小鼠睾丸发育过程中Si1基因表达的研究

合集下载

精原干细胞移植技术研究进展

精原干细胞移植技术研究进展精子发生是男性生殖细胞增殖、分化的过程，始于青春期并维持终生。

精原细胞尤其是精原干细胞是持续维持精子发生的关键因素。

个体内可因缺乏精原干细胞或放疗、化疗而导致生精细胞发育障碍或产生无功能性精子等原因引起不育。

新近发展的精原干细胞移植技术为研究精子发生机理提供了新的途径。

本文简要综述这项技术的发展过程、主要方法以及最新进展和应用前景。

1 精原干细胞移植技术分类及发展过程精原干细胞同源移植技术包括自体移植和同种异体移植。

这项技术始于1994年Brinster等[1]将可育小鼠的精原干细胞注射到不育小鼠的曲细精管使受体鼠产生了具有受精能力的精子并产出了正常后代，这是精原干细胞移植的首次重要突破。

Honaramooz等[2]在实验中，将猪的生殖细胞移入自身对侧的睾丸（自体移植）和无关另外一头猪的睾丸中（同种异体移植），结果两者都未对供者的生殖细胞发生明显免疫应答，但植入猪睾丸中的小鼠生殖细胞却很快被清除，故他们认为免疫耐受现象只限于同源移植。

1996年Clonthier等[3]将大鼠睾丸细胞显微注射到无免疫应答的重度综合免疫缺陷(severe-combined immunodeficient mice，SCID)的裸小鼠的睾丸中，睾丸干细胞会继续发育，并产生带有供体细胞种属的精子发生，取得了跨物种产生精子的重大突破。

1999年Ogawa等[4]将小鼠的睾丸细胞移植到大鼠的睾丸中获得成功。

Sofikitis[5]等认为人类睾丸细胞移入小鼠或大鼠可使25%的受体产生精子，这似乎表明灵长类生殖细胞或多或少比其它非啮齿类、非灵长类种属与啮齿类动物生精小管的微环境更相容。

Napano等[6]发现人的精原干细胞能在小鼠睾丸中至少可以存活六个月，且在移植后第一个月能保持增殖但不能分化。

这种现象0gawa等认为可能是由于小鼠内源性的支持细胞缺乏足够的能力来支持系统发育距离较远的物种。

但用睾丸组织块异位移植可部分解决上述问题，2002年Honaramooz等将新生小鼠、猪或羊的睾丸组织块（0.5-1mm3）移植到阉割的裸鼠的背部皮下，结果60% 以上的移植物存活，而且体积增大，并最终产生成熟的精子。

雄性生殖系统中瘦素表达及功能的研究进展

金明昊，黄文一，张梦旖，张一苇，刘悦，丁之德△【摘要】男性生育力呈下降趋势，阐明其发生机制有助于男性不育症的精准医疗。

瘦素是一种主要由脂肪组织产生的激素，在调节机体能量代谢、参与炎性反应、促进生殖系统发育及维持其正常功能等方面具有重要的作用。

瘦素及其受体在哺乳动物下丘脑-垂体-性腺（HPG）轴的内分泌器官、睾丸、生殖道、附属生殖腺以及精子中均有广泛表达，其表达异常与雄性生殖系统发育迟缓或功能障碍相关。

阐明瘦素在雄性生殖系统中的表达及作用机制可为临床上治疗男性不育等相关疾病提供重要的理论基础。

【关键词】瘦素；受体，瘦素；泌尿生殖系统；生育力；精子发生；下丘脑-垂体-性腺轴Leptin and Male Reproduction JIN Ming-hao,HUANG Wen-yi,ZHANG Meng-yi,ZHANG Yi-wei,LIUYue,DING Zhi-de.Department of Clinical Medicine,Grade2018,8Years Program(JIN Ming-hao,HUANGWen-yi,ZHANG Meng-yi,ZHANG Yi-wei),Department of Histology,Embryology,Genetics and DevelopmentalBiology(LIU Yue,DING Zhi-de),School of Medicine,Shanghai Jiao Tong University,Shanghai200025,ChinaCorresponding author:LIU Yue,E-mail:****************.cn;DING Zhi-de,E-mail:***************.cn 【Abstract】The downward trend in male fertility has become increasingly obvious in the world.To clarifythe etiology and pathogenesis of this trend is very helpful for the precision treatment of male infertility.Leptin,ahormone produced mainly by adipose tissue,plays an important role in regulating energy metabolism,responding to inflammation,promoting the development of reproductive system and maintaining reproductive function.Leptin andits receptor can widely express in mammals′HPG axis,testicular tissue,genital tract,accessory glands and sperm.The abnormal expression of leptin is related to the delayed development or dysfunction of the male reproductivesystem.To verify the leptin expression in male reproductive system and to elucidate its molecular mechanism mayprovide critical theoretical evidences for the clinical treatment of reproductive diseases such as male infertility.【Keywords】Leptin;Receptors,leptin;Urogenital system;Fertility;Spermatogenesis;Hypothalamus-pituitary-gonad axis（ＪＩｎｔＲｅｐｒｏｄＨｅａｌｔｈ蛐ＦａｍＰｌａｎ，2021，40：38-43）·综述·基金项目：上海交通大学医学院第十四期大学生创新训练计划（1420Y014），上海交通大学基础医学院第十四期RBL项目（2020001）作者单位：200025上海交通大学医学院临床医学系2018级临床八年制（金明昊，黄文一，张梦旖，张一苇），组织胚胎学与遗传发育学系（刘悦，丁之德）通信作者：刘悦，E-mail：****************.cn；丁之德，E-mail：***************.cn△审校者瘦素（leptin）是一种蛋白质类激素，主要由脂肪组织分泌，也可由脑垂体前叶、精子等非脂肪组织或细胞分泌。

新基因TSC43在小鼠和人睾丸组织中的表达分析

ｅｐｅｓｎｉｅｄｖｌｐｎａｔｅｆｅｔａｅｔｅ．ｅｆｌｌｎｔＤｆ１６ｐｃｎａｎｌｏｅｅｄｎｒｍｅｏｘｒｓｉｔｅｅｏｍｅｔｌｓｇｏｔｉｗｓｉｎｉｄＴｌｅｈｅＮＡｏ３４ｂｏｔｅａｐｎｒａｉｇｆｏｎｈａｓｓｓｄｉｆｈｕｇｉｄｌａｆ
ｌｅｙｖｒｕｉｎｒａｅｔｌ．ｅｕｓＡｎｖｌｅｔ－ｅｉｅｅ（ｎａｋＡｃｓｏｏＸｙｄｂａｏｓｏｆｍｆｏＲｓｌｏｅｔｉｓｃｃｇｎＣＢｎｃｅｓｎＮ：Ｍ一１６０）ｗｔａｄｅｎａｚｉｂｉｏｉｏｓｔｓｐｆｓｅｉ５１６ｉｉｒｔｌｈｆｅｉ
维普资讯
中国实验诊断学
２Ｏ年２Ｏ８月
第１２卷
第２期
＿＿
＿—
—
１４３－— －－ —
文章编号：０７— ２７２０）２１３４１０４８（０８０ —０４ —０
新基因ＴＣ３小鼠和人睾丸组织中的表达分析Ｓ４在
Ｓｅｉｒｕｏｆｔｅｔｔ－ｐｃｆｅｅｃｒｆ￣ｗｓｉｅｔｅｙＲ－ＣＴｅｃａａｔｒｔｓｏ￣ｌｔｅｅｒｒ — Ｕｄｓｉｔｎｏｈｉｓｅｉｃｇｎｉｍｉｏｇ／ａｎｉｄｂＴＰＲ．ｈｈｒｃｅｓｃｓｔｂｉｓｅｓｉｓｎｅｌｄｆｉｉｉｆｅｅｇｎｗｅａａｅｄｓｅｉ
ＴＣ。亚细胞定位预测显示ＴＣ基因可能在细胞核中表达。ＥＩ能域分析表示该基因可能参与了ｃＭＳＡ３ＳＡ３Ｂ功ＡＰ依赖的Ｐ（ｒｅｒｓ）ＫＰｏｉ－ｅ的锚定。Ｒ－ＣｔｎａＴＰＲ分析表明ＴＧ３基因特异性表达于小鼠睾丸组织中且具有时序性表达。ＴＧ３蛋Ｓ４Ｓ４白在人的同源基因Ｃｎａｋ登录号为Ｎ１２３，３１氨基酸区域内有４％的同源性，＂ｃ３ｈＳ４）因特异ｅＢｎＭ－５５９在８个９人ｒＡ（ＴＣ３基ｓ性地表达于人睾丸组织中。结论ＴＣ３因的表达与小鼠精子发生的过程一致，ＳＡ基在小鼠及人的睾丸组织中特异性表达，显示其可能在精子发生中起着重要作用。关键词：基因芯片；隆；Ｓ４克ＴＧ３基因；精子发生；ＴＰＲＲ－Ｃ

