感受态细胞的制备方法

感受态细胞的制备方法

1、感受态定义、作用、常用制备方法及原理

2、感受态细胞不好用的原因

3、影响转化效率的原因

4、为何要低温环境制备

1.感受态

定义：细胞能够从周围环境中摄取DNA分子，并且不易被细胞内的限制性核酸内切酶分解时所处的一种特殊生理状态称感受态（competence）。

作用：如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA。感受态的目的是增加细胞的通透性，以便外源基因进入宿主细胞，实现转化的目的。优点是细胞膜通透性增大，方便大分子的进入。意义是实验转移外源DNA分子进入受体细胞，完成实验。

常用制备方法：细菌感受态少量制备法（CaCl2法）、细菌感受态大量制备法、细菌电转化法等详见《基因工程实验指导》p153-157.

2.感受态细胞做得不好的原因

一．菌液OD值偏大或偏小

二．原始菌株不好

三．试剂超纯程度不够

四．操作时对菌体伤害过大

3. 影响转化效率的原因

1．细菌的生长状态：实验中应密切注视细菌的生长状态和密度,尽量使用对数生长期的细胞（一般通过检测OD600来控制.DH5α菌株OD600为0.5 时细胞密度是5 ×107/ml ）；2．所有操作均应在无菌条件和冰上进行；

3．经CaCl2处理的细胞,在低温条件下,一定的时间内转化率随时间的推移而增加, 24小时达到最高,之后转化率再下降（这是由于总的活菌数随时间延长而减少造成的）；

4．化合物及无机离子的影响：在Ca2+的基础上联合其他二价金属离子（如Mn2+或Co2+）、DMSO 或还原剂等物质处理细菌,可使转化效率大大提高（100-1000 倍）；

5．所使用的器皿必须干净.迹量的去污剂或其它化学物质的存在可能大大降低细菌的转化效率；

6．质粒的大小及构型的影响：用于转化的应主要是超螺旋的DNA ；

7．一定范围内,转化效率与外源DNA 的浓度呈正比；

4．为何要低温环境制备

在制备过程中,细胞膜通透性增大而变得脆弱,低温能提高感受态细胞存活率.所以在制备感受态细胞时要保持低温和不能剧烈震荡.

如果放于-20℃保存，时间长了细胞内部液化度较高的情况下，细胞会由于流动性的原因造成不可逆损伤，甚至死亡。所以要放于-80摄氏度。

原理：利用化学法CaCl2处理对数生长期的DH5α大肠杆菌或TG1大肠杆菌（-为何选择这两种菌、两种菌的不同处、生长曲线的不同处），使其对外源DNA通透性增加，从而达到外源DNA分子进入细菌的目的。

BL21一般用于外源基因的原核表达，DH5a，TG1和HB2151一般用于重组质粒的克隆和扩增。TG1长得慢，菌落较小，转化效率高，用于普通的克隆测序，BL21(DE3)长的快，菌落较大，转化效率低点，主要用于原核表达。

DH5α是扩增菌，BL21是表达菌

DH5α可以使质粒高拷贝数扩增，BL21利于蛋白的表达，另外表达菌还有很多，ps系列，roset 系列等

DH5α大肠杆菌：此种大肠杆菌，是一种诱变菌株，主要表现对外源DNA的免疫缺乏。是用于基因工程的菌种，相比于正常菌种缺少了一定的免疫机制。

试剂：

（1）DH5αE.coli菌株——E.coli K-12衍生菌

（2）80mM（mmol/L）CaCl2（灭菌）（0.44g→50mL，摇匀；0.88g CaCl2→100mL H2O）（3）液体LB培养基（实验室直接购买现成的，不需要配制）（-浓度是如何确定的这个查查看我没查过看看浓度是否有影响）

取250mL三角瓶×2，洗净

2.5g→100mLddH2O

并摇匀使其溶解后，按1:1000比例加入100μL 1mol/L（1M）NaOH调节至PH7.0 （4）甘油（100%甘油，10mL或20mL）15mL/管×2

高温灭菌121℃，20min

对于E.coli菌株用8种不同浓度的CaCl2制备感受态细胞,然后转化各浓度的感受态细胞。实验结果表明,不同浓度CaCl2溶液处理所得到的感受态细胞,其转化效率有很大的不同。随着CaCl2浓度增高,转化效率也随之提高,在80mmol/L～100mmol/L时达到峰值,进一步提高CaCl2的浓度,转化效率急剧下降。

（CaCl2浓度对感受态细胞转化效率的影响王友如(湖北师范学院生物系,湖北黄石435002)）

灭菌的准备及试剂配置

（1）CaCl2，100mL分装于2个50mL管中，灭菌备用。

（2）甘油，10mL备用灭菌

（3）1个Amp—LB固体培养基平板（用于划线，挑去单克隆菌株）

（4）100mL Amp—培养基

（5）10~20个10mL离心管

4~8个50mL离心管

感受态细胞的制备（化学CaCl2法）-实验操作中严格灭菌、低温、速度

①DH5α菌株在Amp—LB固体培养基平板上划线，37℃培养12—16h，至其长出单克隆菌

株。（-划线作用、培养时间作用）

TG1菌株生长速度比DH5α快，只需37℃培养8—12h

划线作用

用接种环在平板培养基表面通过分区划线而达到纯化分离微生物的一种方法。是将微生物样品在固体培养基表面多次作“由点到线”稀释而达到分离的目的。用于目的微生物的分离，便于得到目的性状的单克隆。

培养时间

从图1可以看出,重组大肠杆菌DH5α生长的4 个时期区分非常明显。0~3h为迟缓期,重组大肠杆菌适应新的环境,繁殖的速度很慢;4~9h为对数生长期,此时营养物质很充分,重组大肠杆菌呈对数快速增长;10~16h为稳定期,由于培养基中的营养物质不断地被消耗掉,重组大肠杆菌新陈代谢产生的毒性物质的积累以及pH值下降等因素的影响,重组大肠杆菌繁殖的速度逐渐下降,而死亡的细菌数开始逐渐增加,增殖数与死亡数渐趋平衡,细菌总数处于稳定的状态;17~20h为衰亡期,由于营养物质逐渐减少,而毒性物质越来越多,重组大肠杆菌的繁殖速度就逐渐减缓,死亡菌数明显增多,衰亡的速度超过繁殖的速度,细菌总数就呈现下降趋势。

所以选择培养时间为12—16小时。

②Amp—LB平板上挑取单菌落，轻移至1mL LB Amp—液体培养基中（2mL离心管），37℃

220rpm/min，摇床37℃培养8h左右。

③取1mL×2的空白培养基做对照暂存于4度，将1mL 活化菌液全部转移至100mL LB Amp

—液体培养基中，37℃，220rpm/min培养2h—3h，使其OD600约等于0.4~0.6（处于对数生长期）（-培养时间可否延长，OD值为何测OD600，其数值可否超过0.6，原因什么）

注：测OD值准备-枪、枪头、菌液、空白培养基、ddH2O、纸巾

空白对照：第三步去除的空白培养基实验组：摇菌后的菌

进行第四步之前准备冰、冰盒、10ml管、菌液全部埋于冰中。2ml或1.5ml空管放-20℃预冷。