模式植物拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定

模式植物拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定
摘要：通过本次实验，了解了拟南芥T-DNA插入突变体鉴定的原理，掌握了DNA提取技术、PCR技术以及电泳鉴定技术，对拟南芥的基因型做出判断。

实验首先提取拟南芥的DNA，将获得的DNA进行PCR扩增，将扩增好的DNA加入上样缓冲液后与DNAmarker一起进行电泳，用凝胶成像系统对凝胶进行处理，可以看到大小不同的DNA条带分离。

通过这种方法鉴定出拟南芥是否为突变体。

关键词：T-DNA插入突变体、DNA提取、PCR、电泳鉴定、凝胶成像系统
1.前言
拟南芥作为生物学研究的模式植物，由于其易于种植、生活周期短、遗传背景清晰、易于转基因操作等特点，已被广泛应用于植物学的各种基础和应用研究领域中。

同时，拟南芥T—DNA饱和突变体库的建立和T-DNA侧翼序列的确定，为功能基因组学提供了丰富、有效的遗传材料。

2.实验
2.1实验目的
（1）提取植物基因组DNA的方法；
（2）PCR操作方法；
（3）琼脂糖凝胶分离核酸方法。

2.2实验原理
Ti质粒是土壤农杆菌的天然质粒，该质粒上有一段特殊的DNA区段，当农杆菌侵染植物细胞时，该DNA区段能自发转移进植物细胞，并插入植物染色体DNA中。

所以Ti质粒上的这一段能够转移的DNA被叫做T-DNA。

将Ti质粒进行改造，将感兴趣的基因放进T-DNA区段中没通过农杆菌侵染植物细胞，实现外源基因对植物的遗传转化。

T-DNA插图到植物染色体上的什么位置，是随机的。

如果T-DNA插入进某个功能基因的内部，特别是插入到外显子区，将造成基因功能的丧失。

所以利用农杆菌Ti质粒转化植物细胞，是获得植物突变体的一种重要方法。

用PCR方法鉴定T-DNA插入船和突变体。

农杆菌Ti质粒转化植物细胞后，在获得的后代分离群体汇总，有T-DNA插入的纯合突变体，杂合突变体和野生型。

在突变体研究中，需要的材料是纯合突变体，所以必须从分离群体中将纯合突变体鉴定出来。

“三引物法”的原理如图1所示，即用三种引物（LP、BP、RP）进行PCR扩增，野生型植株目的基因的两条染色体上均为发生T-DNA插入，所以其PCR产物仅有一种，分子量约为900bp（即从LP到RP）；纯合突变体植株目的基因的两条染色体上均发生T-DNA插入，而T-DNA 本身的长度约为17kb，过长的模版会阻抑目的基因特异扩增产物的形成，所以也只能得到1种以LB与LP（或RP）为引物进行扩增的产物，分子量约为410+N bp（即从LP或RP到T-DNA 插入位点的片段），长度为300+N bp,再加上从LB到T-DNA载体左边界的片段，长度为110bp）；杂合突变体植株只在目的基因的一条染色体上发生了T-DNA插入，所以PCR扩增后可同时得到410+N bp和900bp两种产物。

上述3种情况的电泳结果差异明显，能有效区分不同基因型的植株。

此法的有点事可同时鉴定出纯合突变体并确证T-DNA的插入情况。

“双引物法”的基本原理与“三引物法”相似，即采用特异引物扩增目的基因片段和T-DNA插入片段，通过比对扩增结果进行突变体的鉴定。

具体方法图2所示：首先以基因组DNA为模版，用一对特意产物（LP和RP）扩增目的基因片段，初步鉴定出纯合突变体（图
2-a）；然后再以基因组DNA为模版，由T-DNA片段的特异引物（LB）与LP或RP组成一对引物，扩增目的基因T-DNA插入片段，以确证所获得突变体为T-DNA插入目的基因的突变体。

此法的不足之处是完成最终鉴定需要进行两轮PCR扩增。

聚合酶链反应是体外核酸扩增技术。

它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出有点。

PCR能在一个试管内将索要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍，使肉眼能直接观察和判断。

DNA含有PO43-基团，在pH8.0 Buffer中带负电, 在电场中向正极移动。

自由电泳时，由于不同大小的DNA片段的电荷密度大致相同，各核酸分子难以分开选用适当浓度的琼脂糖凝胶作为支持物，使之具备一定的孔径，即可发挥分子筛效应，使大小不同的核酸片段迁移率出现较大差异，达到分离的目的；同样条件对Maker电泳；起到鉴定的作用。