神经生长因子在不同周龄小鼠睾丸组织中的表达

化，外吸收法测定ＲＡ浓度及纯度，脂糖凝胶紫Ｎ琼
电泳检测其完整性。１４２引物的设计：．．参照Ｇｎａｋ中所登录的小鼠ｅｂｎ
（Ｎ０３０）、大鼠（Ｘ００７３）人Ｍ１６９Ｍ０１５１０、
进行了分析，以探讨ＮＦ与睾丸组织发育和精子发Ｇ
大利ＢｏＲｄ司；ＭＬ２型显微镜：国Ｌｉ。ｉ－ａ公ＤＢ德ｅｃａ
１４方法．
１４１总ＲＡ的提取及检测：用Ｔｉｌ剂盒．．Ｎ利ｒｏ试ｚ
提取各周小鼠睾丸组织中的总ＲＡ，规方法纯Ｎ常
生的关系。
（Ｍ０２０）牛（Ｍ５００）ＮＦ基因序列，Ｎ０５６、Ｘ８９７的Ｇ在
ＮＢ上进行同源性比较，用Ｐｉｅ．ＣＩ利ｒｒ０软件在小ｍ５
１材料与方法
１１实验动物．实验动物为山西医科大学实验动物中心提供的成年昆明种小鼠（动字第０００医７１２号）共３，２只（雌雄比例３：１。笼养一周后，照雌３只／１）按雄
Ｋｔ５ｐＤＡｍｒｅｉ０ｂＮａｋｒ由大连宝生物公司提供；、
ＲｂｉａｔＮＦ即用型ＳＢａｂｔｎｉＧ、．ＡＣ试剂盒、ＡＤＢ显色试
剂盒（Ｒ０２由武汉博士德生物工程有限公司提Ａ１２）

小鼠睾丸发育过程睾丸特异基因表达与不育的研究的开题报告

小鼠睾丸发育过程睾丸特异基因表达与不育的研究
的开题报告
一、研究背景
睾丸是雄性哺乳动物生殖系统中的重要器官，其发育过程涉及到许多分子和基因的调控。

与此同时，男性不育也是一种常见的生殖问题，其中睾丸功能异常是造成不育的主要原因之一。

因此，对睾丸发育与基因表达的研究对于揭示不育的病理机制以及开发治疗不育症的方法具有重要意义。

二、研究目的
本研究旨在探究小鼠睾丸发育过程中的睾丸特异基因表达，并结合睾丸发育不良小鼠模型，探究某些基因在小鼠睾丸发育过程中的作用及其与不育之间的关系。

三、研究内容及方法
1. 收集小鼠睾丸发育相关的文献资料，了解小鼠睾丸发育的过程及其特异基因表达情况。

2. 构建小鼠睾丸发育不良模型，观察其睾丸发育情况，并进行组织学分析。

3. 采用PCR、Western blot等方法检测睾丸特异基因的表达情况，探究其在小鼠睾丸发育过程中的作用。

4. 利用生物信息学技术对筛选出的特异基因进行功能注释和基因网络分析，探究其与不育之间的关系。

四、预期成果
1. 在小鼠睾丸发育过程中筛选出一批关键的睾丸特异基因。

2. 探究这些特异基因在小鼠睾丸发育过程中的作用及其与不育之间的关系。

3. 提供一些有价值的基础数据和理论基础，为不育的病理机制研究和治疗方法的开发提供一些参考依据。

Sirtuins_蛋白在双酚A_诱导的雄性生殖系统损伤模型小鼠睾丸组织和GC-2_细胞中的表达及其意

第 49 卷第 5 期2023年 9 月吉林大学学报（医学版）Journal of Jilin University（Medicine Edition）Vol.49 No.5Sep.2023DOI：10.13481/j.1671‑587X.20230501Sirtuins蛋白在双酚A诱导的雄性生殖系统损伤模型小鼠睾丸组织和GC-2细胞中的表达及其意义符璐, 叶严珏, 李江英, 汤子怡, 尹俐（重庆理工大学药学与生物工程学院生物制药系，重庆400054）［摘要］目的目的：探讨Sirtuins（Sirt）蛋白家族在双酚A（BPA）诱导的雄性生殖系统损伤细胞和动物模型中的作用，阐明其对BPA诱导的雄性生殖系统损伤的影响。

方法方法：40只昆明种小鼠随机分为对照组、低剂量BPA组（给予3 mg·kg－1·d－1 BPA）、中剂量BPA组（给予30 mg·kg－1·d－1 BPA）和高剂量BPA组（给予300 mg·kg－1·d－1 BPA），每组10只。

低、中和高剂量BPA组小鼠采用玉米油（0.01 mL·g－1）配成相应浓度BPA灌胃，对照组小鼠给予0.01 mL·g－1玉米油。

5周后，检测各组小鼠体质量、睾丸指数和附睾指数，计算机辅助精液分析（CASA）系统检测各组小鼠精子质量，HE染色观察各组小鼠睾丸组织形态表现，Western blotting法检测各组小鼠睾丸组织中Sirt1~Sirt7蛋白表达水平。

小鼠GC-2细胞分为0、20、40和80 µmol·L－1 BPA组（给予0、20、40和80 µmol·L－1 BPA处理），EdU荧光染色法检测各组GC-2细胞增殖率，流式细胞术检测不同细胞周期各组GC-2细胞百分率和细胞凋亡率，Western blotting法检测各组GC-2细胞中Sirt1~Sirt7蛋白表达水平。

Rfx2基因在小鼠睾丸中的表达研究

ｍａｏｅｅｉｒｌｅｅｅ．ｓｌＴｅｃａａｔｒｔｓｏｅｄｅｅｔｅｐｅｓｄｇｎｓｗｒｎｌｚｄｂａｉｓｂｏｒｏｍａｉｓｔｏｓｔｇｎｓ —ｅａｄｇｎｓＲｅｕｔｓｔｓｈｈｒｃｉｉｆｈｉｒｎ－ｘｒｓｅｅｅｅａａｙｅｙｖｒｕｉｉｒｔｏｌｅｓｃｔｆｅｏｆｃａｄｆａｙｏｅｇｎａｈｓｎｔｆｒｅｌｖｓｇｔ，ｉｈｗａｏｆｍｅｓＲｘｙｔｅｄｔｂｓＣＩＴｅｓａｉｇｈｂｉｚ — ｎｎｌｎｅｅｗｓｃｏｅｔｒｉｅｔａｅｗｈｃｓｃｎｉｄａｆ２ｂａａａｅｉＮＢ．ｈｃｎｙｒａｉｌｏｕｈｙｎｉｒｈｎｌｉｄｔｎｓｎｎｅｓｅｆｆ２ｗｒｒｄａｌｅｇｔｅｉｅｅｏｍｅｔｌｔｅｆｍｏｓｅｔ．ｏｎｔｎｅｔｅｓａｎｅｓｉｓｉｉａｉｔｎｉｓｏｘｅｅｇａｕｙｈｉｈｅｄｗｔｄｖｌｐｎａｓｇｓｏｕｅｔｓｓＦｒｉｓｅ，ｈｉｌｉｔｎｉｅｏｇｌｉｔＲｌｎｈａｉｅｎｇｔ
ＵｉｒｔＳｅｚｎＨｓｉｌＳｅｚｅ１０６Ｃｉ）ｎｅｉｈｎｈｏｔ，ｈｎｈｎ５８３，ｈａｖｓｙｅｐａｎ
ＡｓａｔＯｊｃｖＴｃｅｅｅｅｗｉｅｇｉｃｎｙｃａｇｄｉｍｕｅｐｒａｇｎｓ．ｔｏｓＴｓｓＤＡｂｔｃ：ｂｅｔｅｏｓｅｎｔｎｓｈｃｗｒｓｎａｔｈｎｅｏｇｓｅｍｔｅｅｉＭｅｄｅｔＮｒｉｒｈｇｈｅｉｆｌｉｎｏｓｈｅｃ

不同时期小鼠睾丸睾酮合成能力差异机制的研究

农业生物技术学报 Journal of Agricultural Biotechnology2007,15(2):207~211*基金项目：国家自然科学基金项目(No.30270955)；西农博士启动基金(2004博01)资助。

