体外放射配基结合分析与临床应用
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体外分析技术
Ag
25
50
100
200
400
800
*Ag
Ab
分离B、F
B1%
B2%
B3%
B4%
B5%
B6%
1
2
3
4
5
6
B%
？
B%
F%
B/F
Calibration Curve
优缺点比较
1、放射免疫分析技术
放射免疫技术是利用放射性核素可探测的灵敏性、精确性与抗原抗体反应的特异性相结合的一类免疫测定技术。 放射免疫分析（radioimmunoassay，RIA）——以标记抗原与反应系统中未标记抗原竞争结合特异性抗体来测定待检样品中抗原量。 免疫放射分析（immunoradiometric assay，IRMA）——以过量标记抗体与抗原非竞争结合，采用固相免疫吸附载体分离游离和结合标记抗体。
不同的肿瘤标记物可能出现在相同的粘蛋白上 在肿瘤细胞株中CA199,CA50和CA242共同表达于 MUC-1和诞腺蛋白中。（Baeckstrom et al, 1992）
肿瘤的发展及诊断期
肿瘤标志物在全球的应用情况
肿瘤标志物的分类（化学特性）
癌胚抗原类标志物 糖类抗原标记物 酶类标志物 激素类标志物 癌基因 其他
肿瘤与肿瘤标记物
相同的肿瘤可能检测出多种不同的肿瘤标记物 相同的肿瘤标记物可能出现在不同的粘蛋白上 CA19-9和CA50已经在不同的粘蛋白核心上得到鉴定: MUC-1,MUC-3。（Baeckstrom et al, 1992和1995） 涎腺蛋白。（Baeckstrom et al,1995） 颌下腺粘蛋白 支气管肺泡粘蛋白
1、放射免疫分析技术
优点：超微量分析技术，具有很高的精密度、灵敏度和准确度 缺点：反应条件要求一般，但该技术所用试剂具有放射性，对人体有一定的危害，实验人员应加强防护。同时试剂存在半衰期，试剂必须在半衰期内用完，否则试剂会作废，这需要科学地做好试剂计划。另外反应过程中抗原的含量低到一定程度时会出现不确定因素，使灵敏度受到限制。
核医学体外放射分析技术课件
有效地排除非特异性物质对结合反应的干 扰。
二、结合反应动力学规律
• 遵守质量作用定律 • [L]+[B] 适当的实验条件 [LB]
衍生设计出两种方法学
• 1、竞争结合（competitive binding) • 过量的配体与有限量的结合剂发生竞争性
结合反应。 • 2、非竞争结合（non-competitive binding) • 过量的结合剂与有限量的配体，在非竞争
的条件下发生结合反应。
衍生设计出两种方法学
• 1、竞争结合（主要应用：放射免疫分析）
• [L]+ [L*]+[B] [LB] +[L*B]
• 2、非竞争结合
•结合在试管 或包被珠上
• Sp.Ab1+Ag Sp.Ab1.Ag
• Sp.Ab1.Ag +Ab2* Sp.Ab1.Ag.Ab2*+Ab2*
优点
• 慢性淋巴细胞性甲状腺炎： • 早期：T3,T4升高，然后降低，
TSH,TGAB,TPOAB升高。 • 甲状腺肿瘤：TG升高。 • 全身性疾病：心血管疾病、肿瘤等： • T3下降，rT3、TSH升高。
（二）肾上腺疾病
• 皮质醇增多症： • ACTH\COR正常情况下有节律分泌，检测
可以与单纯性肥胖区分。 • 原发性醛固酮增多症：尿游离皮质醇
• 反应误差关系 • 精密度图
• 2、准确度：测的值与其标称值之间的 相符程度。
• 3、灵敏度（sensitivity): • 4、特异性(specificity) • 5、稳定性(stability)
（三）质量评价
• 内部质量控制 • 外部质量控制
三、以配体与受体间结合反应 为基础的分析系统
二、结合反应动力学规律
• 遵守质量作用定律 • [L]+[B] 适当的实验条件 [LB]
衍生设计出两种方法学
• 1、竞争结合（competitive binding) • 过量的配体与有限量的结合剂发生竞争性
结合反应。 • 2、非竞争结合（non-competitive binding) • 过量的结合剂与有限量的配体，在非竞争
的条件下发生结合反应。
衍生设计出两种方法学
• 1、竞争结合（主要应用：放射免疫分析）
• [L]+ [L*]+[B] [LB] +[L*B]
• 2、非竞争结合
•结合在试管 或包被珠上
• Sp.Ab1+Ag Sp.Ab1.Ag
• Sp.Ab1.Ag +Ab2* Sp.Ab1.Ag.Ab2*+Ab2*
优点
• 慢性淋巴细胞性甲状腺炎： • 早期：T3,T4升高，然后降低，
TSH,TGAB,TPOAB升高。 • 甲状腺肿瘤：TG升高。 • 全身性疾病：心血管疾病、肿瘤等： • T3下降，rT3、TSH升高。
（二）肾上腺疾病
• 皮质醇增多症： • ACTH\COR正常情况下有节律分泌，检测
可以与单纯性肥胖区分。 • 原发性醛固酮增多症：尿游离皮质醇
• 反应误差关系 • 精密度图
• 2、准确度：测的值与其标称值之间的 相符程度。
• 3、灵敏度（sensitivity): • 4、特异性(specificity) • 5、稳定性(stability)
（三）质量评价
• 内部质量控制 • 外部质量控制
三、以配体与受体间结合反应 为基础的分析系统
第8章 体外放射分析技术新版
抗体包被分离法
特点：试管包被第二抗体 原理：SP－Ab2－Ab1－*Ag
Ab2
优点：固相包被具有简便、快速、稳定、不需离心等， 有逐渐取代液相法的趋势。
固相吸附分离法
