人类未成熟卵子冷冻保存后体外成熟形成的纺锤体的形态研究

2.4 固定及免疫荧光染色、激光共聚焦显微镜对纺锤体的观察：
卵移入 2%甲醛中，置于 37℃培养箱中固定 10 分钟，5%HAS 的 PBS 洗卵三次。0.1% 的 Triton X-100 透化 45 分钟后将卵移入预热到 37℃的 1：250 的一抗（抗-α-微管单克隆抗 体，Sigma T9026），37℃培养箱中孵化一小时；1：5000 的二抗（生物素结合的抗鼠 IgG 抗 体，Sigma B7264）37℃培养箱中孵化一小时；1：50 的三抗（FITC 结合的特异性抗生物素 蛋白，Sigma E2761）37℃培养箱中避光孵化 30 分钟。每次抗体孵化后均用 5%HAS 的 PBS 洗卵三次。10μg/ml PI（碘化溴乙锭 Sigma P4170）37℃培养箱中避光孵化 10 分钟进行反染。 最后将卵置于 5%HAS 的 PBS 中孵化 30 分钟后将卵子固定于玻片上加 10μl 荧光保护剂于标 本区，盖上盖玻片。最后用激光扫描共聚焦显微镜观察、拍照。结果输入计算机中保存以供 分析。
2.1.2.卵子分型：对于穿刺获得的卵子，去除粘液团和颗粒细胞后在体视镜或倒置镜下 观察，根据成熟程度的不同分为生发小泡期，即 GV 期，第一次减数分裂中期（metaphase I， MI）即 MI 期。GV 期卵子即减数第一次分裂的双线期的初级卵母细胞，内含 46 条染色体， 遗传物质已经复制，女性的生殖细胞多停留在此期，镜下见卵母细胞中含有一个生发泡，折 光与周围胞浆不同。在促性腺激素的刺激下，停滞的减数分裂开始启动，GV 期卵子的生发 小泡移向细胞边缘，发生生发小泡的破裂（germinal versicle breakdown，GVBD），向 MI 期 转化，意味着成熟分裂的开始，MI 期卵胞浆均匀，无生发小泡，无极体。
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常规的冷冻成熟卵子方案是否可以保存冷冻未成熟卵子较好的发育潜能。
2. 材料和方法
2.1 卵子来源及分组
2.1.1 卵子来源：主要收集常规胞浆内单精子显微注射-胚胎移植（intracytoplasmic sperm injection- embryo transfer, ICSI-ET）周期中不成熟的卵子。在我们的未成熟卵的体外成熟培 养的研究中，发现在行促性腺激素超促排卵以后，直径小于 1cm 的卵泡中获得的卵子大多 数为未成熟卵。自 2005 年 5 月开始，收集进行 ICSI 之前卵母细胞-卵冠丘复合物（oocyte corona cumulus complex,OCCC）经消化后发现的发育未成熟的卵子。患者不孕原因有输卵管 因素，排卵异常和男性因素等，均接受常规的促性腺激素控制性超促排卵方案。根据患者的 年龄、内分泌状况等条件分别给予长方案或短方案治疗，长方案是在刺激周期的月经来潮前 7 天，给予促性腺激素释放激素激动剂（GnRH-α）对垂体进行降调节，抑制自身的 LH 峰， 一直用到注射 hCG 日，在月经的第 2 天或第 3 天开始给予促性腺激素（FSH 和 hMG）刺激 卵泡生长；短方案是在月经的第 2 天同时给予 GnRH-α 和促性腺激素，一直到注射 hCG 日， 利用的是 GnRH-α 对垂体的先刺激和后抑制的作用原理。取卵是在注射 hCG 后 32-36 小时 进行。
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后迅速投入液氮罐中（-196℃），在液氮中储存。 2.2.4.卵子融解液的配制：S4a：1.0M PROH+0.3M sucrose+ 5mg/mLHSA 的 DPBS；S4b：