**通讯作者。

Author for correspondence.教授，主要从事生殖生理和生殖内分泌研究。

Email： <j.zhang@>.收稿日期： 20060724接受时期： 20060831·研究论文·不同时期小鼠睾丸合成睾酮能力的差异 *王鲜忠，孙燕，吴建云，罗英，贾孙涨，胡淮杰，张家骅 **（西南大学动物科技学院，重庆市牧草与草食家畜重点实验室，重庆 400716）摘要：不同发育阶段，睾丸合成睾酮的能力差异很大。

为了阐明引起睾酮合成差异的分子机制，实验以不同年龄的 SPF昆白小鼠 ,采用 RTPCR与Western blot分析了不同年龄阶段类固醇合成酶的变化。

结果显示：（1）在不同年龄阶段，（胆固醇支链裂解酶） mRNA、（3β 羟胆固醇脱氢酶） mRNA、（类固醇合成快速调节蛋白） mRNA和蛋白的水平无明显变化；（2）（C 1720裂解酶） mRNA的表达水平在 30、 60和 120d均处于较高的水平，但是在 270d则处于较低的水平；（3） 30~270d，细胞外信号调节激酶(ERK)活性无明显变化。

表明， mRNA表达差异可能导致不同时期睾酮合成能力差异的重要原因，但ERK活性可能与衰老引起睾酮合成能力下降无直接关系。

关键词：睾丸；类固醇合成;小鼠；年龄中图分类号： S188 文献标识码： A 文章编号： 10061304(2007)02020705Changes of the Ability of Testosterone Synthesis in Mouse Testis of Different PeriodsWANG Xianzhong,SUN Yan,WU Jianyun,LUO Ying,JIA Sunzhang,HU Huaijie,ZHANGJiahua**To study the mechanism of changes of the ability of testosterone synthesis in different periods,Kunbai mouse in different periods were used as experimental animals.The ability of testosterone synthesis was analyzed by RTPCR and Western blot.The results were as followed:(1)In all periods,the expression of cholesterol side chain decomposition enzyme( ),3betahydroxysteroid de hydrogenase( )， steroidogenic acute regulatory protein(StAR)mRNA and protein had no significant change.(2)The levels of cy tochrome P45017alphahydroxylase( )mRNA were high in10,60and120d.However,that of mRNA decreased sig nificantly in270d.(3)From30d to270d,the activity of extracellular signal regulated kinases(ERK)had no significant change.These re sults inferred that the difference of the level of mRNA was an important factor of the difference of the level of testosterone,butthe activity of ERK had no direct relation with the decrease of mRNA and the level of testosteronetestis;steroidogenesis;mice;age睾酮具有维持生精作用、刺激生殖器官发育、维持正常性欲和促进蛋白质合成的生理作用（王启荣和杨则宜， 2004）。

免疫球蛋白超家族成员Izumo是精卵融合的必要蛋白

免疫球蛋白超家族成员I z u m o 是精卵融合的必要蛋白1Naokazu Inoue, Masahito Ikawa, Ayako Isotani & Masaru Okabe 2陈凌译、江一平校作为构建人体的60万亿细胞的代表，精子和卵子相遇、互相识别并融合形成新一代生命。

精卵膜融合即受精是非常重要的事件，人们长期致力于寻找与该事件相关的因子[1]。

最近，已发现CD9是卵膜上与精卵融合相关的基本因子[2-4]，但精子方面与卵膜融合相关的因子尚未找到。

本文报道，运用抑制融合的单克隆抗体[5]和基因克隆技术，我们找到了精子的融合相关抗原，并发现该抗原是免疫球蛋白超家族的一个新蛋白。

我们将该基因命名为Izumo 并培育了该基因缺陷的小鼠品系。

Izumo -/-小鼠是健康的，但其雄性不育。

雄性的Izumo -/-小鼠能产生外观正常且能结合并穿透透明带的精子，但这些精子却不能与卵膜融合。

人精子也含有Izumo ，而且抗人Izumo 抗体能阻止人精子与去透明带的金黄地鼠卵融合。

为了寻找人精子中与卵膜融合的关键因子，我们利用2-D 电泳分离小鼠精子粗提蛋白，然后用能特异性阻断精卵融合的抗精子单克隆抗体OBF13[5]进行免疫标识，分离到一种精子跨膜蛋白成分，我们以日语中的婚姻之神 “Izumo ”① 为之命名。

通过液相串联质谱（LC-MS/MS ）分析发现，该蛋白中的10条短肽段与小鼠蛋白质数据库中一段名为RIKEN 的注册序列的部分肽段完全匹配（NCBI 登录号：XM_133424）。

利用该注册序列设计引物，我们成功地利用RT-PCR 从小鼠睾丸总RNA 中分离到该蛋白的编码序列。

同时，从人类基因组数据库中我们还查到了该蛋白的人类同源物的编码序列（NCBI 登录号：BC034769），该序列编码一种特殊的免疫球蛋白超家族（IgSF ），是一种I 型跨膜蛋白，其胞外部分为免疫球蛋白结构域，并可能含有一个糖基化位点（图1，a ，b ）。

减数分裂特异基因sycp1在小鼠精母细胞中的表达

维普资讯
山西医科大学学报（ＳａｘＭｅＩ）ｏ璺墨ＪｈｎｉｄＪｖ２０堡ｎ
文章编号：１０ —６１（０８００７６１２０）８—０７６３—０４
ｉ墨
・
６３・７
减数分裂特异基因ｓｃ，小鼠精母细胞中的６ｃｉｏ
ＡｂｔａｔＯｂｅｔｖＴｏｉｖｉａｅｔｅｓｅｉｃｅｐｍｓｎ０ｉｉｇｎｙＰｕｉｕｅｓｅｍａｇｎｓｓａｄｉｏａｉａｉｎｓｒｃ：ｊｃｉｅｎ￣ｔｔｈｐｃｆｘｒｉｆｏｓｅｅｓｃｌｒｎｍｏｓｐｒｔｅｅｉｎｔｌｃｌｔｇｉｏｍｅｓ－ｄｇｏｓｚｏ
关键词：联会复合体；ｓｃ减数分裂；同源染色体ｙｐ；
中图分类号：Ｒ２．３１１文献标识码：Ａ
蛋白在雄性小鼠精母细胞核内的表达与ＳＣ的形成和成熟同步，参与了同源染色体之间的联会和重组。
Ｅｘｒｓｉｆｍｅｏｉ－ｐｃｆｃｇｎｙｃｎｐｒａｏｙｅｎｓｐｅｓｏｎｏｉｓｓｓｅｉｅｅｓｐｌｉｓｅｍｔｃｔｓｏｆｌｏｕｅｉ
ｔｅｎｆｒｕｕｕｅ．ＩＩＩｎｆｏ￣ｃｎｅｓａｎｎｓｕｉｚｄｔｅｎｔａｅｈｉｔｂｔｎｏＹＣＰｎｔｅｎｃｅｓｏｅｈｓｍｉｉｏｓｔｂｌｓＩＩＵｏｌｒｅｃｔｉｉｇｗａｔｉｄｍｏｓｒｔｔｅｄｓｒｕｉＳｅＴＴｕｌｅＯｉｏｆ，ｉｈｕｌｕｆ

Ass1在不同组织中的表达定位、调节及生理病理功能阐述-生理学论文-生物学论文

Ass1在不同组织中的表达定位、调节及生理病理功能阐述-生理学论文-生物学论文——文章均为WORD文档，下载后可直接编辑使用亦可打印——精氨琥珀酸合酶（argininosuccinate synthase 1,Ass1）能够催化瓜氨酸和天冬氨酸形成精氨琥珀酸，在精氨琥珀酸裂解酶（argininosuccinate lyase,Asl）的作用下，生成精氨酸。

精氨酸通过精氨酸酶水解生成尿素和鸟氨酸，鸟氨酸既可以被鸟氨酸脱羧酶代谢，生成多胺；也可以在鸟氨酸转氨酶作用下重新生成瓜氨酸，形成尿素循环；另外，精氨酸还可以通过一氧化氮合酶（nitric oxide synthase,NOS）作用生成一氧化氮（nitric oxide,NO）和瓜氨酸，形成瓜氨酸---一氧化氮循环。