吸附分离剂是固相颗粒，它可以从反应液中吸附游离抗原。活性 炭是常用的吸附剂，多用于小分子游离抗原和抗原－抗体复合物的分 离。具体应用时在活怀炭颗粒的表面涂上一层右旋糖酐或蛋白类化合 物，这样在活性炭的表面形成一定大小的孔洞，在反应液中加入这种 特殊颗粒时，小分子的游离抗原就会被活性炭吸附，从而达到分离B 与F的目的。
逐个代入上式，即可求得各样品的含量 X。 优点：操作简单，用计算器也可拟合。
缺点：①由于Log 0无解，拟合时丢掉0剂量点，降低了灵敏度②
如有突出值，整条拟合线会偏离；③在顺序加样法中不是 直线不可用。
2. 四参数Logistic模型 本法从Logit-Log法演化而来，其函数式如下： Y=（a-d）/「1+（X/C）b」+d 式中Y是标记抗原在各实验点的结合率（包括NSB），X 是各点的剂量。a、b、c、d是四个参数。a代表0剂量时
1、系统误差（systematic error）这种误差常表现为检测结果呈 倾向性的偏高或偏低，是一些可以确定的因素导致的。（1）方法 误差，如标准品稀释体积不正确；抗体过浓或过稀，分离效果不 好；不适当的曲线拟合模型等。（2）仪器和试剂误差，如仪器状
态不佳；量器不准；试剂不纯等。（3）操作误差，如不正确的操
作习惯、错加样品等。系统误差是可以通过努力消除的。 2、随机误差（random error）这种误差是由难以确定且无法控
制的原因（偶然因素）引起，误差的出现是随机的，与真值的偏
体外放射分析【40页】
者为竞争性，后者为饱和分析。
以酶与底物间的酶促反 应为基础的分析方法
主要有两类方法
放射酶分析法：以酶为结合剂，测量配 体的含量；
酶的放射化学测定：以放射性标记的底 物为配体，测定酶的活性。
竞争性蛋白质结合分析
基本技术
标准品
质的要求 与待测配体属同类物质 与待测配体有同等的活性和亲和能力 纯度高，不含其它杂质、稳定性好
半对数坐标系制图法
制图方法简便，但易导致主观误差。
B/F (%)
Log X
质量控制
Bo％、NSB％、ED50、RER、CV、 精密度图、质控样品等。
主要方法
放射免疫分析、免疫放射分析、放射受体分析、 受体放射分析、蛋白质竞争结合分析等。
其中以放射免疫分析和免疫放射分的测量，而且可用于具有生物活性的小 分子物质的检测，如血药浓度测定等。
基本原理
竞争性结合分析 放射免疫分析是体外放射分析最有代表性的一
反应原理
Ligand + Receptor + L*
L.R L*.R
受体放射分析
受体放射分析(receptor radioassay) 是以分析受体的数量和性质为目的 一定量受体只能与一定量的标记配体（受体激
动剂和阻断剂）结合，受体具有一定的饱和度 根据复合物的最大放射性及所用标记配体的比
已知Ag浓度
非竞争性分析
免疫放射分析是典型的非竞争性体外放 射分析。它应用标记抗体作为示踪剂， 在反应系统中加入过量的标记抗体、待 测物（或标准品）进行全量反应，未结 合的标记抗体通过加入免疫吸附剂而去 掉，因此，溶液中放射性与待测物的浓 度呈正相关。
基本类型
以抗原抗体间的免疫反应为基础的分析技术
以酶与底物间的酶促反 应为基础的分析方法
主要有两类方法
放射酶分析法：以酶为结合剂，测量配 体的含量；
酶的放射化学测定：以放射性标记的底 物为配体，测定酶的活性。
竞争性蛋白质结合分析
基本技术
标准品
质的要求 与待测配体属同类物质 与待测配体有同等的活性和亲和能力 纯度高，不含其它杂质、稳定性好
半对数坐标系制图法
制图方法简便，但易导致主观误差。
B/F (%)
Log X
质量控制
Bo％、NSB％、ED50、RER、CV、 精密度图、质控样品等。
主要方法
放射免疫分析、免疫放射分析、放射受体分析、 受体放射分析、蛋白质竞争结合分析等。
其中以放射免疫分析和免疫放射分的测量，而且可用于具有生物活性的小 分子物质的检测，如血药浓度测定等。
基本原理
竞争性结合分析 放射免疫分析是体外放射分析最有代表性的一
反应原理
Ligand + Receptor + L*
L.R L*.R
受体放射分析
受体放射分析(receptor radioassay) 是以分析受体的数量和性质为目的 一定量受体只能与一定量的标记配体（受体激
动剂和阻断剂）结合，受体具有一定的饱和度 根据复合物的最大放射性及所用标记配体的比
已知Ag浓度
非竞争性分析
免疫放射分析是典型的非竞争性体外放 射分析。它应用标记抗体作为示踪剂， 在反应系统中加入过量的标记抗体、待 测物（或标准品）进行全量反应，未结 合的标记抗体通过加入免疫吸附剂而去 掉，因此，溶液中放射性与待测物的浓 度呈正相关。
基本类型
以抗原抗体间的免疫反应为基础的分析技术
体外放射分析
RIA的基本条件
Specific binding reagent
• 特异性结合剂抗体特异性(specificity)：交 叉反应的程度越小越好 • 亲和力(affinity)：配体与结合剂相互结合 的程度，是反映结合剂质量的主要指标。 可用亲和力常数表示。 • 滴度(titer)：在RIA时，结合50%的标记配 体的结合剂稀释度；IRMA分析要求较高 滴度（过量）。
Competive inhibition curve
• Binding rate（％）
• Concentration of antigen(mol/L)
抗体的工作浓度
• Ag*与Ag的免疫化学性质相同； • Ag*与Ag之和大于Ab，Ag*与Ab的量保持恒定。 Binding rate(%) 50%
体外放射分析
内容提要
• Part one: 体外放射分析技术 •Part two: 非放射免疫分析技术 • Part three: 临床应用
历史