0.5M PROH+0.3M sucrose+ 5mg/mLHSA 的 DPBS；S4：0.3M sucrose+ 5mg/mLHSA 的 DPBS 2.2.5.卵子融解方法：本实验所用的卵子冷冻保存的时间为 2-4 个月不等。融解卵子采
1.正常减数分裂的纺锤体形态类似圆桶状,形状对称，两侧为无中心体的极点，并轻微向 两极突出，指向质膜的一端较指向胞浆中心的一端略小，正常纺锤体结构一般位于接近极体 的外围区且方向垂直于细胞膜。正常染色体规整的排列在赤道板上，与两侧对称分布的纺锤 体相连。
2.轻微异常的纺锤体构型：两侧无突出的极点，呈圆形，纺锤体长轴长度缩短，轻微异 常染色体可表现为个别或少数染色体远离赤道板，染色体过度松散或过度凝集。

人类未成熟卵子冷冻保存后体外成熟形成的纺锤体 的形态研究1
高姗姗，李媛，陈子江，李梅，胡京美，马水英
山东大学山东省立医院生殖医学中心（250021）
E-mail：shanshan4913@
摘 要：目前冷冻未成熟卵子成为研究焦点，但未成熟卵子冷冻融解后经体外成熟后是否可 以获得正常形态的纺锤体和染色体构型却未得到肯定的结论。方法：收集常规胞浆内单精子 显微注射-胚胎移植（intracytoplasmic sperm injection- embryo transfer, ICSI-ET）术中不成熟 的卵子并根据形态分为GV期卵子、MⅠ期卵子，获得的卵子随机分为两组，GV1组即GV期 卵子体外培养36小时后成熟至MⅡ期卵子者固定并进行纺锤体和染色体的免疫荧光染色。 GV2组经慢速冷冻-快速融解后培养36小时成熟至MⅡ期卵子者固定并进行纺锤体和染色体 的免疫荧光染色。MⅠ期卵子分组同GV。结果：68个GV卵子冷冻融解后成活55个，存活率 80.88%，38个卵子成熟至MⅡ期，成熟率为69.09%。对照组GV卵子35个，26个卵子成熟至 MⅡ期，成熟率74.29%。40个MⅠ期卵子冷冻融解后35个存活，存活率87.5%，24个成熟至 MⅡ期，成熟率为68.57%。对照组MⅠ卵子25个，22个卵子成熟至MⅡ期，成熟率88%。GV1 和GV2组之间体外成熟率无统计学差异（卡方检验，P>0.05）；GV1和GV2组之间纺锤体形 态和染色体形态正常率的比较有统计学差异（卡方检验，P<0.05）。同样MⅠ1和MⅠ2组之 间体外成熟率无统计学差异（卡方检验，P>0.05）；MⅠ1和MⅠ2组之间纺锤体形态和染色 体形态正常率的比较有统计学差异（卡方检验，P<0.05）。结论：卵子冷冻由于未成熟卵子 没有纺锤体结构并且其膜结构具有不同的通透性等特点，所以被认为会较少受到冷冻的损 害，但是冷冻后未成熟卵子必须要经过体外成熟这一关键过程，很大程度上降低了其优势。 冷冻后未成熟卵母细胞形成正常减数分裂纺锤体的能力减弱，从而染色体的分布亦多异常。 因此，应用常规慢冻-速融方案并不能很好的保存未成熟卵子的体外成熟后的纺锤体形成能 力。 关键词：卵母细胞，冷冻，纺锤体，染色体
1. 研究背景
生殖能力的保存一直以来都是生殖领域的一个难题。继精子冷冻后，胚胎冷冻技术的成熟从 一定意义上保存了生育能力。但胚胎冷冻面临着许多自身无法解决的难题。如患者无法接受 冷冻胚胎，或多余的冷冻胚胎的去向等伦理和法律问题。而卵子冷冻则可以避免这一情况。 而且卵子冷冻能为各种原因造成的卵巢功能衰竭的妇女提供一条储备生育能力的途径，或者 在取卵当日无法得到可用精子的情况下冷冻卵子，且卵子冷冻可使供卵库成为可能。 目前成熟卵子冷冻技术却因为受精障碍和胚胎发育障碍难以广泛应用临床。一方面，在成熟 卵子冷冻存在着皮质颗粒提前释放和微管微丝结构的损伤问题；另一方获取未成熟卵避免了 超促排卵带来的一系列医源性并发症和费用等的问题，如促性腺激素的大量应用，卵巢过度 刺激综合症，连续监测卵泡以及相关的较高的费用。于是，冷冻未成熟卵子成为另一焦点， 未成熟卵子中没有纺锤体形成，GV期染色体仍然被包裹于核膜内。而且未成熟卵子细胞膜 通透性亦与成熟卵子不同，理论上较能耐受冷冻的损伤，但是冷冻后的未成熟卵子必须要经 过体外成熟这一关键过程，很大程度上降低了其优势。
