发酵特性及其种群动态

收稿日期： 2009-11-25 基金项目： 国 家 科 技 支 撑 计 划 （ 2011BAD15B04 ） ； 东 北 农 业 大 学 博 士 启 动 基 金 （ 2009RC34 ） ； 黑 龙 江 省 教 育 厅 科 学 技 术 研 究 项 目
（ 12511047） ； 中国博士后科学基金（ AUGA41309045） ； 黑龙江省博士后科学基金（ AUGA41100165） 通讯作者： 李文哲（ 1955—） ，男，教授、博士生导师，主要从事生物质能源转化与利用方面的研究。liwenzhe9@ 163． com
最大 稻草
乙酸量 失重率
/ mg·L － 1 / %
1． 48
90
1． 51
92
1． 57
89
1． 49
90
1． 50
87
1． 46
88
通过对比分析，该复合菌系属于兼性厌氧菌群， 发酵结束时，系统内的 DO 维持在0． 04 ～ 0． 10mg / L，
该微好氧 环 境 更 适 合 微 生 物 对 纤 维 素 的 分 解 和 利 用［6］。而从其末端液相代谢产物来看，经过 1a 的培 养考察，复合菌系产生的总挥发酸量最大值始终维 持在 1． 60 ～ 1． 70mg / L，其中液相代谢产物中以乙酸 为主，乙酸的最大质量浓度范围为 1． 45 ～ 1． 60mg / L， 占总挥发酸量的 90% 以上。以乙酸为主要代谢产
取 3mL 培养液离心（ 10000r / min） 5min 后，弃上 清液，收集菌体细胞，采用北京博大泰克生物基因技 术有限责任公司生产的细菌基因组 DNA 小量快速 提取试剂盒进行样品基因组 DNA 的提取。PCR 扩 增采用大多数细菌 16s rDNA V3 ～ V6 区的通用引物 BSF968GC 和 BSR1401。扩增产物采用 DCode 突变 检测系统（ Bio-Rad，Laboratories，Hercules，Calif） 进行 分析。聚丙烯酰胺凝胶浓度为 6% ～ 12% ，尿素和 甲酰 胺 变 性 梯 度 为 40% ～ 65% ，温 度 60℃ ，电 压 220V 电泳 6 ～ 8h，银染。目的条带经克隆转化后测 序。根据 16s rDNA 序列，通过互联网数据库 BLAST 进行比对，分析亲缘关系及相似性。
0． 10mg / L 之间，其主要的发酵液相末端产物中 90% 以上是乙酸，这对后续产甲烷相的产气提高起到至关重要的作
用。其连续发酵过程中微生物种群的动态结果显示，耐高温的短小芽孢杆菌类和具有高聚物强降解能力的抗热厌
氧梭菌属是复合菌系降解底物的主要微生物类群。
关键词： 连续分批补料； 发酵特性； 种群动态
图 1 复合菌系 FLW-1 分批补料过程中 pH 的变化 Fig． 1 Change of pH in fed-batch fermentation by microbial system FLW-1
2． 3． 2 发酵体系的 DO 值变化 图 2 表明，5 组分批补料发酵过程中 DO 值变化
趋势相似，即在 24h 内 DO 值由最初的 4． 50mg / L 变 为 0． 25mg / L，之 后 到 发 酵 结 束 DO 值 一 直 维 持 在 0． 05 ～ 0． 10mg / L。DO 值并未随稻草和 培 养 基 的 添 加而发生明显波动。添加培养基时，DO 值出现少量 增加，但由于复合菌系中有好氧菌存在，迅速消耗带 入体系内的溶解氧，DO 值在短时间内快速恢复到较
（ 东北农业大学工程学院，哈尔滨 150030）
摘 要： 以稻草为唯一碳源，从堆肥的高温期样品中成功定向筛选出一组复合菌系（ 命名为 FLW-1） ，该复合菌系
具有较强的遗传稳定性和 pH 缓冲能力。模拟生产实践进行连续批次补料实验，结果表明： 复合菌系 FLW-1 适于
微好氧环境发酵，在 24h 内 DO 值由最初的 4． 50mg / L 迅速降为 0． 25mg / L，之后到发酵结束 DO 值一直维持在 0． 05 ～
2． 3 复合菌系 FLW-1 分批补料的发酵特性 2． 3． 1 发酵体系的 pH 变化
复合菌系 FLW-1 的反应体系构成一个小的微生 态生物系统，体系内的 pH 变化趋势直接或间接影响 系统内微生物种群的生长发酵性能。监测分批补料
12 期
郑国香等： 复合菌系 FLW-1 在分批补料中的发酵特性及其种群动态
图 2 复合菌系 FLW-1 分批补料过程中 DO 值变化 Fig． 2 Change of DO in fed-batch fermentation by microbial system FLW-1