• 1960年美国的Berson和Yalow 将核技 术与免疫学技术相结合建立了放射免疫 分析法，并首先用于测定血浆胰岛素浓 度，由于该法对医学的巨大贡献，1977 年Yalow获得了Nobel奖。
Definition
• 在体外条件下 In vitro 以放射性核素标记的配体为示踪剂Tracer 以结合反应为基础 Base 以放射性测量为定量手段 Means 对微量物质进行定量分析Quantitative analysis 一类分析方法的总称。 General name
Main methods
• 半对数坐标系制图法制图方法简便，但 易导致主观误差。 B/F (%) Log X
• 特异性抗体：亲和力大，滴度高，特异性强 • 标记抗原：纯度高；较高的比活度；放化纯度 >95%;保持免疫活性;标记稳定性好,无核素脱落 • 标准品:与被测物属同一种物质,具有相等的活 性,高度纯化;定量要精确(国家标准;药盒标准; 质控标准) • B与F分离技术:完全又快速,非特异性结合低;不 易受外界因素的干扰;价廉,操作简便,重复性好 (双抗法,沉淀法,双抗+PEG法,固相分离法,SPA 法,微孔滤膜法) • 放射性测量仪器: 计数器
体外放射配体结合分析
实
验
AFP放射免疫（快速法）测定
AFP放射免疫（快速法）测定
实验报告
姓名 学号 期、班级 实验名称 实验原理 实验方法（步骤） 实验结果 讨论*
AFP放射免疫（快速法）测定
加样
100 μl 100 125 μI-AFP l 抗体 AFP 缓 冲 液
100μl AFP 10ng/ml
100μl AFP 25ng/ml
单克隆抗体涂被固相载体，形成固相
抗体，通常为试管底部； 试管内加入标准品或待测样品，形成 固相抗原抗体复合物 加入放射性核素标记的单克隆抗体， 形成固相抗体-抗原-*抗体复合物 剩余的标记单克隆抗体则留于液相中， 通过洗管洗去 测量试管中的放射性计数，经标准曲 线就可查出待测物含量
反应式
*Ag+ Ab + Ag *Ag-Ab+ *Ag
限量
Ag-Ab + Ag
Ag: 待测抗原 *Ag: 标记抗原 Ab: 抗体 Ag-Ab: 抗原抗体复合物 *Ag-Ab: 标记抗原抗体复合物
放射免疫分析技术原理示意
标准曲线
基本试剂
标准抗原
标记抗原
即标准品，与 待测物具有相同 的化学结构、免 疫学活性， 是RIA的示综剂， 125I，纯度高，合适的 比活性，标记后抗原 免疫活性不受破坏 特异性高，滴 度高，亲和力大
固相-Ab1+Ag （待测） 固相-Ab1-Ag +*Ab2
固相-Ab1-Ag -*Ab2+*Ab2
基本特点
标记物为抗体，不影响抗原的免疫活性 使用的是单克隆抗体，特异性明显提高 单克隆抗体为大分子物质，碘化标记抗体比
抗原容易，产物比较稳定
检测灵敏度较RIA高，且检测范围扩大 操作更为简便、快速 抗体用量大，成本较高 仅适用于蛋白质类大分子物质的检测
检验核医学体外标记分析技术的临床应用
检验核医学体外标记分析技术的临床应用核医学是一门应用核物理学原理和方法，以放射性药剂内摄影和定量测定为特征的医学科学。
体外标记分析技术是核医学的重要组成部分，广泛应用于临床诊断、治疗和研究领域。
本文将探讨核医学体外标记分析技术在临床应用中的重要作用和发展趋势。
一、核医学体外标记分析技术简介核医学体外标记分析技术是通过将放射性标记剂与特定的生物分子结合，在体外对其进行标记分析的一种技术。
这种技术可以通过测定放射性标记剂的浓度，推断出被标记生物分子的性质、数量和分布情况。
常见的核医学体外标记分析技术包括放射性免疫分析、放射性核素标记的DNA检测和靶向药物放射性标记等。
二、核医学体外标记分析技术在临床应用中的重要作用1. 诊断疾病核医学体外标记分析技术在临床诊断中发挥着重要作用。
例如，放射性免疫分析可以通过测定血液中特定抗体的浓度，帮助医生判断免疫系统功能的异常和疾病的发展情况。
靶向药物放射性标记则可以帮助医生评估肿瘤靶向治疗的疗效。
2. 治疗疾病除了诊断，核医学体外标记分析技术还可以用于治疗疾病。
例如，放射性核素标记的DNA检测技术可以用于癌症治疗中的调控基因表达和药物敏感性，从而实现个体化治疗的目标。
3. 研究疾病机制核医学体外标记分析技术在研究疾病机制方面具有重要的应用价值。
通过标记分析生物分子的性质和数量变化，可以揭示疾病的发生发展机制，并为新药研发提供重要数据支持。
三、核医学体外标记分析技术的发展趋势1. 多模态标记分析技术随着医学影像学和分子生物学的发展，多模态标记分析技术成为核医学的发展趋势之一。
多模态标记分析技术通过将不同类型的标记剂结合，可以同时获得多个不同层次的信息，提高诊断的准确性和灵敏度。
2. 分子靶向标记技术分子靶向标记技术是核医学体外标记分析技术的另一个发展方向。
该技术通过标记分析特定靶点的生物分子，可以实现对特定靶点的有效检测和定量测定，为个体化诊疗提供重要依据。
3. 自动化分析系统为了提高标记分析技术的效率和准确性，自动化分析系统逐渐应用于核医学体外标记分析技术中。
体外放射配基结合分析及临床应用
