细胞培养方法与步骤
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新生小鼠心肌细胞分离培养的改 良及其鉴定
目录
• • • • • • • 一、实验目的 二、细胞来源 三、实验方法 1.细胞培养 2.实验操作 3.检测方法 四、预期实验结果
实验目的
• 通过改进新生小鼠心肌分离及其原代培养方法提高心肌细 胞的活性和纯度构建新生小鼠心肌细胞分离及原代培养实 验平台 • 体外培养的原代心肌细胞具有自发节律性和收缩性特征， 能够保持其在体内原有的许多结构和功能，同时排除了神 经体液等因素的干扰，可以从细胞分子水平阐明一些心脏 发育及疾病发生的基本理论，在心肌细胞生长发育生理代 谢病理等研究中具有重要作用.
实验方法—细胞培养
二.细胞培养 • 1.心肌细胞分离
取0~3 d的SD小鼠10只，酒精擦洗消毒，用剪刀从最下端肋骨处开始 剪开胸腔，找到心脏后，剪取心尖心室部分3，立即放入预冷的ADS 缓冲液（116 mmol / L NaCl，20 mmol / L HEPES，0.012% NaH2PO4 2H2O，0.1% Glucose，0.04%KCl，0.01% MgSO4 7H2O）中漂洗3次，然后将心室组织拿到超净工作台中，剪成0. 5 -1 mm3大小的组织块，再用4 预冷的ADS缓冲液漂洗2次以去除血细胞 及漂浮的结缔组织，加入用ADS缓冲液配制的消化酶8 mL（0.05Ⅱ型 胶原蛋白酶和0.06%胰蛋白酶），然后将消化酶和组织的混合液吸入 到50 mL的离心管中，置于37 恒温水浴摇床中，37 恒温振荡10 min. 重新加入8 mL消化酶，恒温振荡8 min，小心吸取上清到一个加有 400 L胎牛血清的15 mL离心管中，混匀，1 000 r / min离心5 min，去 掉上清，可看到离心管底部有淡黄色的细胞沉淀，加入37 预热的培 养基3 mL（72% DMEM，18%M199，10%胎牛血清），吸打混匀， 然后放到CO2培养箱（5% CO2，37 ）中培养，培养过程中注意离心 管盖子不能拧的太紧，几分钟后要拿出来颠倒混匀几次. 重复消化4~5 次，直到组织全部消化完。
Thank you !!
• 小组成员 一大班一小班 蔡腾飞 20143023 邵茜 20143013
细胞来源
出生0~3 d的清洁级SD新生小鼠，雌来自百度文库不限。
实验方法
一.主要材料与试剂
1.出生0~3 d的清洁级SD新生小鼠
2.胰酶（美国Sigma公司）；Ⅱ型胶原酶（美国Sigma公 司）；5溴脱氧尿嘧啶核苷（Brdu)（美国Sigma公司）； 肌球蛋白重链蛋白（MF20）单克隆抗体（武汉博士德公 司）； 羊抗鼠Cy3标记二抗 （Santa公司）；Hoechest （美国Sigma公司）；CO2 恒温箱 （美国Thermo公司）； 倒置显微镜XDS1B（广州粤显光学仪器有限公司）； NikonE440荧光显微镜（日本尼康）.