因此，Ass1 是生成精氨酸、尿素和NO 的关键限速酶。

根据精氨酸的代谢途径不同，Ass1 在组织中表达水平也是不同的。

本篇综述主要就Ass1 在不同组织中的表达定位、表达调节及生理和病理功能进行阐述。

一、Ass1 的生化结构Ass1 为编码精氨琥珀酸合酶的基因，位于第9号染色体。

Ass1 由同源四聚体构成，包含412 个氨基残基。

比较cDNA 序列发现，Ass1 在人、牛、大鼠和小鼠中高度同源。

它能催化瓜氨酸与天冬氨酸在ATP 的作用下生成精氨琥珀酸。

人的Ass1 结构包含三个主要部分：核苷酸结合部分、合成酶部分及多聚化的螺旋 C 端。

对瓜氨酸血症的病人研究发现，Ass1 有多种突变位点。

大多数位点突变后会破坏它们与周围单体形成二聚体或使它们与周围单体的作用缺失，导致构象改变和电子的重新分布。

此外，一些突变位点是直接与底物结合（如Gln40（Leu）和Arg127（Gln））,并很可能对催化活性起直接作用。

还有一些位点突变（如Val345（Gly））,使得一些和瓜氨酸相互作用的区域和大部分寡聚化区域缺失，使蛋白不能正确的折叠。

二、Ass1 的表达定位Ass1 早期发现于肝细胞中。

SET在小鼠睾丸组织中的表达

以促进精子发生及调节激素合成仍不清楚。本研究
育：于湿盒中３７ｏＣ，１ｈ；ＤＡＢ显色：ＤＡＢ液显色，室温５～１０ｓ。
苏木素复染：ｄｄＨ２０终止显色后，苏木素复染１０ｍｉｎ．流水冲
ＣＧＡＣＧＡＧＡＣＣＴＣＡＧＡＡＡＡＡＧＡＡ一３，反向５一ＴＧＧＴＹＧＡＣＡ —
１．１．１实验动物
ＳＰＦｌＩ级１，４，１２周龄和１２个月龄的ＩＣＲ雄
ＡＡＴＧＩＴＧｒｒＡＣＣＣＡ一３（产物长度２０７ｂｐ）；１３－ａｃｔ减数分裂Ｉｓ１。本课题组前期研究表明，ｓＥＴ通过调节卵巢中胆固醇ｌ７一羟化酶／１７，２０裂解酶
（Ｐ４５０ｃ１７，ＣＹＰ１７）启动子活性和生物学活性，调节
卵巢内的Ｔ生成。但是，在睾丸中ＳＥＴ蛋白是否可
（ＨＯ：）处理１０ｍｉｎ。抗原修复：放入乙二胺四乙酸（ＥＤＴＡ）水溶液中，微波炉中高火３ｍｉｎ，低火７ｍｉｎ，室温冷却３０ｍｉｎ；磷酸盐缓冲液（ＰＢＳ）清洗３次。封闭：５％牛血清蛋白（ＢＳＡ）封闭液室温封闭１０ｍｉｎ；一抗孵育：Ｃａｌｒｅｔｉｎｉｎ抗体（ＳａｎｔａＣｒｕｚ产品）稀释于抗体稀释液中（１：１０００），置于湿盒中４℃过夜（＞１６ｈ）；阴性对照是采用无免疫效应的ＩｇＧ。二抗（ＨＲＰ标记）孵

Caspase-3和Bcl-2在小鼠出生后睾丸发育和精子发生过程的表达

ＨＥＪｎｐｎ，ＹＯＵｎ — ，ＸＩｉｎｓａｕ — ｉｇＲｏｇＬｉＥＪａ — ｈｎ，ＤＯＮＧａｇｓｅｇＣｈｎ — ｈｎ
（ｏｌｇｆＡｎｍａｉｎｃｎｃｏｏｙ，ａｉＡｇｉｕｔｒｌＵｎｖｒｉｙ，ａｇ３８ＣｌｅｏｉｌＳｃｅｅａｄＴｅｈｎｌｇＳｈｎｘｒｃｌｕａｉｅｓｔＴｉｕ０００１，ｉａｅＣｈｎ）Ａｂｔａｔｓｒｃ：ＴｈｅｐｅｅｔｄｙｉｅｔｇａｅｈｅｅｐｒｓｉｆＣａｐｓ一ｎｄＢｃ一ｎｍｏｕｅｔｓｉｒｎｈｒｓｎｔｓｕｎｖｓｉｔｄｔｘｅｓｏｎｏｓａｅ３ａｌ２ｉｓｅｔｓｄｕｉｇｔｅｐｒｃｓｓｎａａｖｌｐｍｅｔａｄｓｅｍｃｕｒｅｃｈｅｐｓｎａａｏｅｓｏｆｐｏｔｔｌｄｅｅｏｎｎｐｒｏｃｒｎｅｏｆｔａｔｔｌｍｏｕｅｓ．ＴｈｅｅｒｓｉｓａｅｘｐｅｓｏｎｏｆＣａｐｓ一
ｍｕｎｈｉｔｃｅｃｌｍｅｈｏ．ｏｓｏｈｍｉａｔｄＴｈｅｒｓｔｈｗｅｈｔＣａｐａｅ３ａｌ２ｅｐｅｓｄｉｈｅｔｓｉｆａｌｓａｅｕｌｓｓｏｄｔａｓｓ一ｎｄＢｃ一ｘｒｓｅｎｔｅｔｓｏｌｔ — ｇｓｗｅｅｏｅｖｄＣａｐｓ一ｏｉｉｅｃｌｓｗｅｅｏｅｖｄｉｈｅｃｎｔａａｔｏｅｎｆｒｓａｄｔｐｅ－ｅｒｂｓｒｅ．ｓａｅ３ｐｓｔｖｅｌｒｂｓｒｅｎｔｅｒｌｐｒｆｓｍｉｉｅｏｕｎｈｅｓｒｍａｏｎｉ－ｙｏｄａ４一ｙｏｌｏｅｓｔｓｉｉｈｅｓｒａｏｎｉｎｒｏｉｃｌｓｏ８ｄｙｏｄｔｇｏａｏｆ７ｄａ — ｌｎｄ１ｄａ — ｄｍｕｓ ’ ｅｔｓ，ｎｔｐｅｍｔｇｏａａｄＳｅｔｌｅｌｆ２一ａ — ｌａ６ｄｙｏｌｎｄ５一ａ－ｄｍｏｕｅ’ ｅｔｓＮｏＣａｐｓ一ｓｔｖｓｏｂｅｖｄｉｈｅｓｒｔｙｅｎｄｓｅｍａｏｏ．ｓｓｔｓｉ．ｓａｅ３ｐｏｉｉｅｗａｓｒｅｎｔｐｅｍａｏｃｔｓａｐｒｔｚａＩｈｅｔｓｉｆ７ｄａ～ｄａｄ１一ａ — ｌｕｓＢｃ一ｌｃｌｚｄｎｃｎｔａａｔａｐｒｔｇｎｉ．Ｉｈｎｔｅｔｓｏ－ｙｏｌｎ４ｄｙｏｄｍｏｅ，ｌ２ｏａｉｅｉｅｒｌｐｒｎｄｓｅｍａｏｏａｎｔｅｔｓｉ８ｄｙｏｄａ一ａ — ｌｏｅ，ｌ２ｌｃｌｚｄｉｈｅｓｍｉｉｅｏｕｏｅｔｓｏｆ２一ａ — ｌｎｄ５ｄｙｏｄｍｕｓＢｃ一ｏａｉｅｎｔｅｎｆｒｓｃｍｐａｔｅ，ｔｅｅｅ６ｒｍｎｔｗｉｈａｐｒｆｒｎ— ｔａｄｕｎｌｃｍｐａｔｅｔｉｎｎｔｅｓｍｉｆｒｕｓｔｂｕｌｓＣａｐｓ一ｎｄＢｃ一ｘｅｓｄｉｈｅｔｓｉｉｌａｌｍｉａｏｒｍｎｔｓａｎｉｇｉｈｅｎｉｅｏｕｅ．ｓａｅ３ａｌ２ｅｐｒｓｅｎｔｅｔｓｏｏｅｄｉｇｔｏｔａａｖｌｍｅｎｄｓｅｍｏｃｒｅｃ．ｒｎｇｔａｌｔｇｅｏｏｓｎｔｌｄｖｌｆｍｕｓｕｒｎｈｅｐｓｎｔｌｄｅｅｏｐｎｔａｐｒｃｕｒｎｅＤｕｉｈｅｅｒｙｓａｆｐｔａａｅｅ —