非标记配基高亲和力高浓度18受体显像配基基本要求半衰期适中发射正电子或单光子sa37tbqmmol动态显像时用生理数学模型可作受体密度的模拟定量分析192021222324受体在医学研究中的应用受体效应器偶联机理异常25受体理论在疾病研究中的应用寻找防治措施26344例乳腺癌内分泌治疗效果与erpr的关系受体状态治疗例数有效例数有效率erpr9112132erpr10300erpr12537296erpr1188975427er和pr与乳腺癌化疗效果的关系136例受体状态治疗例数有效例数有效率er25120prer4534756pr3422647erpr24218752832例乳腺癌er状态与激素治疗关系cytosolnuclear治疗例数反应例数无反应例数221829乳腺癌胞浆er不同水平与激素治疗的关系er含量fmolmgpro有效率1008131004530乳腺癌er状态与内分泌治疗效果的关系erertamoxifen326715nafoxidene71008stilboostrol912117dophrectomy2843274adrenalectomy152219androgens1028222glucocorticoids1532019hypophsectomy914112总有效率1282355457176431degenshein根据乳腺癌受体表达情况和癌转移情况提出如下治疗方案并得到临床广泛采用er腋下淋巴结无转移手术治疗外可不用内分泌治疗要作定期复查
放射配基 + 受体分子
分离配基受体复合物
分析受体数量 和亲和力
RBA的分类
定性RBA：通过反应的量效关系及某些参 数的变化等来判断受体的类型、单位点 或多位点系统、受体与配基相互作用的 特点 (可逆或不可逆，受体间的合作作 用 )。 定量RBA：在已知反应性质的基础上，通 过结合反应分析组织或细胞中受体数目 （binding site,结合位点数）。
放射配基 + 受体分子
分离配基受体复合物
分析受体数量 和亲和力
RBA的分类
定性RBA：通过反应的量效关系及某些参 数的变化等来判断受体的类型、单位点 或多位点系统、受体与配基相互作用的 特点 (可逆或不可逆，受体间的合作作 用 )。 定量RBA：在已知反应性质的基础上，通 过结合反应分析组织或细胞中受体数目 （binding site,结合位点数）。
体外放射分析
三、放射免疫分析的分离方法
分离方法的基本要求 ● 尽可能使结合与游离部分完全分开 ● 分离效果稳定，不受外界干扰 ● 非特异性结合尽可能小 ● 操作简便、分离迅速、适应大量样品分析、 重复性好 ● 分离部分适应自动化测量和数据处理
常用分离方法
● 双抗体法---- 免疫分离法 ● 非特异性沉淀法 ● 吸附分离法 ● 固相抗体法 ● 其他 葡萄球菌 A 蛋白沉淀法、 层析电泳法、屏蔽计数法
双抗体法----免疫分离法 + 抗原 第一抗体 可溶性复合物 + 第二抗体体
可沉淀复合物 双抗体法分离原理示意图
四、放射免疫分析的质量控制
质控目的：对分析误差进行经常性的 检查
质控内容：实验室内质控 实验室间质控
● ● ● ● ● ● 标准曲线的质量检查 各未知样品分析结果的可靠性检查 整批实验的精密度检验 批内漂移的检验 整批实验偏差检验 长期漂移的检验（批间质控）
● Woof 作图
F KD F SB B max B max
● Lineweaver-Burk 作图
1 1 KD 1 SB B max B max F
● Hill 作图（Logit 作图）
四、受体在医学研究中的应用 ----受体与疾病
疾病时受体的变化
● 受体数目的变化 ● 受体亲和力的变化 ● 受体特异性的变化 ● 受体的自身抗体 ● 受体-效应器偶联机理异常
[RT-RL][LT-RL] == --------------[RL]
SB/F
Slope=-1/Kd
Bmax
SB fmol/ml Scatchard 作图
受体最大结合容量的表示方式
１ 胞浆及胞膜等的受体含量: fmol/mg蛋白 ２ 胞核的受体含量: fmol/mgDNA ３ 完整细胞受体的含量: 结合位点/细胞(site/cell)或fmol/106cell
体外放射分析
四. 放射免疫分析的质量控制 一般包括以下几个方面： 一般包括以下几个方面： 最高结合率(B0 (B0％ 1．最高结合率(B0％)指不加非标记抗原时标记抗原与 抗体的结合率，一般要求在30 50％。 30～ 抗体的结合率，一般要求在30～50％。 非特异性结合率(NSB (NSB％ 2．非特异性结合率(NSB％)指不加抗体时标记抗原与非 特异性物质的结合率，一般要求＜ 10％。 特异性物质的结合率，一般要求＜5～10％。 截距a 斜率b 3．标准曲线直线回归的参数 截距a、斜率b和相关系数 是标准曲线的主要质控指标，要求a 值稳定， 0.99。 r是标准曲线的主要质控指标，要求a、b值稳定，r＞0.99。 ED25、ED50及 指标准曲线的结合率在25％、50 25％、 4．ED25、ED50及ED75 指标准曲线的结合率在25％、50 75％时对应的抗原浓度值，它反映标准曲线的稳定性， ％及75％时对应的抗原浓度值，它反映标准曲线的稳定性， 有助于批间结果的比较。 有助于批间结果的比较。 反应误差关系(RER)是评价RIA整批误差的综合指标， (RER)是评价RIA整批误差的综合指标 5．反应误差关系(RER)是评价RIA整批误差的综合指标， RER应 0.04。 RER应＜0.04。 连续测定10批以上高、 10批以上高 6．质控图 连续测定10批以上高、中、低三种已知浓度 的质控血清(QCS)，求出各自的均数±标准差(X±SD)，并画 的质控血清(QCS)，求出各自的均数±标准差(X±SD)， (QCS) (X 出质控图，以后每次进行RIA时均要同时测定此高、 RIA时均要同时测定此高 出质控图，以后每次进行RIA时均要同时测定此高、中、低 QCS，将测得值标在图上。WHO要求在一次实验中 要求在一次实验中， QCS，将测得值标在图上。WHO要求在一次实验中，有下列情 况之一者，其结果应予舍弃： 三种QCS中有一个测定值＞ QCS中有一个测定值 况之一者，其结果应予舍弃：①三种QCS中有一个测定值＞ 3SD； 三种QCS中在同一方向上有二种＞2SD②三种QCS QCS中在同一方向上有二种 QCS均在 3SD；②三种QCS中在同一方向上有二种＞2SD②三种QCS均在 方向＞1SD。 同-方向＞1SD。