实验方法—测定方法
• 取相同量的0.4%苔芬蓝液与细胞悬液混匀，静置310 min， 然后取适量混合液滴于细胞计数板上，计数总细胞数及未 染成蓝色的活细胞数.计数10次，取平均值. 细胞存活率 （%）=活细胞数/细胞总数（活细胞数+死细胞数） *100%
预期实验结果
1. 台盼蓝染色，死细胞被染成蓝色，用细胞计数板计数，统 计3次试验各4个视野的细胞数，细胞存活率大于95%. 2. 通过在显微镜下比较传统胰蛋白酶法和改进的胰蛋白酶+ 胶原蛋白酶法所分离得到的心肌细胞，用改进的方法所得 到的心肌细胞要明显多于传统的方法。
实验方法—细胞培养
• 2.心肌细胞纯化及原代培养
待组织消化完以后，将收集到的细胞全部吸到一个细胞培 养皿中，然后差速贴壁，即将细胞放到培养箱中让其贴壁 30 min，因为心肌成纤维细胞比心肌细胞贴壁快，所以可 将心肌成纤维细胞与心肌细胞分离，然后将培养液吸到一 个15 mL离心管中1 000 r / min离心6 min，同时加入5 mL 新鲜培养基到培养皿中继续培养心肌成纤维细胞，将离心 后得到的上清吸到另一15 mL离心管中，1 000 r / min再 次离心5 min，将得到的所有细胞沉淀用培养基（含0.1 mmol BrdU）4吸打混匀20 50次，吸到培养皿中，放入 CO2恒温箱中培养.
实验方法—实验操作
三.实验操作
.
1.培养48 h后，在倒置显微镜下观察心肌细胞，分析用不同的分离培养 方法所得到的心肌细胞的质量，并拍照。
2. 将心肌细胞和心肌成纤维细胞接种到盖玻片上面，取培养 48 h的心肌细胞以及在差速贴壁中获得的心肌成纤维细胞 作为阴性对照，吸去培养基，用PBS洗两次，用4%多聚 甲醛固定30min，用PBS洗一次，用封闭液（1%的胎牛血 清，5%的小牛血清 ，10%的 山 羊 血 清 ，0.05%的 Triton X100） 室温封闭1 h，用PBS洗一次，取100 L肌 球蛋白重链蛋白（MF20）单克隆抗体（1 100） 滴到接 种有心肌细胞的盖玻片上，同时在接种有心肌成纤维细胞 的盖玻片上滴100 LPBS，室温孵育1.5 h，用PBS洗3次， 1 500羊抗鼠Cy3标记二抗室温避光孵育1 h，用PBS洗3次， 最后用1 1 000hoechest染核，室温避光孵育15 min， PBS洗一次，在荧光显微镜下观察细胞，并拍照。
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• • • • • • • 一、实验目的 二、细胞来源 三、实验方法 1.细胞培养 2.实验操作 3.检测方法 四、预期实验结果
实验目的
• 通过改进新生小鼠心肌分离及其原代培养方法提高心肌细 胞的活性和纯度构建新生小鼠心肌细胞分离及原代培养实 验平台 • 体外培养的原代心肌细胞具有自发节律性和收缩性特征， 能够保持其在体内原有的许多结构和功能，同时排除了神 经体液等因素的干扰，可以从细胞分子水平阐明一些心脏 发育及疾病发生的基本理论，在心肌细胞生长发育生理代 谢病理等研究中具有重要作用.
实验方法—细胞培养
二.细胞培养 • 1.心肌细胞分离
取0~3 d的SD小鼠10只，酒精擦洗消毒，用剪刀从最下端肋骨处开始 剪开胸腔，找到心脏后，剪取心尖心室部分3，立即放入预冷的ADS 缓冲液（116 mmol / L NaCl，20 mmol / L HEPES，0.012% NaH2PO4 2H2O，0.1% Glucose，0.04%KCl，0.01% MgSO4 7H2O）中漂洗3次，然后将心室组织拿到超净工作台中，剪成0. 5 -1 mm3大小的组织块，再用4 预冷的ADS缓冲液漂洗2次以去除血细胞 及漂浮的结缔组织，加入用ADS缓冲液配制的消化酶8 mL（0.05Ⅱ型 胶原蛋白酶和0.06%胰蛋白酶），然后将消化酶和组织的混合液吸入 到50 mL的离心管中，置于37 恒温水浴摇床中，37 恒温振荡10 min. 重新加入8 mL消化酶，恒温振荡8 min，小心吸取上清到一个加有 400 L胎牛血清的15 mL离心管中，混匀，1 000 r / min离心5 min，去 掉上清，可看到离心管底部有淡黄色的细胞沉淀，加入37 预热的培 养基3 mL（72% DMEM，18%M199，10%胎牛血清），吸打混匀， 然后放到CO2培养箱（5% CO2，37 ）中培养，培养过程中注意离心 管盖子不能拧的太紧，几分钟后要拿出来颠倒混匀几次. 重复消化4~5 次，直到组织全部消化完。
Thank you !!