小鼠睾丸组织特异基因RNA干扰载体的构建及其表达的研究

Ｋｉ（ｒｍｅａ。ｐＵＰｔＰｏｇ）ＳＥＲ— ＰＮＥＯ载体购自ＧＦＯｉｏｎｉｅｌＥｇｎ公司、ｐｓＥ．１体购自ＣｏｔｈｇｄＲＤＮ载ｌｎｅ公ｃ司，ａｋ抗体由北京奥维亚生物技术有限公司合成。Ｆｎｌ
董婉维－李兆阳王，，惟杨葳１郑志红１，，
（．１中国医科大学实验动物部，辽宁省实验动物转基因重点实验室，沈小鼠睾九组织特异基因Ｆｎｌａｋ干扰载体，为进一步研究Ｆｎｌ因功能ａｋ基
３０５
实验动物与比较医学ＬｂｒｔｒｎｍａａｄＣｍｐｒｔｅｄｉｅａｏａｏｙＡｉｌｎｏａａｉｉｎｖＭｅｃ
Ｄｅ２０．８６ｃ０８（）２
．
・
论
著・
小鼠睾丸组织特异基因ＲＮＡ干扰载体的构建及其表达的研究
１１材料．
广泛表达［，进一步研究Ｆｎｌ因的功能将有助１］ａｋ基
于揭示其精子生成过程中的作用及意义。ＲＮＡ干扰（ＮＡｉｔｒｒｎｅＲｉ最近几年发现和发展Ｒｅｆｅｃ，ＮＡ）ｎｅ是起来的一门新兴的在转录水平上的基因阻断技术。作者将利用ＲＮＡｉ的方法构建Ｆｎｌａｋ干扰表达载体，为后期制备Ｆｎｌ扰转基因小鼠及研究其在精子ａｋ干生成过程中的作用奠定基础。
１．Ｓｐｒｈａｋ重组质粒的构建．１ｕｅｓＦｎｌ２ｐ —

绵羊不同繁殖状态下SIX1和TEF基因的表达特征分析

绵羊不同繁殖状态下SIX1和TEF基因的表达特征分析李春艳;张子军;储明星;狄冉;任春环;郭晓飞;刘秋月;王翔宇;胡文萍;张效生;张金龙【摘要】试验旨在探究SIX1和TEF基因在苏尼特羊(Sunite sheep,SNT)和小尾寒羊(Small Tail Han sheep,STH)相关组织中的表达特征,有助于揭示上述2个基因在绵羊季节性发情和繁殖调控中的重要作用.选取季节性发情的SNT母羊在短光照(模拟繁殖季节)和长光照(模拟休情期)条件下及常年发情的STH母羊在不同繁殖时期(卵泡期和黄体期)的下丘脑等10种组织,利用qPCR技术分析上述不同繁殖状态下各组织中SIX1和TEF基因的相对表达量.结果表明,SIX1基因在SNT和STH 的垂体组织中均高表达,其它组织中微弱表达;TEF基因在2个绵羊品种的多个组织中广泛表达;SNT垂体中TEF基因在短光照条件下其表达量显著高于长光照条件(P ＜0.05),STH垂体中TEF基因在卵泡期其表达量显著高于黄体期(P＜0.05);SNT子宫体中TEF在长光照条件下其表达量显著高于短光照条件(P＜0.05),STH子宫体中TEF在黄体期其表达量极显著高于卵泡期(P＜0.01).研究结果显示,SIX1和TEF基因表达在绵羊垂体中发挥重要作用,2个基因在SNT垂体中的表达变化趋势与已知的长光照诱导基因EYA3的表达变化不同,暗示绵羊垂体中SIX1和TEF基因不是通过转录水平变化来参与季节性发情上游基因的调控;TEF基因可能参与绵羊不同繁殖状态下子宫生理变化的调控.本研究为深入探究这2个基因在绵羊繁殖性能调控方面的作用奠定了基础.【期刊名称】《家畜生态学报》【年(卷),期】2019(040)003【总页数】6页(P17-22)【关键词】绵羊;同源盒基因(SIX1);胚胎促甲状腺因子(TEF);季节性发情;繁殖时期【作者】李春艳;张子军;储明星;狄冉;任春环;郭晓飞;刘秋月;王翔宇;胡文萍;张效生;张金龙【作者单位】安徽农业大学动物科技学院,合肥230036;中国农业科学院北京畜牧兽医研究所/农业部动物遗传育种与繁殖重点实验室,北京100193;安徽农业大学动物科技学院,合肥230036;中国农业科学院北京畜牧兽医研究所/农业部动物遗传育种与繁殖重点实验室,北京100193;中国农业科学院北京畜牧兽医研究所/农业部动物遗传育种与繁殖重点实验室,北京100193;安徽农业大学动物科技学院,合肥230036;中国农业科学院北京畜牧兽医研究所/农业部动物遗传育种与繁殖重点实验室,北京100193;中国农业科学院北京畜牧兽医研究所/农业部动物遗传育种与繁殖重点实验室,北京100193;中国农业科学院北京畜牧兽医研究所/农业部动物遗传育种与繁殖重点实验室,北京100193;中国农业科学院北京畜牧兽医研究所/农业部动物遗传育种与繁殖重点实验室,北京100193;天津市畜牧兽医研究所,天津300381;天津市畜牧兽医研究所,天津300381【正文语种】中文【中图分类】S826绵羊(Ovis aries)的季节性发情性状制约了肉羊生产效率，导致羔羊肉四季供给不均、羊肉市场价格波动较大。

SGR4和GFRa-1基因在小鼠睾丸移植物中的表达

论著SG R4和GFRa -1基因在小鼠睾丸移植物中的表达肖琴,于洁,龙霞,万汇涓,叶静,张芳婷,尹美−,房家智基金项目:广东省自然科学基金资助项目(04007312);深圳科技计划项目(200404101,200803004)作者单位:518036广东省深圳市,北京大学深圳医院输血科(肖琴,北京大学医学院2007年硕士研究生);北京大学深圳医院中心实验室(于洁,龙霞,万汇涓,叶静,张芳婷,尹美−,房家智)通讯作者于洁,536广东省深圳市,北京大学深圳医院中心实验室;y j @1 【摘要】　目的　检测小鼠睾丸异体异位移植物中SG R4和GFR a -1基因,对采用该动物模型进行睾丸组织移植在生殖医学中应用的可行性进行评估。

方法　以新生1～2d 小鼠睾丸组织为供体,雄性去势免疫缺陷小鼠为受体进行组织移植;在移植后不同时间段(分为3d 、1～10周共11个组)取出移植物,采用RT -PCR 法对移植物中生精阶段特异性基因SGR4和GFRa -1进行检测;分析2种基因在精子发生不同阶段出现的时间及表达情况,并与相应各时期正常小鼠睾丸中的基因表达相比较;同时进行组织形态学观察,对比各种基因出现的时间与小鼠睾丸发育周期的吻合程度。

结果　在11个时间段取出的移植物中,GFRa -1在出生3d 就开始表达,表达持续恒定;SRG4在出生2周内的小鼠睾丸中呈低表达,直至出生3周,S R G 4基因在小鼠睾丸中开始大量表达,以后表达持续恒定在高水平。