体外放射分析的临床应用
体外放射分析的临床应用体外放射分析（in vitro radiolabeling）是一种利用放射性同位素标记化合物，并通过测量其放射性衰减来定量分析和测定化合物在生物体内的代谢和动力学特性的方法。
这种技术被广泛应用于医学和生物学领域，为临床诊断和治疗提供了重要的工具和指导。
本文将探讨体外放射分析在临床应用方面的重要性和发展。
体外放射分析技术是通过选择适当的放射性同位素对目标分子进行标记，然后通过计数器或放射性测量设备测量其放射性衰减，从而获得相关的代谢和动力学数据。
借助这项技术，医生和研究人员能够了解药物在体内的分布、转化和清除情况，从而为临床治疗提供科学的依据。
在临床应用方面，体外放射分析技术在药物研发、肿瘤诊断和治疗、心脑血管疾病研究等领域发挥着重要作用。
首先，该技术可以用于药物药代动力学研究，通过测量药物在体内的消除速率和分布情况，进一步优化药物剂量和给药方式，以提高治疗效果和减少不良反应。
其次，体外放射分析还可用于肿瘤标记和显像，通过选择适当的放射性同位素标记肿瘤特异性配体或药物，可以帮助医生准确评估肿瘤的位置、大小和代谢活性，从而为肿瘤的诊断和治疗提供重要信息。
此外，体外放射分析还可以用于心脑血管疾病研究，包括心脏灌注显像、脑血流量测定等，为相关疾病的诊断、治疗和病情监测提供有力支持。
与传统的临床检测方法相比，体外放射分析技术具有一定的优势和特点。
首先，放射性同位素标记物具有极高的灵敏度和特异性，可以在较低浓度下进行检测，从而实现对生物体内微量物质的准确分析。
其次，该技术具有实时动态监测的能力，能够对药物和其他生物分子在生物体内的时空分布情况进行连续观察，揭示其代谢途径和作用机制，为仿真仿真仿真量给药提供重要参考。
此外，由于体外放射分析使用的是放射性同位素标记，其测量结果更具客观性和可比性，能够为临床研究和临床治疗提供科学依据。
尽管体外放射分析技术在临床应用领域具有广阔的前景，但仍然面临一些挑战和限制。
【核医学】体外放射分析技术
三、放射测量
• 直接检测技术灵敏度通常较低 • 采用示踪技术进行间接测量 • 37Bq/10-15g，提高比活度可提高灵敏度 • 放射性原子标记到配体或结合剂分子 • 何种核素？何种射线？
非放射定量技术
• 化学发光技术 • 时间分辨荧光分析技术 • 电化学发光技术 • 酶定量技术：灵敏度差。
• 受体放射分析 (receptor radioassay) ：检 测受体本身数量及其他参数。
• 放射受体分析(radioreceptor assay）：测 受体抗体：如TRAb。
• 四、酶活性放射分析、放射酶促分析 • 五、蛋白结合分析
第三节 临床应用
• 一、内分泌系统疾病 • 甲状腺、肾上腺、性腺、垂体、下丘脑 • 二、肿瘤标志物 • 三、神经系统、循环系统、消化系统、泌
• [L]+ [L*]+[B] [LB] +[L*B]
• 2、非竞争结合
•结合在试管 或包被珠上
• Sp.Ab1+Ag Sp.Ab1.Ag
• Sp.Ab1.Ag +Ab2* Sp.Ab1.Ag.Ab2*+Ab2*
优点
• 竞争结合： • 节约结合剂用量 • 非竞争结合： • 灵敏度高，试验周期更短，误差更小。
logistic拟合法
3、两类分析系统的比较
标记对象 抗体 方法学 反应动力学 标准曲线 NSB影响 误差 批间比较
RIA
IRMA
抗原
抗体
多克隆，量少 单克隆，量大
竞争
非竞争
复杂，不稳定 简单，稳定性好
负相关，量程窄 正相关，量程较宽
高剂量段
低剂量端
较大
较小
可比性强
可比性差
体外放射分析的临床应用
2
三、胃肠及胰腺激素 掌握胃泌素、胰岛素、C肽、胰高血糖 素、胆囊收缩素、胰多肽的概述、正常 参考值和临床意义。 四、其它肽类激素 掌握生长激素、垂体促性腺激素、人 绒毛膜促性腺激素、催乳素、人胎盘泌 乳素、促肾上腺皮质激素、降钙素的概 述、正常参考值和临床白质 掌握肌红蛋白、铁蛋白、甲胎蛋白、β2微球蛋白、白蛋白、免疫球蛋白、β-血小板 球蛋白、甲状腺素结合球蛋白、甲状腺球蛋 白的概述，正常参考值和临床意义。 二、抗体及病原体 掌握抗甲状腺球蛋白抗体和抗甲状腺微粒 抗体、甲状腺刺激抗体、抗DNA抗体、及乙肝 的三个抗原抗体系统的概述、正常参考值和 临床意义。
4
二、抗体及病原体 掌握抗甲状腺球蛋白抗体和抗甲状腺 微粒抗体、甲状腺刺激抗体、抗DNA抗体、 及乙肝的三个抗原抗体系统的概述、正 常参考值和临床意义。
5
二、肿瘤标志物 掌握癌胚抗原及CA-125、CA19-9、PAP的概 述、正常参考值和临床意义。 三、其它活性物质 掌握CAMP、CGMP、胆汁酸、心房利纳 因子、前列腺素、血栓素β2 及肾素-血 管紧张素的概述、正常参考值和临床意 义。
第八章 体外放射分析的临床应用
第一节 激素类 一、下丘脑-垂体-甲状腺轴激素 (一)掌握TT3、TT4、FT3、FT4的概述、正 常参考值、临床意义。 (二)掌握TSH、TRH的概述、正常参考值和 临床意义。 二、类固醇激素 掌握皮质醇、醛固酮、T、 R、E2、E3、皮质酮的概述、正常参考值 和临床意义。