• 小组成员 一大班一小班 蔡腾飞 20143023 邵茜 20143013
细胞来源
出生0~3 d的清洁级SD新生小鼠，雌来自百度文库不限。
实验方法
一.主要材料与试剂
1.出生0~3 d的清洁级SD新生小鼠
2.胰酶（美国Sigma公司）；Ⅱ型胶原酶（美国Sigma公 司）；5溴脱氧尿嘧啶核苷（Brdu)（美国Sigma公司）； 肌球蛋白重链蛋白（MF20）单克隆抗体（武汉博士德公 司）； 羊抗鼠Cy3标记二抗 （Santa公司）；Hoechest （美国Sigma公司）；CO2 恒温箱 （美国Thermo公司）； 倒置显微镜XDS1B（广州粤显光学仪器有限公司）； NikonE440荧光显微镜（日本尼康）.
实验方法—测定方法
• 取相同量的0.4%苔芬蓝液与细胞悬液混匀，静置310 min， 然后取适量混合液滴于细胞计数板上，计数总细胞数及未 染成蓝色的活细胞数.计数10次，取平均值. 细胞存活率 （%）=活细胞数/细胞总数（活细胞数+死细胞数） *100%
预期实验结果
1. 台盼蓝染色，死细胞被染成蓝色，用细胞计数板计数，统 计3次试验各4个视野的细胞数，细胞存活率大于95%. 2. 通过在显微镜下比较传统胰蛋白酶法和改进的胰蛋白酶+ 胶原蛋白酶法所分离得到的心肌细胞，用改进的方法所得 到的心肌细胞要明显多于传统的方法。
实验方法—细胞培养
• 2.心肌细胞纯化及原代培养
待组织消化完以后，将收集到的细胞全部吸到一个细胞培 养皿中，然后差速贴壁，即将细胞放到培养箱中让其贴壁 30 min，因为心肌成纤维细胞比心肌细胞贴壁快，所以可 将心肌成纤维细胞与心肌细胞分离，然后将培养液吸到一 个15 mL离心管中1 000 r / min离心6 min，同时加入5 mL 新鲜培养基到培养皿中继续培养心肌成纤维细胞，将离心 后得到的上清吸到另一15 mL离心管中，1 000 r / min再 次离心5 min，将得到的所有细胞沉淀用培养基（含0.1 mmol BrdU）4吸打混匀20 50次，吸到培养皿中，放入 CO2恒温箱中培养.
实验方法—实验操作
三.实验操作
.
1.培养48 h后，在倒置显微镜下观察心肌细胞，分析用不同的分离培养 方法所得到的心肌细胞的质量，并拍照。
2. 将心肌细胞和心肌成纤维细胞接种到盖玻片上面，取培养 48 h的心肌细胞以及在差速贴壁中获得的心肌成纤维细胞 作为阴性对照，吸去培养基，用PBS洗两次，用4%多聚 甲醛固定30min，用PBS洗一次，用封闭液（1%的胎牛血 清，5%的小牛血清 ，10%的 山 羊 血 清 ，0.05%的 Triton X100） 室温封闭1 h，用PBS洗一次，取100 L肌 球蛋白重链蛋白（MF20）单克隆抗体（1 100） 滴到接 种有心肌细胞的盖玻片上，同时在接种有心肌成纤维细胞 的盖玻片上滴100 LPBS，室温孵育1.5 h，用PBS洗3次， 1 500羊抗鼠Cy3标记二抗室温避光孵育1 h，用PBS洗3次， 最后用1 1 000hoechest染核，室温避光孵育15 min， PBS洗一次，在荧光显微镜下观察细胞，并拍照。