2种基因表达趋势与正常昆明小鼠睾丸中的表达基本相同,并与小鼠发育周期基本吻合。

结论　将新生小鼠睾丸组织移植到免疫缺陷小鼠体内后,生精细胞的发育在组织形态和SG R4、GFR a -1基因出现的时间上与正常小鼠相似。

【关键词】　睾丸;移植物;生精阶段特异性基因;SGR4;G FR a -1 【中图分类号】R 3391211　【文献标识码】A 【文章编号】1007-9572(2008)12-2219-04Expr essi on of GFRa -1an d SGR4i n Allogr a fts fr o m M ou s e Te stes XIAO Q in,Y U J ie ,LONG X ia,et a l .Centra l L abora tory ,Shenzhen Hospita l of P eking U niversity ,Shenzhen 518036,China 【Abstra c t 】　O bjec ti ve T o eva luate the fea sibility of using these ani m al mode ls t o pe rfor m mous e testis grafti ng by de 2t ec ting the ex p re ssion pattern of m ale ge r m cell stage -s pec i f i c genes SG R4and GFRa -1i n grafts after neona tal mous e te stes grafted i nto castra t ed i mmunodefic i ent m ice.M e thods Tiss ue trans planta ti on wa s performed with te stis tissue s f r om newb orn Kunm i ngm ice aging 1～2days as donors and m ale ca stra t ed i mmun odeficient as accep t ors .Graftswere taken out a t different ti mepoints (on day 3,in weeks 1～10,alt og e the r 11po i nts ),to deter m ine the st age -s pecific expre ssion of G FRa -1and SG R4mRNA i n grafts by usi ng reverse transc ri pta s e -poly merase chain reac tion (R T -PCR ).W e ana lyzed the appearance and ex 2pre ssion of the t wo gene s i n diffe rent deve l opmental pha ses and co mpared them with those of n o r mal t e stes,thus t o find out the co 2i ncidence bet ween the appea rance ti me of all genes and mouse t e stis deve l op m ent a l pha ses .Re s u lts In grafts obtained fr om re 2cep t ors at different experi mental ti me points,GFRa -1beg an t o ex press 3days after birth,with a continuous and constant ex 2pre ssion .SRG 4s ho wed a lo w expre ssion 2weeks after birth,but a high began 3weeks after,and then it went continuously and constantly .The t w o de ter m ined genes de monstra ted a trend basically si m ilar t o those seen in nor m al Kun m ing mous e te stes andtallied wit h mou s e develo pm enta l pha s e s on the whole .C onclu sio n All ografts fro m neonatal mouse testis graf t ed int o i m munode 2ficient m ice could express the s ame GFR a -1and SG R4mRNA as seen in n o r mal Kun -m ing m ice . 【Key wor d 】　Testis;Trans plants;Spe r ma t ogenic stage -s pecific gene;SG R4;G FRa -1 哺乳动物的精子发生是一个复杂的过程,研究表明,有2000个以上的基因参与了生精过程,尤其是对人类精子发生的研究,由于缺乏合适的模型,精子发生机制中还存在许多悬而未决的问题。

小鼠睾丸实验报告

一、实验目的本研究旨在通过利用shRNA慢病毒技术，高效敲降雄性小鼠睾丸基因，建立快速、高效的睾丸特定基因敲降动物模型，为生殖生物学研究提供有力工具。

二、实验材料1. 实验动物：出生24天昆明小鼠（雄性），由南京医科大学生殖医学国家重点实验室提供。

2. 试剂：shRNA表达载体（pSliencer-GFP-shSox30）、对照质粒（pSliencer-GFP-shScramble）、慢病毒颗粒、免疫荧光试剂等。

3. 仪器：显微镜、荧光显微镜、PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统等。

三、实验方法1. 构建shRNA表达载体：设计靶向睾丸特异性表达基因Sox30的shRNA序列，构建pSliencer-GFP-shSox30表达载体及其对照质粒pSliencer-GFP-shScramble。

2. 慢病毒包装：将shRNA表达载体和对照质粒分别与慢病毒包装载体共转染293T 细胞，收集慢病毒颗粒。

3. 动物模型制备：将慢病毒颗粒通过网微注射转导至出生24天小鼠睾丸生精小管管腔。

4. 免疫荧光检测：利用免疫荧光技术检测敲降组小鼠睾丸组织中Sox30蛋白表达水平。

5. 生精细胞发育观察：观察敲降组小鼠生精细胞发育情况，包括圆形精子、期生精细胞等。

四、实验结果1. Sox30蛋白表达水平检测：敲降组小鼠睾丸组织中Sox30蛋白表达水平显著下调，与对照组相比，差异具有统计学意义（P<0.05）。

2. 生精细胞发育观察：敲降组小鼠生精管腔中圆形精子发育阻滞在23步，期生精管腔中无长型精子，与对照组相比，差异具有统计学意义（P<0.05）。

五、实验讨论1. Sox30基因在生殖生物学中的重要作用：Sox30基因是Sox基因家族的一员，具有促进生殖细胞发育、维持生殖系统稳态等功能。

本研究通过敲降Sox30基因，发现小鼠生精细胞发育受到显著影响，说明Sox30基因在生殖细胞发育过程中具有重要作用。

2. shRNA慢病毒技术在基因敲降中的应用：shRNA慢病毒技术具有高效、特异性强、易于操作等优点，在基因敲除研究中具有广泛应用。

Borealin基因在小鼠中的表达

Borealin基因在小鼠中的表达张前军;卢光琇【摘要】【目的】研究Borealin在小鼠早期胚胎及睾丸中的表达情况,初步探讨Borealin的生物学功能。

【方法】利用体外合成RNA探针,采用全胚胎原位杂交检测Borealin基因在9.5～10.5日龄小鼠胚胎中的表达,免疫组化检测Borealin基因在成年小鼠睾丸中的表达,RT-PCR等方法检测Borealin基因在成年小鼠多组织中的表达。

【结果】Borealin在小鼠9.5～10.5日龄胚胎的头部和成年小鼠生精小管基底部细胞的部位有较强的表达,在睾丸、卵巢、肠以及眼睛组织中的表达量较其他组织高。

【结论】Borealin在小鼠9.5～10.5日龄胚胎头部及成年小鼠睾丸中均有特异性表达,可能参与了成体干细胞功能的维持。

%【Objective】 The study was done to investigate the function and the expression of Borealin for the mouse development specially,testis.【Method】 In-situ hybridization was used to detect the expression of Borealin in the 9.5-10.5-d mouse embryo;immunohistochemistry was taken to investigate the expression of Borealin in the testis of adult mouse;RT-PCR was applied to detect the expression of Borealin in the multi-tissues of the adult mouse.【Result】 Borealin is highly expressed in the brain of 9.5-10.5-d embryo and the fundus of the seminiferous tubules.The expression of Borealin in ovary,testis,gut and eye is higher than in other tissues.【Conclusion】Borealin is expressed specifically in the brain of 9.5-10.5-d embryo and the testis of mouse,and it is involved in the function maintaining of adult stem cells.【期刊名称】《西北农林科技大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2012(040)006【总页数】6页(P7-12)【关键词】Borealin;全胚胎原位杂交;精原干细胞;纺锤体【作者】张前军;卢光琇【作者单位】中南大学生殖与干细胞工程研究所,湖南长沙410078 中南大学人类干细胞国家工程中心,湖南长沙410078;中南大学生殖与干细胞工程研究所,湖南长沙410078 中南大学人类干细胞国家工程中心,湖南长沙410078【正文语种】中文【中图分类】Q786Borealin基因是一个染色体过客复合物（CPC）组分，其对肿瘤细胞的分裂与增殖及染色体的稳定具有重要的意义，RNA干扰其表达后会出现多极纺锤体及染色体分离滞后等异常的细胞分裂事件［1］。