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三、胃肠及胰腺激素 掌握胃泌素、胰岛素、C肽、胰高血糖 素、胆囊收缩素、胰多肽的概述、正常 参考值和临床意义。 四、其它肽类激素 掌握生长激素、垂体促性腺激素、人 绒毛膜促性腺激素、催乳素、人胎盘泌 乳素、促肾上腺皮质激素、降钙素的概 述、正常参考值和临床白质 掌握肌红蛋白、铁蛋白、甲胎蛋白、β2微球蛋白、白蛋白、免疫球蛋白、β-血小板 球蛋白、甲状腺素结合球蛋白、甲状腺球蛋 白的概述，正常参考值和临床意义。 二、抗体及病原体 掌握抗甲状腺球蛋白抗体和抗甲状腺微粒 抗体、甲状腺刺激抗体、抗DNA抗体、及乙肝 的三个抗原抗体系统的概述、正常参考值和 临床意义。
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二、抗体及病原体 掌握抗甲状腺球蛋白抗体和抗甲状腺 微粒抗体、甲状腺刺激抗体、抗DNA抗体、 及乙肝的三个抗原抗体系统的概述、正 常参考值和临床意义。
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二、肿瘤标志物 掌握癌胚抗原及CA-125、CA19-9、PAP的概 述、正常参考值和临床意义。 三、其它活性物质 掌握CAMP、CGMP、胆汁酸、心房利纳 因子、前列腺素、血栓素β2 及肾素-血 管紧张素的概述、正常参考值和临床意 义。
第八章 体外放射分析的临床应用
第一节 激素类 一、下丘脑-垂体-甲状腺轴激素 (一)掌握TT3、TT4、FT3、FT4的概述、正 常参考值、临床意义。 (二)掌握TSH、TRH的概述、正常参考值和 临床意义。 二、类固醇激素 掌握皮质醇、醛固酮、T、 R、E2、E3、皮质酮的概述、正常参考值 和临床意义。
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体外放射分析技术
安徽医科大学 基本试剂
(一)特异性结合剂
特异性结合剂包括抗体、血浆结合球蛋白和受体
1. 抗体
抗体的制备是用适宜的纯化的免疫原在动物身上 人工免疫，分子量>5000的蛋白多肽类物质具有较好 的免疫原性。
抗血清质量鉴定的检测指标是滴度、亲和力和特 异性。
抗体应具备三个条件：高亲和力、高特异性和高 滴度。
精密度
灵敏度
准确度
安徽医科大学
精密度是指同一样品重复测定的实测量的离散程度。离 散程度越小，则能区别的样品量差别越小，也就是分析系统 的精密度越高。
灵敏度就是统计上能与零剂量相区别的最小值。
准确度是指样品的测定值偏离真值的程度，由于实际样 品的真值是未知的，常用估计准确度的方法是测量实际样品 外加标准品的回收率。理论上回收率一般以90%-110%之间。
肺癌，乳腺癌，肝癌，结肠癌等各类恶性肿瘤及其转移灶
甲状腺机能亢进症(甲亢)、甲状腺功能低下(甲低)、亚急性甲状腺炎、 弥漫性或结节性甲状腺肿、甲状腺瘤
异位甲状腺 嗜铬细胞瘤和其他神经内分泌肿瘤 骨质疏松症
18F-FDG正电子PET断层显像 运动负荷心肌灌注显像 局部脑血流断层（rCBF）显像 18F-FDG正电子PET断层显像或脑血流
灌注显像 肺灌注和肺通气显像 核素下肢静脉造影 肝血池断层显像 肝胆造影 Captopril介入肾动态显像 肾动态显像 肾动态显像 + 利尿试验 阴囊显像 全身骨显像 三相局部骨显像 18F-FDG正电子（PET）全身或局部断
层显像
甲状腺显像
1 3 1 碘甲状腺显像 1 3 1I-MIB G肾上腺髓质显像 骨密度测定
安徽医科大学
临床常见病种的检查项目
序号 01
体外放射分析(检验)-检验核医学
一 体外放射分析的概述
（一）特异性结合
1、抗原与抗体 2、配体与受体 3、底物与酶 4、激素与血浆结合球蛋白
（二）结合反应动力学规律
[L]+[B]=[LB]
1、竞争性结合分析 [L]+[*L]+[B]=[LB]+[*LB]
2、非竞争性结合分析
Sp.Ab1+Ag=SpAb1.Ag+*Ab2=Sp.Ab1. Ag.*Ab2+*Ab2
滴度：
结合50%标记抗原时血清的稀释度
单克隆抗体
特点：
特异性高 抗体成分专一 可反复制备
制备：
1、免疫小鼠，制备脾细 胞悬液
2、选择培养，用HAT培 养基筛选杂交瘤细胞
3、检测抗体 4、克隆化
（三）分离方法
1、分离方法的要求
1、使结合部分与游离部分尽可能完全分开 2、分得的成分便于作放射性操作 3、分离效果不受外界干扰因素影响 4、操作简便、分离迅速、重复性好 5、试剂来源广泛、价廉易得
（Radio Receptor Assay, RRA）
[L]+[*L]+[B]=[LB]+[*LB]
（一）放射免疫分析原理
*Ag+Ag+Ab =(*Ag—Ab)+(Ag—Ab)+*Ag + Ag
0
条件：
Max
Min
放射
性计
数
1、 *Ag定量、足量
2、 Ab限量 *Ag>Ab
Ag与*Ag-Ab成反比！
体外放射分析指在体外实验条件下，以特
异结合反应为基础，以放射性测量为手段， 对生物活性物质进行超微量分析的总称。
特点：灵敏度高、特异性强、精密度好、
检验核医学：体外放射分析
4.标记抗体浓度
增加标记抗体可缩短反应时间,扩大测量范围,但 非特异性结合也二次洗涤
6.血清、电解质和其它溶质的非特异性效应
血清效应:指血清中的有关成份(如IgM或α2微球蛋白 能非特异性抑制抗原抗体特异性结合的效应.反应温 度越高,血清效应越明显.
的范围，则强烈提示本批实验有系统偏差，应 当舍弃后重做。
特异性（specificity)
• 交叉反应的检测 干扰物质抑制结合率50%所需浓度与待测物 本身抑制50%所需浓度之比即为衡量交叉反 应的参数
交叉反应率 [Y ]50 100% [Z ]50
•对cGMP的RIA, ATP无抑制作用，即交叉反应极小， cAMP抑制结合率50%所需浓度为cGMP的100倍，通常就 说cAMP对该cGMP抗体的交叉反应为1:100.