低水平，因而整个发酵过程中反应体系内的 pH 不 会出现 明 显 波 动。这 一 现 象 足 以 证 明 复 合 菌 系 FWL-1 是微好氧反应体系。 2． 3． 3 发酵体系的液相末端产物变化
表 1 复合菌系 FLW-1 的遗传稳定性 Table 1 The inherit stability of composite microbial
system FLW-1
传代 时间 /周
1 3 5 12 24 48
最大挥发 终
DO / mg·L － 1 酸总量 pH
/ mg·L － 1 7． 85 0． 07 ～ 0． 10 1． 63 7． 91 0． 06 ～ 0． 09 1． 66 7． 95 0． 07 ～ 0． 09 1． 70 8． 02 0． 05 ～ 0． 09 1． 64 7． 97 0． 04 ～ 0． 09 1． 66 8． 07 0． 05 ～ 0． 01 1． 60
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太阳能学报
32 卷
组（ C1 ～ C5 ） ，每次进出培养基量分别为 20、40、60、 80 和 100mL，33d 发酵培养结束。每隔 24h 取样监 测发酵液的 pH、DO 及发酵产物的组分和含量，发酵 终止后测定各组稻草的分解率。 1． 4 测定方法
稻草失重和液相末端的代谢产物分析方法参考 文献［7］。 1． 5 DGGE 分析
筛选，具体方法参考文献［6］。 1． 2 培养基
基础培养基和发酵培养基的组分一致，即： 蛋白 胨 3． 5g，酵母粉 0． 8g，碳酸钙 2． 0g，氯化钠 5． 0g，蒸 馏水定容至 1L。基础培养基的碳源为滤纸10． 0g， 发酵 培 养 基 的 碳 源 为 干 稻 草 10． 0g。121℃ 灭 菌 15min，10% （ V / V） 接种后，双层锡箔纸密封，50℃ 静 止培养。 1． 3 发酵培养
本文利用定向选育技术从堆肥的高温期样品中 成功筛选出一组高效分解木质纤维素复合菌系（ 命 名为 FLW-1） 。利用连续分批补料试验研究其发酵 性能及微生物菌群动态变化，为探讨复合菌系对天 然木质纤维素的降解机理和加速农作物秸杆资源的
利用研究提供重要的研究材料和奠定理论基础。
1 材料与方法
1． 1 复合菌系的筛选 从处于高温期（ ≥50℃ ） 的堆肥中取样进行定向
的菌液重复上述试验，直至复合菌系状态稳定。 2． 2 复合菌系 FLW-1 的稳定性
以稻草的分解效率、代谢产物种类和浓度以及 反应体系的遗传稳定性 3 项指标作为筛选高效复合
菌系的衡量指标。利用批次试验对复合菌系降解稻
草能力的遗传稳定性进行跟踪考察，经过连续传代， 即相隔 1 周、3 周、5 周、12 周、24 周和 48 周，分别进 行转接实验培养，以复合菌系的降解效率、终 pH、 DO 及液相代谢产物作为衡量指标，监测菌系的发酵 生长性能，具体数据见表 1。
第 32 卷 第 12 期
2011 年 12 月
文章编号： 0254-0096（2011）12-1741-07
太阳能学报
ACTA ENERGIAE SOLARIS SINICA
Vol． 32，No． 12
Dec． ，2011
复合菌系 FLW-1 在分批补料中的 发酵特性及其种群动态
郑国香，李文哲，关正军，刘震东，刘 爽，郑文玲
在 250mL 的培养瓶中加入 200mL 基础培养基， 10% （ V / V） 的接种量接入 FLW-1 原始菌液，50℃ 静 止培养。每隔 3d 加入 1． 0g 灭菌滤纸。定期观察滤 纸的降解状况，同时测定发酵液的组分。添加 10 次 滤纸后停止试验。以滤纸的快速降解和产物中高乙 酸、低丙酸含量作为驯化的衡量指标。对符合指标 的菌液继代培养，传代 5 次后，选取滤纸降解速度快
2 结果与分析
2． 1 复合菌系 FLW-1 的筛选与驯化 2． 1． 1 复合菌系的筛选
从高温堆肥中取出 20 组原始样品，以稻秆为唯 一碳源，以 滤 纸 作 为 指 示 标 志，利 用 批 次 试 验 在 50℃ 静止条件下培养，进行定向特异筛选。衡量指 标是滤纸的崩解速度和培养基的 pH 变化。初次筛 选时，取 20 份原始样分别接种于分离培养基中，定 期跟踪观察。滤纸崩解超过 5d 以及培养液的 pH 下 降速度缓慢的样品被淘汰。剩余 4 组进行连续的转 接，经过 30 次传代后，最后确定一组滤纸甭解速度 快且 pH 在 24h 内 迅 速 降 低 的 复 合 菌 系，命 名 为 FLW-1。 2． 1． 2 复合菌系的驯化