1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。

云南大学学报(自然科学版),2007,29(2):208～212CN53-1045/N　ISSN0258-7971 JournalofYunnanUniversit yΞ小鼠睾丸发育过程中Si1基因表达的研究罗　兰1,2,李水冰1,余　敏1,谭德勇1(1.云南大学生命科学学院生物化学与分子生物学实验室,云南昆明　650091;2.昆明医学院基础医学院细胞生物学暨医学遗传学教研室,云南昆明　650031)摘要:以1天龄、未成熟(3周龄)、成熟期(10周龄以上)的昆明正常小鼠睾丸组织为实验材料,利用地高辛标记的Si1基因探针在其组织切片上进行DNA-mRNA分子原位杂交,探讨Si1基因在小鼠睾丸发育过程中的表达变化.同时,分别在生后15,20d及25d的昆明小鼠睾丸组织切片上进行凋亡细胞原位检测,验证小鼠睾丸上述发育时期的细胞凋亡情况.结果发现:①Si1基因在1天龄小鼠的睾丸组织生精上皮内无杂交信号;在未成熟小鼠的睾丸组织部分生精上皮内有极强的杂交信号;在成熟小鼠的睾丸组织生精上皮内无杂交信号.②小鼠睾丸组织生精上皮内,凋亡细胞数从生后第15～20天呈增加趋势,于生后第20天出现峰值,生后第25天又降低.上述结果表明Si1基因可能参与了小鼠睾丸的发育过程,在小鼠睾丸发育的特定时期发挥作用,由于Si1基因的表达与小鼠生精细胞凋亡发生的时期同步,表明该基因可能与小鼠睾丸发育过程中的细胞凋亡有关.关键词:小鼠;睾丸;Si1基因;基因表达;凋亡中图分类号:Q344.13 文献标识码:A 文章编号:0258-7971(2007)02-0208-05 Si1基因是一个新的功能基因(GenBank接受号:AY050169),目前对于Si1基因的功能还知之甚少,以往的研究中表明它与细胞周期的增殖调控有关,可能是一个细胞生长抑制基因,即一个细胞周期负调控基因[1].在肿瘤中,一个SNP位点被发现,该位点在非肿瘤人群中的分布频率为14%,而在肠癌中的分布频率达到51.5%.表明该基因与肠癌有密切关系[2].生殖细胞的发育是一个极为特殊的分化过程,也是一个极特殊的细胞周期运行过程.在这一过程中,既有生殖细胞本身的频频分裂增殖,又有其不断地发育分化和死亡[3].研究细胞周期调控基因在生殖细胞发育过程中的表达既可探讨生殖细胞的发育机制,也可从另一个角度探讨细胞周期调控机制,并可探讨细胞周期调控基因在生殖细胞发育过程中的生理功能.此外,近年来的研究表明,小鼠睾丸发育过程不仅存在细胞的生长和分化过程,也涉及了生精细胞的退化过程.有形态学及生化研究表明,生精细胞的退化主要通过细胞凋亡来实现[4].有学者对不同发育阶段小鼠生精细胞的凋亡作了系统的研究,发现凋亡细胞数从生后1d到生后3周有增加的趋势,于生后第3周出现峰值,之后降低[5].Si1基因既然与细胞周期和肿瘤发生有关[1,2],它与发育过程也许有一定的联系.探讨Si1基因在小鼠睾丸生殖细胞发育过程中的表达,对探讨小鼠睾丸中生殖细胞发育的分子机制有重要的参考意义.由于小鼠睾丸生精细胞在发育过程中存在退化,因此本文同时考察小鼠睾丸生精细胞发育过程的凋亡,以探讨Si1基因与生精细胞凋亡过程的联系.1　材料与方法1.1　生物学材料Ξ收稿日期:2006-06-10　基金项目:国家自然科学基金资助项目(39960030,30360040);云南省应用基础研究基金资助项目(1999C002Z).　作者简介:罗　兰(1973-),女,湖南人,硕士,主要从事细胞生物学及医学遗传学方面的研究.1.1.1　小鼠睾丸　Si1基因原位杂交实验选用昆明种健康雄鼠,小鼠分组为:1天组为1天龄小鼠;未成熟组为3周龄小鼠;成熟组为10周龄以上小鼠.每组选3只小鼠.细胞凋亡原位杂交检测亦选用昆明种健康雄鼠,小鼠分组为:生后15,20d及25d,每组选3只小鼠.1.1.2　Si1基因探针　Si1基因cDNA由本实验室克隆并保存.DIG(地高辛)标记、检测试剂盒(购自德国宝灵曼公司),细胞凋亡检测试剂盒购于迈新公司.1.2　实验方法1.2.1　组织切片制备　小鼠断颈处死后取睾丸, 10%中性甲醛固定,常规石蜡包埋.切片厚9μm,用甘油蛋白粘片剂贴于预先用APES(3-氨基丙基三乙氧基硅烷)处理过的载玻片上,37℃温育24 h后,室温干燥备用.1.2.2　Si1基因探针制备　按常规方法扩增并抽提克隆的Si1基因质粒DNA,用Bam HⅠ和HindⅢ酶切,胶回收插入的cDNA片段.取回收的cDNA片段约1μg,加入混合六聚寡核苷酸引物2μL(Hexami2 cleotidemaxture),标记DigoxigenindUTP2μL, Klenow聚合酶1U,消毒四蒸水补充到总体积为20μL,37℃保温20h,然后加2μL0.2mol/LEDTA,2μL4mol/LLiCl终止反应.-20℃无水乙醇(2.5倍)沉淀DNA,-20℃过夜.12000r/min离心20 min,沉淀用50μL1×TE溶解.1.2.3　H.E染色　按常规H.E染色操作.1.2.4　Si1基因组织原位杂交　小鼠睾丸组织按常规组织化学方法进行固定,切片.每组随机取5张切片.原位杂交按文献[6]进行,稍加修改.1.2.4.1　预处理　石蜡切片经二甲苯脱蜡2次,每次20min.用无水乙醇洗2次,每次10min.置空气中干燥,在2×SSC中常温饱和20min.1.2.4.2　预杂交　用消毒滤纸擦干组织切片周围的液体,但保持组织湿润.玻片置于6×SSC饱和的湿盒中,组织材料上加40～50μL预杂交液,42℃孵育4～5h.1.2.4.3　杂交　在预杂交液中加入适量的变性标记探针达最终质量浓度50n g/mL,每张玻片上滴加40～50μL,42℃湿盒过夜.1.2.4.4　免疫显色　将杂交后的玻片置2×SSC 中洗1h,1×SSC中洗1h,0.5×SSC37℃洗30 min,0.5×SSC室温洗30min.封闭剂(3%牛血清白蛋白,0.3%TritonX-100,BufferⅠ(100mmol/L Tris・HCl,150mmol/LNaCl,pH7.5)稀释)中室温孵育2h,以消除非特异性抗原.复合抗体Dig-AP用BufferⅠ按1∶500稀释,室温孵育过夜. BufferⅠ洗2次,每次15min,NBT显色液暗盒显色6h,EDTA终止反应.乙醇系列脱水,二甲苯透明,树胶封片.Ol ympus显微镜下观察照相.1.2.5　细胞凋亡原位检测　切片于37℃的二甲苯中脱蜡10min,然后在室温下保温5min.系列酒精逐级复水(100%,95%,85%,70%,50%室温各3min)后,用0.85%NaCl洗5min,1×PBS洗5 min.4%的多聚甲醛室温固定15min后,1×PBS 洗3次,每次5min.用20μg/mL的蛋白酶K室温消化20min,1×PBS洗5min.4%的多聚甲醛室温再固定10min后,1×PBS洗3次,每次5min.在切片上滴加平衡缓冲Buffer液,室温10min.在冰上混匀平衡Buffer液、生物素标记的核苷酸的混合物、末端转移酶(TdT酶)(体积比98∶1∶1),滴加到切片上,PBS湿盒内37℃孵育60min.2×SSC终止反应,室温15min.PBS洗3次,每次5min,以除去生物素标记的dNTP.滴加0.3%的H2O2室温封闭5min,以封闭内源性的过氧化物酶.PBS洗3次,每次5min.用PBS稀释辣根过氧化物酶标记生物素(500∶1),进行抗体连接,室温孵育30min,随后PBS洗3次,每次5min.每张切片加2滴新鲜配制的DAB溶液,显微镜下观察5～10min,阳性颗粒为棕黄色.自来水冲洗终止反应,二甲苯透明,中性树胶封固.Ol ympus显微镜下观察照相.2　结　果2.1　小鼠睾丸的H.E染色2.1.1　1天龄睾丸(见图1A)　曲精小管呈实心管状,由支持细胞和原始生精细胞构成.细胞基本排列成1层,紧贴基膜,核呈长圆形.局部区域也有2层细胞.部分节段上,近中央部位有一些核大而圆的细胞.曲精小管之间有大量的间质细胞.2.1.2　未成熟鼠睾丸(见图1B)　这一时期的睾丸曲精小管多已经空腔化,有些截面上可见到2种类型的细胞,靠近管壁的1层或几层细胞体积小,排列902第2期罗　兰等:小鼠睾丸发育过程中Si1基因表达的研究紧密,细胞核小而致密(染色深),核为圆形.而近管腔中间的内层细胞则体积稍大,细胞核亦稍大,且染色较浅;有些截面上只见到1种类型的细胞,细胞体积小,排列紧密,细胞核小而致密(染色深),核为圆形,呈1层或几层排列.总体上,曲精小管之间的距离较大,不像成熟组睾丸中那样多彼此贴近.2.1.3　成熟鼠睾丸(见图1C )　该组曲精小管的组织结构与未成熟组有很大区别,其生精上皮细胞已完全有了分化.所有截面上可见精原细胞层、初级精母细胞层、精子细胞及成熟精子等各级细胞.在绝大多数曲精小管正(中)横截面上,包括精原细胞和生精干细胞在内的细胞,贴近基膜,排列成1层,这1层细胞体积小,排列紧密,细胞核小而致密(染色深),多数核为圆形,个别为椭圆形.从第2层细胞开始,细胞的体积与其核的体积都变大,有些为精原细胞的2倍以上,从形态学指征判断:第2,3层(个别地方还包括第4层)为初级和次级精母细胞.初级精母细胞和次级精母细胞以内细胞的特点是其胞体和胞核均明显比精母细胞小得多,大致与精原细胞相同或更小,胞核也较致密,从形态学指征判断为精子细胞.这一时期曲精小管中已有大量充分变态或正在变态中的精子.2.2　Si1基因原位杂交结果　Si1基因在1天龄小鼠的睾丸组织中,生精上皮无论哪一层细胞中均未检测到明显的杂交信号(见图2A ).在未成熟小鼠睾丸组织部分生精上皮内出现或强或弱的杂交信号,部分生精上皮内的信号极强,并且具有杂交信号的细胞是离开基底膜第2,3层及其以内的细胞(见图2B );而在成熟小鼠睾丸组织中生精上皮的无论哪一层细胞中均未检测到明显的杂交信号(见图2C ).2.3　细胞凋亡原位检测结果　原位检测的阳性细胞,其阳性颗粒呈棕黄色,大小不一,形态各异,分布不均匀.