方法1
“0”剂量点结合率的均值减去其 二倍标准差所对应的剂量值.
方法2
“0”剂量点结合率降低10%后的 结合率对应的剂量值为最小 可测剂量,如反应参数采用 B/B0，则应以B/B0=90%时 对应的剂量为最小可测量
测定10个或10个以上的“零” 标准管，求出各管的结合率 （B/T%）和10个管结合率的均 数和标准差，用均数减去两个 标准差，求其相对应的浓度， 即为最小检出值。
体外放射分析
竞争放射分析
*放射免疫分析 *放射受体分析 竞争性蛋白结合分析
非竞争放射分析
免疫放射分析 酶放射分析 放射酶促分析 *非标记免疫分析技术
放射免疫分析
（Radioimmunoassay RIA）
以标记物与被测物及特异性结合试 剂发生竞争结合反应，从而对被测
的极微量物质作定量分析。
RIA的特点：
• 灵敏度高 可达10-9 ～１0-15g • 特异性强 • 应用范围广 • 操作简便
增加标记抗体可缩短反应时间,扩大测量范围,但 非特异性结合也二次洗涤
6.血清、电解质和其它溶质的非特异性效应
血清效应:指血清中的有关成份(如IgM或α2微球蛋白 能非特异性抑制抗原抗体特异性结合的效应.反应温 度越高,血清效应越明显.
的范围，则强烈提示本批实验有系统偏差，应 当舍弃后重做。
特异性（specificity)
• 交叉反应的检测 干扰物质抑制结合率50%所需浓度与待测物 本身抑制50%所需浓度之比即为衡量交叉反 应的参数
交叉反应率 [Y ]50 100% [Z ]50
•对cGMP的RIA, ATP无抑制作用，即交叉反应极小， cAMP抑制结合率50%所需浓度为cGMP的100倍，通常就 说cAMP对该cGMP抗体的交叉反应为1:100.
方法1
“0”剂量点结合率的均值减去其 二倍标准差所对应的剂量值.
方法2
“0”剂量点结合率降低10%后的 结合率对应的剂量值为最小 可测剂量,如反应参数采用 B/B0，则应以B/B0=90%时 对应的剂量为最小可测量
测定10个或10个以上的“零” 标准管，求出各管的结合率 （B/T%）和10个管结合率的均 数和标准差，用均数减去两个 标准差，求其相对应的浓度， 即为最小检出值。
体外放射分析
竞争放射分析
*放射免疫分析 *放射受体分析 竞争性蛋白结合分析
非竞争放射分析
免疫放射分析 酶放射分析 放射酶促分析 *非标记免疫分析技术
放射免疫分析
（Radioimmunoassay RIA）
以标记物与被测物及特异性结合试 剂发生竞争结合反应，从而对被测
的极微量物质作定量分析。
RIA的特点：
• 灵敏度高 可达10-9 ～１0-15g • 特异性强 • 应用范围广 • 操作简便
体外分析技术放射免疫分析
体外分析技术放射免疫分析体外分析技术是指在试管内进行反应从而测定某生物活性物质的超微量分析技术。
该类技术的特点是高灵敏度和高特异性，广泛用于临床和科学研究的很多领域。
应用最多的是：放射免疫分析、免疫放射分析、受体的放射配基结合分析及非放射性免疫分析。
一、原理放射免疫分析法(radioimmunoassay,RIA)的基本原理是，限量标记抗原［*Ag］和可变量的非标记待测抗原［Ag］与定量的特异抗体［Ab］发生竞争结合反应，通过测定复合物的放射性来计算出待测非标记抗原的量。
这一过程可用下式表示：*Λg+Λg+Ab< »［ΛgΛb］*+［ΛgΛb］上述式中，Ab的分子数少于*Ag,因此即使系统中没有Ag,仅有*Ag,当反应达到平衡时，绝大部分(因为是可逆反应，不会是100%)Ab将形成*AgAb复合物。
如果系统中加入Ag,则Ag与*Ag竞争结合Ab,形成AgAb,*AgAb将减少。
Ag越多则*AgAb越少。
实践和理论推导都证明，*AgAb和Ag呈二次方程的函数关系，如以Ag为横坐标，*AgAb(B)或*AgAb占加入总*Ag的％(B%)为纵坐标，是一条斜率逐步由大变小的下降曲线。
如以游离的*Ag(F)或游离*Ag占加入总*Ag的％(F%)为纵坐标，则是一条斜率逐步由大变小的上升曲线。
也可以*AgAb∕*Ag的比值(R)为纵坐标，也是一条斜率逐步由大变小的上升曲线。
分析中，首先以不同量的已知标准品Ag和定量*Ag及限量Ab进行竞争结合反应，得到以B或B%、F或F%、或R为纵坐标的剂量效应曲线(也称标准曲线)，然后以未知样品测得的B或B%、F或F%、或R从曲线上查出相应的剂量。
二、试剂盒基本试剂试剂盒由国家批准的生产单位提供，提供R1A的主要试剂、操作方法、保存条件及保存期限。
使用者应按说明书的要求合理使用。
如果临床工作需要，使用者可以对试剂稀释度、操作步.骤等进行适当修改，但应当对改变了的方案进行精密度、准确度、灵敏度等考核，并作详细记录。
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ER表达与内分泌治疗不相符：
肿瘤异质性 肿瘤组织类固醇代谢酶的灭活作用 受体本身缺陷 内存激素变化的影响 雌抑素(estrocolyone)失活 受体阳性的标准不准确和不一致 检测受体的标本的不均一性和代表性。 肿瘤的病因的复杂性或多元
神经系统疾病与受体
• • • • • 帕金森氏病 亨廷顿氏病 癫痫 忧郁 精神分裂症
乳腺癌ＥＲ状态与内分泌治疗效果的关系
____________________________________________________________ 有效例数/治疗例数 药 物 ---------------------ER+ ER____________________________________________________________ Tamoxifen 32/67 1/5 Nafoxidene 7/10 0/8 Stilboostrol 9/12 1/17 Dophrectomy 28/43 2/74 Adrenalectomy 15/22 1/9 Androgens 10/28 2/22 Glucocorticoids 15/32 0/19 Hypophsectomy 9/14 1/12 -----------------------------------------------------------总有效率 128/235(54.5%) 7/176(4%) ____________________________________________________________
GABA-R BDZ-R DA-R D1-R D2-R mACh-R Glu-R 大脑皮质 ＝ ＝/↑ ＝ 尾状核 ↓↓ ↓ ↓ 被壳 ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓↓ ↓↓↓ 苍白球 ↑ ↑ 黑质 ↑
