《基因克隆载体》PPT课件 (2)

3）绝大多数质粒是DNA型的； 酵母的杀伤质粒(killer plasmid)是RNA。
4）绝大多数的天然DNA质粒具 有共价、闭合、环状的双链结构 (covalently closed circular DNA, cccDNA)，以超螺旋形式存在。
5）分子大小：1-300 kb；
6）编码基因： 编码2-3个中等大小的蛋白质，如抗生素
第二章 基因工程的基本条件
一、用于核酸操作的工具酶 二、基因克隆载体 三、目的基因的制备 四、基因工程受体功能及特征 （二）质粒 （三）噬菌体或病毒DNA （四）Cos质粒与噬菌粒 （五）人工染色体载体
（一）载体的功能及特征
载体(vector)：
在基因工程操作中，能携带外源DNA 进入受体细胞的DNA分子。
同一质粒尽管分子量相同，不同的构型电 泳迁移率不同： cccDNA最快、L-DNA次之、 ocDNA最慢。
ocDNA
L-DNA cccDNA
质粒的分类
1、按功能： F质粒(fertility factor) R质粒(resistance factor) Col质粒(coliconogenic factor)
载体的功能： 运送外源基因高效转入受体细胞； 为外源基因提供复制能力或整合能力； 为外源基因的扩增或表达提供必要的条件。
载体应具备的条件：
具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性(可转移性)； 具有与受体细胞相适应的复制位点或整合位点； 具有较高的外源DNA载装能力； 具有多种单一的限制酶酶切位点； 具有合适的筛选标记。
（二）质粒(plasmid)
基本概念： 1）是生物细胞内固有的、 能独立于染色体而自主复 制、并被稳定遗传的核酸 分子。 2）存在于细菌、真菌、蓝 藻、酵母等细胞中。
plasmid DNA
Genomic DNA
The genomic DNA of E.coli: a single circular double-stranded DNA, with the contour length about 850 times longer than the cell
不相容性的质粒组成不相容性群，如：
ColE1、pMB1有相似复制子结构，彼此不相容； pSC101、F、RP4有相似复制子结构，彼此不相容； p15A及其衍生质粒有相似复制子结构，彼此不相容。
3、可转移性 革兰氏阴性菌的质粒可分成两大类：
接合型质粒(conjunctive plasmid) 非接合型质粒(nonconjunctive plasmid)
2、按转移方式：
接合型质粒 非接合型质粒
3、按复制机理： 严紧型质粒： 接合型质粒分子量大，一般属严紧型。
符合基因工程的安全要求。
值得注意的是，某些非接合型质粒 （ 如 ColE1） 在 接 合 型 质 粒 的 存 在 和 协 助下，也能发生DNA转移，这个过程由 bom和mob基因决定。
4、携带特殊的遗传标记
野生型质粒DNA上往往携带一个或多个遗传标 记基因，使寄主产生正常生长非必需的附加性状。 物质抗性：抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物 物质合成：抗生素、细菌毒素、有机碱
抗性、代谢特征等，赋予细菌一些额外的特 性（非必须）。
7）最大装载量：15 kb（5%）。
质粒与宿主细胞的关系：
质粒对宿主的生存不是必需的，只是“友好” 的“借居”宿主细胞中。
质粒离开宿主就无法生存，只有依赖宿主细胞 的帮助，才能完成自身的复制、转录。
质粒不是单纯的寄生，携带的遗传信息赋予细菌 特定的遗传性状，如抗生素抗性基因Ampr。
2、不相容性(incompatibility)
指任何两种含相似复制子结构的不同 质粒，不能同时存在于一个细胞中。
分子机制：
两种含不同复制子结构的不同质粒，在复 制时受各自的拷贝数控制系统调节，致使两种 质粒的最终拷贝数恒定，经若干复制周期和细 胞分裂周期后，仍能共处于同一细胞内。
两种含相似复制子结构的不同质粒，在 复制时受同一拷贝数控制系统的干扰，致使 两种质粒的最终拷贝数不同，其中拷贝数多 的质粒在以后的细胞分裂周期中更具优势。
伴随染色体DNA复制而复制。 如：pSC101、p15A。
2）松弛型质粒(relaxed plasmid)：
10-200拷贝/cell，复制不受细胞核控制， 染色体DNA复制停止时，仍可进行复制。
加入氯霉素（终浓度10-170g/ml）抑制 细菌蛋白质合成后，可达3000拷贝/cell 。
如：pMB1、ColE1。
质粒的基本特征： 自主复制性 不相容性 可转移性 携带特殊的遗传标记
1、自主复制性
质粒能利用寄主细胞的DNA复制系统， 进行自主复制。
质粒DNA上的复制子结构决定了质粒与 寄主的对应关系。
根据在每个细胞中的分子数（拷贝数） 多寡，质粒可分为：
严紧型质粒 松弛型质粒
1）严紧型质粒(stringent plasmid)： 1-3拷贝/cell，复制受细胞核控制，
这些标记基因对重组DNA筛选有重要意义。
质粒的空间构型：
共价、闭合、环状DNA(cccDNA) 超螺旋(super coil DNA, scDNA)
开环DNA(open circular DNA, ocDNA) 一条链上有一至数个缺口
线形DNA(linear DNA, L-DNA)
质粒空间构型与电泳速率：
1）F质粒：
性质粒，决定细菌性别，能在天然条件下 自发地从一个细胞转移到另一个细胞。
R质粒： 抗药性质粒，带有一种或多种抗生素抗性
基因，使寄主获得同样的抗生素抗性性状。
RTF: resistance trarnsfer factor
Col质粒： 大肠杆菌素质粒，带有控制大肠杆菌素
合成的基因，合成大肠杆菌素，杀死不含 Col质粒的亲缘细菌。
1）接合型质粒：
除带有自我复制所必需的遗传信息外，还带 有一套控制细菌配对和质粒接合转移的基因。
能在天然条件下自发地从一个细胞转移到另 一个细胞，如F质粒。
2）非接合型质粒：
虽带有自我复制所必需的遗传信息，但失 去了控制细菌配对和质粒接合转移的基因。
不能在天然条件下独立地发生接合作用， 如ColE1质粒。