生后第15天,生精上皮内已经有凋亡细胞出现,凋亡细胞集中于生精上皮内离开基底膜第3层及其以内的细胞(见图3A ).至生后第20天,生精上皮内的凋亡细胞数量达到了高峰,信号也最强,离开基底膜第2层及其以内的各层均有凋亡细胞(见图3B ).但至生后第25天起,生精上皮内的凋亡细胞数量便急剧下降,且凋亡细胞仅集中于离开基底膜的第1层及第2层细胞,且信号强度减弱(见图3C ).A:1天龄小鼠;B:未成熟小鼠;C:成熟小鼠图1　小鼠睾丸的H.E 染色结果Fig.1TheresultsofH.EstaininginmicetestisA:1天龄小鼠;B:未成熟小鼠;C:成熟小鼠图2　Si1基因在小鼠睾丸中的表达结果Fig.2TheexpressionofSi1geneinmicetestis012云南大学学报(自然科学版) 第29卷A:生后第15天;B:生后第20天;C:生后第25天图3　小鼠睾丸发育过程中的细胞凋亡原位检测结果Fig.3Theresultsofdetectionofapoptoticcellsinsituduringthedevelo pmentofmicetestis3　讨　论3.1　Si1基因在小鼠睾丸发育过程中的作用　本研究小组通过比较血清培养细胞和血清饥饿细胞的基因表达差异,获得了一段血清饥饿细胞中特异表达的cDNA 序列,以此序列出发,通过搜索表达序列标签(EST ),拼接出完整的基因序列,通过PCR 分段克隆获得全长cDNA 序列.该基因cDNA全长5429b p,编码框预测有791个氨基酸残基,共有21个外显子.GenBank 搜索,该基因与已有的细胞周期调控基因没有同源性.所以,该基因是一个新的与细胞周期有关的基因(GenBank 接受号:AY050169).由于该基因最初发现在无血清培养条件下表达,故叫血清抑制基因(seruminhibit gene,Si1基因)[1].目前对于Si1基因的功能研究还处于起步阶段.Si1基因在U251细胞血清抑制培养中有较高的表达,而U251细胞在血清抑制培养后大量进入到G 0期,由此推测其可能是细胞由G 1期进入G 0期的调控基因,是一个细胞周期负调控基因.我们曾对p16,p21和p53基因在血清培养和血清饥饿细胞中的表达进行过研究[7],发现在血清饥饿细胞中较血清培养细胞中表达较强,Si1基因也有一样的表达特征,表明该基因有可能是一个细胞生长抑制基因.本研究中,Si1基因在1天龄小鼠和成熟小鼠的睾丸组织中生精上皮内没有表达,但在未成熟小鼠的睾丸组织部分生精上皮内出现表达,部分生精上皮内的表达信号极强,这一结果表明;Si1基因可能参与了小鼠睾丸的发育过程,并在小鼠睾丸发育的特定时期发挥作用.3.2　Si1基因与生精细胞凋亡　在细胞凋亡原位检测的组织切片中,我们发现,在小鼠睾丸发育过程中,特定时期存在着生精细胞的凋亡现象.本研究表明:凋亡细胞从生后15～20d 有增加的趋势,于生后第20天出现峰值,之后迅速降低.这一结果与张健等人的研究结果[5]一致.本研究结果表明,在小鼠个体发育首次精子发生期间,出现了一个较为明显的凋亡波,有学者认为此凋亡波的出现是保证随后的精子正常发生所必需的,其生理意义很可能是调节并保持生精细胞与支持细胞的最适数目比,以保证生精细胞发育和分化的正常进行[8].也有学者认为,在精子发生过程中,由于增殖而产生一些染色体异常的细胞,细胞凋亡是对这些细胞的负选择[9].本研究结果表明,在未成熟(3周龄)小鼠睾丸组织的部分生精上皮内出现极强的Si1杂交信号,并且具有杂交信号的细胞是离开基底膜第2,3层及其以内的细胞;而同期(生后第20天)有强烈凋亡信号的细胞也是离开基底膜第2层及其以内的各层细胞.二者的阳性结果是吻合的.这一结果提示Si1基因强表达的时期与小鼠生精细胞强凋亡信号出现的时期一致,表明Si1基因与小鼠睾丸生精细胞的凋亡过程有一定联系,当然,这还有待进一步的研究.参考文献:[1]　谭德勇,赖建华,钱伟,等.一个血清抑制基因的克隆[J].生物化学与生物物理进展,2002,29(5):8162819.[2]　杨克,杨举伦,覃扬,等.Si1基因中的一个多态位点的初步分析[J].云南大学学报:自然科学版,2004,26(5):4502453.[3]　俞慧珠,叶百宽.小白鼠胚胎发生[M].北京:科学出112第2期罗　兰等:小鼠睾丸发育过程中Si1基因表达的研究版社,1985.[4]　HSUCHAJ,ELSENHAUERK,CHUNSY.Conadalcella poptosis[J].RecentPro gHormRes,1996,51(1): 433.[5]　张健,高福禄,支会英,等.小鼠生精细胞增殖与凋亡的年龄变化[J].动物学报,2001,47(2):2092214. [6]　凯勒GH,马纳克MM.DNA探针技术[M].孙士勇译.北京:科学出版社,1992.[7]　罗兰,何云刚,舒昆贤,等.血清对胶质瘤细胞株U251基因的表达的影响[J].云南大学学报:自然科学版,2000,22(2):1442147.[8]　RODRIGUEZI,ODYC,ARAKIK,etal.Anearl yandmassivewaveof germinalcella poptosisisre quiredforthedevelo pmentoffunctionals permato genesis[J].EM2 BOJ,1997,16:226222270.[9]　OAKBERGEF.Adescri ptionofs permiogenesisinthemouseanditsuseinanal ysisofthec ycleoftheseminif2 erouse pitheliumand germcellrenewal[J].AmJAnat,1956,99:3912413.Theex pressionoftheSi1geneinthetestisofmiceatdifferentdevelo pmentsta geLUOLan1,2,LIShui2bing1,YUMin1,TANDe2yong1(b.ofBiochemistr yandMolecularBiolo gy,SchoolofLifeScience,YunnanUniversit y,Kunmin g650091,China;2.De partmentofCellBiolo gyandGenetics,Kunmin gMedicalColle ge,Kumin g650031,China)Abstract:Usin ginsituh ybridizationtechni quewithDi gLabeledDNA probe,theex pressionofSi1gene intestisofone2dayold,3weeksoldandmatureKunmin gmicewerestudied.Atthesametime,TUNEL methodwereusedfordetectionofa poptoticcellsinsitutodetectthecella poptosisofthes permato geniccells intestisofmiceat15thda yafterbirth,20thda yafterbirthand25thda yafterbirth.Theresultsareasfol2 lows:(1)Theex pressionofSi1genewasver ystron gin partialseminiferoustubeof3weeksoldmice,butthe expressionofSi21genewasnotbeobservedintestisofone2dayoldmiceandmaturemice.(2)Thenumberof apoptoticcellsincreasedfrom15thda yafterbirthto20thda yafterbirth,reachedits peakson postnatal20th dayanddescendedon25thda yafterbirth.SotheconclusionthatSi1gene partici patesinthedevelo pmentof testisofmice,andthe periodofSi21geneex pressionandthecella poptosisofthes permato geniccellsinmice weres ynchronousl y get.Ke ywords:mouse;testicle;Si1gene;geneex pression;a poptosis 3333333333333333333333333333 (上接第189页)Chemicalconstituentsfrom Hedyotis di f fusaYANGYa2bin,YANGXue2qiong,DINGZhon g2tao(KeyLaborator yofMedicinalChemistr yforNaturalResource,Ministr yofEducation,YunnanUniversit y,Kunmin g650091,China)Abstract:Fromthe Hedyotis dif fusa sevenknowncom poundswereisolated.Theirstructuresweredeter2 minedas32methox y25,72dihydroxyflavonol(Ⅰ),102acetylscandoside(Ⅱ),asperuloside(Ⅲ),5,7,4′2trih y2 droxyflavonol(Ⅳ),ursolicacid(Ⅴ),daucosterol(Ⅵ),β2Stiosterol(Ⅶ).Ke ywords:Hedyotis dif fusa;rubiaceae;flavone;iridoid212云南大学学报(自然科学版) 第29卷。