物的反应 体 系 将 更 有 利 于 后 续 产 甲 烷 相 的 综 合 利
用。而复合菌系对稻草的分解能力随传代次数和时
间的 增 加 维 持 在 一 个 相 对 稳 定 的 范 围 （ 84% ～ 91% ） 。从保存 48 周后监测的各项指标来看，复合 菌系 FLW-1 对稻草的分解率仍可达约 90% ，证明该 菌系具有很强的降解纤维素能力，具有很好的遗传 稳定性，可为后续的应用实践及代谢机理研究提供 关键的材料基础。
批次试验： 3 个同步试验组（ 每组 15 瓶） ，同时 进行，培养基的有效体积为 200mL，接种量为 10% （ V / V） ，50℃ 静止培养。24h 定期取样监测 pH、溶 解氧（ DO） 、稻草失重及发酵产物的组分和含量。
批次补料试验： 发酵培养基的有效体积 200mL， 接种量为 10% （ V / V） ，每隔 2d 添加 0． 6g 稻草。根 据每天抽取和添加培养基量的不同，将试验分为 5
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过程中反应体系内 pH 变化，结果表明，在补料发酵过 程中，各组实验中的 pH 变化曲线规律相似，如图 1。 第一次添加稻草后的 24h，反应体系内的 pH 迅速降 低，pH 由初始的 8． 6 降到约 6． 3，随着发酵的进行，体 系内的 pH 逐渐升高。当向反应体系内再次（ 每隔 2d） 添加稻草，同时更换定量的新鲜培养基后，由于微 生物营养物质的加入，致使反应体系内菌群的生物活 性保持较高水平，繁殖速度加快，代谢能力增强，产生 大量挥发酸，从而降低了整个反应体系的 pH，直至下 一次添加稻草和更换定量培养基。
在分批补料发酵实验中，培养基的抽取与添加 模仿实际工程发酵过程中的进出料过程，以验证该 复合菌系在工业发酵中的应用价值。实验分 5 组进 行，通过监测和分析液相末端产物的种类及其浓度， 可确定 C1 ～ C5 组中微生物菌群的整体代谢特征呈 现相似的规律性。
从代谢产物的种类来看，复合菌系 FWL-1 的液 相末端产物主要有 4 种，分别为乙酸、乙醇、丙酸和 丁酸，如图 3。5 组实验中，乙酸的质量浓度均远高 于其他 3 种液相末端产物，乙酸含量占总液相末端 产物的 90% 以上，而丙酸含量在 4 种液相末端产物 中最少。在稻草添加频率和添加量相同的情况下， 各组液相末端产物的含量随培养基的抽取和添加量 的增加而减少。C1 组的液相末端产物的总含量最 高，最大值为 3． 90mg / L； C5 组的液相末端产物的总 含量最低，为 2． 50mg / L。图 3（ 虚线处初为第 3 次添 加稻草点，以后以箭头标示为准） 中 5 组图各组分总 的变化趋势对比表明，相对于其他代谢产物，乙酸含 量的变化规律性较明显，从第 3 次添加稻草开始，乙 酸含量在 添 加 稻 草 后 呈 先 逐 渐 升 高 随 后 降 低 的 趋 势，直至下一次添加稻草。乙酸的规律性变化表明， 复合菌系经过前两次（ 9d） 的稻草添加，通过微生物 之间自身的协同作用，调节菌群代谢活性以适应反 应体系内各产物浓度的变化。乙醇含量的变化趋势 与乙酸不同，在整个发酵的前期，在添加稻草的 48h 时含量最大，后期含量迅速减少。这说明复合系中 与乙醇代谢相关菌群的相对数量、种群结构或代谢 途径发生改变。因此，可确定在稻草添加频率和添 加量相同的情况下，培养基的变化量在占总挥发酵 液体积 20% ～ 50% 的范围内变化时，复合菌系的代 Βιβλιοθήκη Baidu活性没有被破坏，表明此复合菌系对环境扰动的 适应性较强。
中图分类号： TQ920． 1
文献标识码： A
0引言
如何结合可行的生产工艺，在不污染环境的条 件下，充分利用秸秆等生物质资源，缓解能源紧张、 改善生态环境是真正实现沼气工业化和商品化生产 的前提条件之一［1］。秸杆等原料由于自身结构的特 殊性及纤维素分子的高结晶度，使其很难被单一微 生物降解。自然状态下彻底降解木质纤维素依赖于 纤维素分解菌、半纤维素分解菌及木质素分解菌等 多种微生物的共同作用。文献［2］在微生物生态学 的研究表明，利用微生物的广泛适应性和多功能性 可保证微生态系统的稳定性，纤维素降解应充分注 重多种微生物之间的协同效应。目前，利用微生物 相互协同作用降解秸秆等富含木质纤维素原料的生 物处理技术，由于具有高效性、环保性和能源可再生 性等优点而日益受到各国学者的关注［3 ～ 5］。