层析技术分离生物大分子(凝胶过滤)

4、标准曲线的制作 （1）用洗脱液配制标准蛋白溶液供全班使用，溶液中 二种蛋白的浓度各为：牛血清清蛋白（10mg/mL）、溶 菌酶蛋白（10mg/mL）。 按（3）的操作方法加入上述标准蛋白溶液0.5mL，以 3-5mL/10min的速度洗脱并收集洗脱液。 同时用核酸蛋白检测仪测定A280，并确定各种蛋白的 洗脱峰最高点，然后计算出两种标准蛋白的洗脱体积 Ve。 5、以A280为纵坐标，Ve为横坐标画出标准蛋白的洗脱 曲线。（电脑画出） 6、以Kav为横坐标，LogMr为纵坐标作标准曲线。 在标准曲线上查出未知蛋白的LogMr，其反对数便是待 测定蛋白质的分子质量。 注意：实验完毕后，将凝胶全部回收处理，以备下次 实验使用，严禁将凝胶丢弃或倒入水池中。
图例：
凝胶过滤曲线 4.9 4.8 4.7 4.6 4.5 4.4 4.3 4.2 4.1 0 0.2 0.4 （Kav) 0.6 0.8 y = -0.9961x + 4.9165 R 2 = 0.9985
思考：SDS-PAGE和凝胶过滤分离蛋白质及测定分子量有 何不同？
(lgMR)
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一、原理
分配系数
Ve – Vo Kav=
Vt - Vo Vt——层析床总体积 Ve——洗脱液体积 Vo——外水体积 分子量大，全排出 分子量中 分子量小，进入内部
Ve= Vo Ve= Vo+ KavVi Ve= Vo+ Vi
Kav=0 0< Kav<1 Kav=1


凝胶柱总体积（Vt）的测定： 在最后走样品后,距离胶柱上端作一个记号， 回收凝胶，关闭柱出水口，加入去离子水，打开 出水口，液面降至柱记号处即关闭出水口，然后 用量筒接受柱中去离子水（水面降至层析柱玻璃 筛板），读出的体积即为柱床总体积Vt。


3、V0和未知蛋白Ve的测定
吸去柱上端的洗脱液（切不可搅乱胶面，可覆盖一张 滤纸或尼龙网）。打开出水口，使残余液体降至与胶面相 切（但不要干胶），关闭出水口。用移液枪吸取0.25ml （5mg/ml）蓝色葡聚糖-2000和未知蛋白（10mg/mL）的混 合液，小心地绕柱壁一圈（距离胶面2mm）缓慢加入，然 后迅速移至柱中央慢慢加入柱中，打开恒流泵（开始收 集！），待溶液渗入胶床后，关闭出水口，用少许洗脱液 加入柱中，渗入胶床后，柱上端再用洗脱液充满后用35mL/10min的速度开始洗脱，自动收集器收集时间为10min 每管。最后作出洗脱曲线。收集并量出从加样开始至洗脱 液中蓝色葡聚糖浓度最高点的洗脱液体积即为V0，至第二 个最高点为Ve。注意：蓝色葡聚糖及未知蛋白洗下来之后， 还要用洗脱液（1-2倍床体积）继续平衡一段时间，以备 下步实验使用。
凝胶是一种具有立体网状结构且呈多孔的不溶性珠状的颗粒物 质。用凝胶层析来分离生物大分子主要是根据多孔凝胶对近似于球形 不同半径的生物大分子具有不同的排阻效应实现的。即是依据分子量 的不同来进行分离的。对于某种型号的凝胶，一些大分子不能进入凝 胶颗粒内部而完全被排阻在外，只能沿着颗粒间的缝隙流出柱外；而 一些小分子不被排阻，可自由扩散，渗透进入凝胶内部的筛孔，而后 又被流出的洗脱液带走。分子越小，进入凝胶内部越深，所走的路程 越多，故小分子最后流出柱外，而大分子先从柱中流出。一些中等大 小的分子介于大分子和小分子之间，只能进入一部分凝胶较大的孔隙， 即被部分排阻，因此这些分子从柱中流出的顺序也介于大、小分子之 间。这样样品经过凝胶层析后，分子便按照从大到小的顺序依次流出， 达到分离的目的。



2、装柱
取洁净的玻璃层析柱垂直固定在铁架台上。 在柱中加入洗脱液（约1/3柱床高度），将凝胶浓 浆缓慢倾入柱中，待凝胶沉积1cm-2cm高度后打开 出水口，流速一般用3-5mL/10min（预先恒流泵调 好，记录流速）。胶面上升到柱记号处则装柱完 毕，注意装柱过程中凝胶不能分层。然后关闭出 水口，静置片刻，待凝胶完全沉降，则接上恒流 泵，用1-2倍床体积的洗脱液平衡柱子，使柱床稳 定。
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1、定义 层析分离是一个动态过程，它是由一个移动相（移动着的 气体或液体）对另一个固定相（不移动的固体或液体）作 相对连续移动，移动相里含有要分离的混合物质，在移动 过程中，各种溶质受到固定相不同程度的作用，达到分离。 2、分类： 吸附层析 分配层析 离子交换层析 凝胶层析 亲和层析 聚焦层析
二、实验流程及方法：
制备固定相（装柱） →平衡→上样→洗脱→ 收集→检测
实验操作
1、凝胶的溶胀


称取7g Sephadex G-75 于250 mL烧杯中加入洗脱 液100mL，置于室温溶胀2-3天，反复倾泻去掉细 颗粒，然后减压抽气去除凝胶孔隙中的空气，沸 水浴中煮沸2-3小时（可去处颗粒内部的空气以及 灭菌）。（此部分已经完成） 使用时在超声波中超声10分钟。