（irvine）中进行消化去除颗粒细胞，选择已排出第一极体的MⅡ期卵子进行冷冻。
2.2.2 卵子冷冻液的配制：配制冷冻液需要的试剂：人血白蛋白（HSA，Sigma），磷酸 盐缓冲液（DPBS，Sigma），1，2-丙二醇（PROH，Sigma），蔗糖（sucrose，Sigma）。
冷冻液为：S1：5mg/mL HSA 的 DPBS；S2：1.5M PROH+ 5mg/mLHSA 的 DPBS；S3： 1.5M PROH+0.3M sucrose + 5mg/mLHSA 的 DPBS。
2.2.3.卵子冷冻的方法：本研究采用 Planer 程序冷冻仪进行慢冷冻法降温，即室温下
（20℃），经 S1 洗涤 2 遍，S2 中平衡 10 分钟，最后在 S3 中停留 15 分钟，装入冷冻麦管， 从 20℃开始以-2℃/min 降至-7℃，平衡 5 分钟，然后人工植冰（seeding），再等待 10 分钟 （holding），之后以-0.3℃/min 的速度降温至-30℃，继续以-30℃/min 的速度降至-120℃，然
用快速复温法，即将胚胎从液氮罐中取出后，置室温下 40 秒，30℃水浴 40 秒，再入室温下 的融解液 S4a 中，然后 S4b，S4，S1 依次换液，分别停留 5 分钟，当卵子进入 S1 中后即将 温度升至 37℃，此时可以在倒置镜下观察评价卵子存活情况。将成活卵子置入 HTF 中，在 37℃，5% CO2 培养箱内。
2.1.3.卵子分组：获得的卵子随机分为两组，GV1组即GV期卵子体外培养36小时后成熟 至MⅡ期卵子者固定并进行纺锤体和染色体的免疫荧光染色。GV2组经慢速冷冻-快速融解 后培养36小时成熟至MⅡ期卵子者固定并进行纺锤体和染色体的免疫荧光染色。MⅠ期卵子 分组同GV。
2.2.卵子冷冻复苏方法：
2.2.1卵子的消化：穿刺取出的卵置于放有MHTF培养液的35 mm培养皿中，在37%， 5%CO2的培养箱中饱和湿度培养1—2小时后在含有透明质酸酶（Sigma）80IU/ml的MHTF
3.异常的纺锤体构型：纺锤体部分和全部的瓦解或缺失。异常染色体表现为无序杂乱的 分布于纺锤丝之间，无赤道板的形成。
如下表所示，68 个 GV 卵子冷冻融解后成活 55 个，存活率 80.88%，38 个卵子体外培
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养成熟至 MⅡ期，成熟率为 69.09%，纺锤体和染色体正常率分别为 21.05%和 23.68%。对 照组 GV 卵子 35 个，26 个卵子体外成熟至 MⅡ期，成熟率 74.29%，纺锤体和染色体正常 率分别为 53.58%和 50%。40 个 MⅠ期卵子冷冻融解后 35 个存活，存活率 87.5%，24 个体 外成熟至 MⅡ期，成熟率为 68.57%，纺锤体和染色体正常率分别为 20.83%和 23.68%。对 照组 MⅠ卵子 25 个，22 个卵子成熟至 MⅡ期，成熟率 88%，纺锤体和染色体正常率分别 为 54.55%和 63.64%。GV1 和 GV2 组之间体外成熟率无显著性差异；两组纺锤体形态和染 色体形态正常率的比较有统计学差异，同样，MⅠ1 和 MⅠ2 组之间体外成熟率无显著性差 异；而两组间纺锤体形态和染色体形态正常率的比较也有统计学差异。而 GV1 和 MⅠ1 组 及 GV2 和 MⅠ2 组之间纺锤体形态和染色体形态正常率的比较分别无统计学差异。