7：同时设置调零孔(培养基、MTT、二甲基亚砜)，对照孔(细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜)。

MTT法

MTT法MTT：化学名：3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。

检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲臜（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。

二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲臜，用酶联免疫检测仪在490nm或570nm 波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。

在一定细胞数范围内，MTT 结晶形成的量与细胞数成正比。

该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。

它的特点是灵敏度高、经济。

MTT粉末和溶液保存时都需要避光，用铝箔纸包好就可以。

MTT实验吸光度最后要在0-0.7之间，超出这个范围就不是直线关系。

操作步骤：（1）单细胞悬液接种于96孔培养板；每孔培养基总量100微升（96孔培养板每孔容积370微升），37℃、5％CO2培养箱中培养一段时间（根据实验目的决定培养时间）；（2）加入5毫克／毫升（5mg/ml用PBS <pH=7.4>配）的MTT染液（10-20微升／孔）；继续培养3小时；（3）吸出孔内培养液后，加入DMSO液（100微升／孔），将培养板置于微孔板扳荡器上振荡10分钟，使结晶物溶解；（4）酶标仪检测各孔OD值（检测波长490nm）。

记录结果，绘制细胞生长曲线。

台盼蓝法活细胞不被染色，死细胞染成蓝色；用活细胞占细胞中的百分比表示细胞活力；方法：1、将细胞悬液以0.5ml加入试管中；2、加入0.5ml 0.4%台盼兰染液，染色2一3分钟；3、吸取少许悬液涂于载玻片上，加上盖片；4、镜下取几个任意视野分别计死细胞和活细胞数，计细胞活力；死细胞能被台盼兰染上色，镜下可见深兰色的细胞，活细胞不被染色，镜下呈无色透明状。

活力测定可以和细胞计数合起来进行，但要考虑到染液对原细胞悬液的加倍稀释作用。