DNA经溴乙锭（EB）染色，溴乙锭可以插入DNA双螺旋结构两个碱基之间，与核酸形成络合物，在紫外（300nm,360nm）激发下，产生桔黄色荧光（590 nm可见光）。

2.3 实验材料
（1）实验材料：拟南芥
（2）实验试剂：2*CTAB提取液、液氮、TE、1*TBE缓冲液、TPS、EB、琼脂糖、Loading Buffer、DL2000 marker、bp100 Ladder marker、Lambda DNA/EcoRI marker、10*Taq buffer（MgCl2free）、MgCl2、引物LP、引物BP、引物RP、dNTP、Taq酶
（3）实验仪器：离心机、PCR仪、电泳槽、凝胶成像系统
2.4 实验步骤
（1）DNA提取
A.CTAB法
①用液氮将100 mg 幼嫩叶片研磨成细粉，置于1.5 ml 离心管中加入预热至65℃的600 μl 的2×CTAB提取液，轻摇混匀；
②65℃水浴30 min，其间轻摇混匀；
③向上清液加入等体积的氯仿/异戊醇（24：1），室温下轻轻混匀10 min，12000 rpm离心
15 min，再转移上清入新管；
④向上清液中2倍无水乙醇或等体积的异丙醇，小心混匀，-20 ℃下30 min ，12000 rpm 离心15 min，弃上清；
⑤用70%乙醇洗涤沉淀一次，12000 rpm稍离心，弃上清；
⑥将沉淀晾干，加20-50 μl TE (pH 8.0)， 65℃水浴30 min溶解DNA。

⑦将水浴后的DNA进行PCR或置于-20℃保存
B.TPS法
①剪取1-2mm2的幼叶，放入0.2ml离心管中；
②加入20ulTPS；
③用200ul枪尖研磨（冰上）；
④在PCR仪上95℃15min.之后立即放入-20 ℃下晾透（约需3.5min)；
⑤加入180ul ddH2O混匀。

（2）PCR扩增
①配成反应体系，用离心机4000r/min离心10s，并用移液枪反复抽打混匀
②将反应体系分装到装有模版DNA的离心管中，用离心机4000r/min离心10s
③将离心后的离心管放入PCR仪，设定程序开始PCR
（3）电泳鉴定
①将50*TAE溶液稀释到1*，为电极缓冲液；
②量筒量出40mlTAE加入到锥形瓶中，并称取0.64g琼脂糖加入锥形瓶，用微波炉反复加热使琼脂糖溶于TAE；
③待混合液稍微冷却后，将其加入到制作琼脂糖凝胶的模版中，50min后，制得琼脂糖凝胶；
④将凝胶放在托板上，一起放入电极槽，1*TAE（电极缓冲液）倒入电极槽，使缓冲液没过凝胶；
⑤将扩增好的DNA加入上样缓冲液后，分别用移液枪进行点样，每个孔点20μl；
⑥用移液枪取适量的marker点样；
⑦用电极槽按5V/cm的电压电泳40-45min；
⑧取电泳后的凝胶放入EB中染色15min；
⑨将染色后的凝胶放入凝胶成像系统进行观察。

3.结果
至今为止，我一共进行了七次实验，其中能看到DNA片段的共有两次，下面将其结果一一呈现：
（1）本次试验用的是TPS法制得的DNA，反应体系是：
25ul体系
H2O 16ul
10xTaq buffer （MgCl2free) 2.5ul
MgCl2 (25mM) 2ul
引物1 (10 uM) 1 ul
引物2 (10 uM) 1 ul
dNTP (各2.5mM) 0.5ul
模板DNA(30-50ng/μl) 2ul
Taq酶(5U/μl ) 0.2ul
这次失败我们怀疑可能是中间需要混匀的几个步骤出现了差错。

（2）本次试验点样较多，其中有CTAB法和TPS法制得的DNA，但仍没有看到片段，体系仍为：25ul体系
H2O 16ul
10xTaq buffer （MgCl2free) 2.5ul
MgCl2 (25mM) 2ul
引物1 (10 uM) 1 ul
引物2 (10 uM) 1 ul
dNTP (各2.5mM) 0.5ul
模板DNA(30-50ng/μl) 2ul
Taq酶(5U/μl ) 0.2ul
（3）本次试验由学长进行操作，酶也是学长实验室的，在2楼实验室完成的整个过程。

结果出来了，不过marker选取得不恰当，并且非特异性条带特别多。

反应体系：
20ul体系
H2O 13ul
10xTaq buffer （MgCl2free) 2ul
MgCl2 (25mM) 2ul
引物1 (10 uM) 0.5 ul
引物2 (10 uM) 0.5 ul
dNTP (各2.5mM) 0.5ul
模板DNA(30-50ng/μl) 1ul
Taq酶(5U/μl ) 0.5ul
（4）本次试验采用的是老师的体系，但是依旧没有结果。

这次点样的时候marker加得也有
问题。

反应体系：
25ul体系
H2O 16ul
10xTaq buffer （MgCl2free) 2.5ul
MgCl2 (25mM) 2ul
引物1 (10 uM) 1 ul
引物2 (10 uM) 1 ul
dNTP (各2.5mM) 0.5ul
模板DNA(30-50ng/μl) 2ul
Taq酶(5U/μl ) 0.2ul
（5）本次试验是采用学长20 ul的体系，在6楼实验室完成的，但是依旧没有出结果，我们怀疑6楼的实验材料的纯度有问题。

反应体系：
20ul体系
H2O 13ul
10xTaq buffer （MgCl2free) 2ul
MgCl2 (25mM) 2ul
引物1 (10 uM) 0.5 ul
引物2 (10 uM) 0.5 ul
dNTP (各2.5mM) 0.5ul
模板DNA(30-50ng/μl) 1ul
Taq酶(5U/μl ) 0.5ul
（6）本次实验采用的是一种新的20ul的配方，原料除三种引物外都是2楼实验室的，在2楼实验室完成的。

出现的结果相对较好，能够辨认出拟南芥的基因型了。

反应体系：
20ul体系
H2O 16ul
10xTaq buffer （MgCl2free) 2ul
MgCl2 (25mM) 2ul
引物1 (10 uM) 0.5 ul
引物2 (10 uM) 0.5 ul
dNTP (各2.5mM) 0 .5ul
模板DNA(30-50ng/μl) 1.5ul
Taq酶(5U/μl ) 1ul
（7）本次试验所使用的是和第六次相同的体系，几个不同点是：原料不同、时间不同、PCR 仪不同，但是这次还是没出结果，我又一次怀疑6楼的实验试剂有问题。

4.讨论
（1）CTAB法提取DNA，在加入液氮后研磨的时候要快，液氮若快升华完了，则立即补充，不要在无液氮的时候研磨；
（2）提取DNA，混匀时不可用力过猛；
（3）将DNA加入到反应体系时，最好将同种的反应体系一同配好，然后再分装到不同的管里，这样可以减少误差，在配置总反应体系时，加入的量应该比实际的分数多1-2份，避免在移液过程中损失；
（4）配成后可以用移液枪连续抽打混匀；
（5）在移液过程中，若有微量液体附着于管壁上，可用离心机离心；
（6）移不同成分液体的时候注意更换枪头；
（7）在进行PCR时，可先观察其运行一个循环，看是否有异常情况发生；
（8）用琼脂糖溶液制作凝胶时，要趁热将溶液倒入模版中，当倾倒的最后，液流变得很细小时停止倾倒，避免凝胶表面不平；
（9）移动凝胶时要小心操作，不可使其受到损伤；
（10）电泳前要对PCR过的DNA加入Loading Buffer，Loading Buffer有两个作用：
①增加DNA的比重，使它的比重大于电极缓冲液，凝胶上的小孔里；
②着色，电泳的时候可根据有色条带判断电泳进行的程度；
（11）将凝胶加入电极槽中，用电极缓冲液浸没后方可加入DNA与Loading Buffer的混合液，若最后再加入电极缓冲液，会使一部分DNA流失；
（12）点样时注意不要让枪头戳破凝胶；
（13）若两块凝胶放在同一个电极槽中同时电泳，若点样间隔时间比较长，为避免DNA扩散，可将先点样好的凝胶进行轻微地电泳，当DNA条带从小孔中跑进凝胶时，DNA就不会扩散了，可以继续另一块的点样；
（14）电泳时要让跑得快的DNA条带跑到凝胶的2/3处，可根据电泳进行的程度控制时间；（15）制作凝胶时要让琼脂糖溶液在模版中完全冷却，不可操之过急；
（16）EB是强致癌物质，进行EB染色时，带上手套，注意脱去手套时不要让EB沾到手上；（17）用凝胶成像系统对凝胶进行拍照时，可以先在紫外灯下看一下DNA条带，由于相机的设置参数不同，可能会造成误差。

参考文献
[1]杨大翔著.《遗传学实验》[M].北京：高等教育出版社，2010
[2]t-DNA插入突变体鉴定原理[PPT]
[3]t-DNA鉴定---DNA提取部分[PPT]
[4]t-DNA鉴定---PCR [PPT]
[5]t-DNA鉴定---电泳部分[PPT]
[6]徐平丽,赵晋平,孟静静,李保龙,李新国,郭峰.一种适宜拟南芥PCR检测的DNA提取方法[J].安徽农业科
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