↓ ＝ ↓
＝ ＝
↓↓ ↓↓
↓↓～↓↓：明显减少，↓：减少，＝：不变，↑：增加 GABA-R=Γ -氨基丁酸受体，BDZ-R=苯二氯卓受体，DA-R＝多巴胺受体，D1＝ D1受体， D2＝D2受体， mACh-R＝蕈毒碱样乙酰胆碱受体， Glu-R＝谷氨酸受体ຫໍສະໝຸດ O.5nMO.5nM
尾状核
侧坐核
尾状核 侧坐核
ADTN* (10uM) 肉桂硫胺 (1uM) 服药21 丁克吗 不服药7 (1uM) 服药13 ADTN 不服药4 (10uM) 服药12 丁克吗 不服药4 (1uM) 服药9 ADTN 不服药13 (10uM) 26
精神分裂症患者死后脑内多巴胺受体的变化
半衰期适中、发射正电子或单光子、 SA〉3.7TBq/mmol 易穿透生物屏障 代谢行为和作用机制清楚 特异性高 亲和力高 选择性强 标记后具完整的生物活性和药理活性 动态显像时用生理数学模型可作受体密度的模拟定量分析
受体在医学研究中的应用
疾病时受体的变化：
受体数目的变化 受体亲和力的变化 受体特异性的变化 受体的自身抗体 受体-效应器偶联机理异常
RBA的基本方法
制备待测受体的离体标本
加放射配基温育，反应达到平衡
终止反应，分离结合与游离部分
测定结合部分的放射性强度
数据处分理，求出有关参数
配基的选择
标记配基： 高亲和力、高特异性 高比活度 高放化纯度（98%） 化学稳定性。 非标记配基 高亲和力 高浓度
受体显像配基基本要求
ＥＲ和ＰＲ与乳腺癌化疗效果的关系(136例)
____________________________________________________________ 受体状态 治疗例数 有效例数 有效率% ____________________________________________________________ ER+ 25 3 12.0 PR+ 8 0 0 ER45 34 75.6 PR34 22 64.7 ER+、PR+ 24 21 87.5 ____________________________________________________________
体外放射配基结合分析及临床应用
卢汉平
中山大学基础医学院 实验核医学教研室
E-mail:luhp@
受体放射配基结合分析
Radioligand Binding Assay of Receptor ,RBA
用放射性核素标记配基与相应的受体行 特异性结合反应从而对受体进行定性和 定量的方法。
可饱和性(Saturability) 可逆性(Reversibility) 特异性(Specifity) 与生理效应一致性。
受体的分类
四级分类： 类(class) 亚类（subclass） 型 (type) 亚型 (subtype)
四大类膜受体示意图
受体的类 配基举例
受体的免疫组织化学
Immunohistochemistry
优点：
强特异性（单个氨基酸水平） 高敏感性 高分辨力
缺点：
半定量 无法测定亲和力
RBA相关的基本慨念
受体(receptor,R) 配基(ligand,L)： 激动剂、激动剂、内源性配基
受体与配基结合反应的质量作用定律
受体理论在疾病研究中的应用
探讨疾病的发病机理 受体的变化寻找疾病的病因 根据受体测定结果选择治疗方案 受体变化作为疾病预后指标 寻找防治措施
选择治疗方案
344例乳腺癌内分泌治疗效果与ＥＲ、ＰＲ的关系 ___________________________________________________________ 受体状态 治疗例数 有效例数 有效率% ____________________________________________________________ ER+、PR91 12 13.2 ER-、PR+ 10 3 30.0 ER+、PR125 37 29.6 ER-、PR+ 118 89 75.4 ____________________________________________________________
放射配基 + 受体分子
分离配基受体复合物
分析受体数量 和亲和力
RBA的分类
定性RBA：通过反应的量效关系及某些参 数的变化等来判断受体的类型、单位点 或多位点系统、受体与配基相互作用的 特点 (可逆或不可逆，受体间的合作作 用 )。 定量RBA：在已知反应性质的基础上，通 过结合反应分析组织或细胞中受体数目 （binding site,结合位点数）。
↓＝ ↑ ＝ ↑↓＝ ↓＝
↑ ↑↓＝ ↓＝ ＝ ↓＝ ↑
＝
↓ ↓ ＝ ↓ PET＝电子发射断层扫描
忧郁
通过忧郁病治疗脑内各种受体的变化
慢性或反复处理 三环类抗忧郁药 非三环类抗忧郁药 去甲肾上腺素受体
α
1
5-羟色胺受体 5-HT1 ↓→ ↓→ ↓ → 5-HT2 ↓ ↓ ↓ ↑
丙咪嗪结合部位 ACh—R mACh ↑→ ↓
配基浓度(nmol/L)
[RT-RL][L] KD == ---------[RL]
[RT-RL][LT-RL] == --------------[RL]
SB/F
Slope=-1/Kd
Bmax
SB Scatchard 作图
fmol/ml
受体最大结合容量的表示方式
胞浆及胞膜等的受体含量: fmol/mg蛋白 胞核的受体含量: fmol/mgDNA 完整细胞受体的含量: 6 结合位点/细胞(site/cell)或fmol/10 cell
乳腺癌胞浆ＥＲ不同水平与激素治疗的关系
____________________________________________________________ ER含量(fmol/mg.Pro) 有效率% ____________________________________________________________ ＞100 81 3～100 45 ＜3 0 ____________________________________________________________
RBA的基本原理
饱和曲线
0.006 0.005 0.004 0.003 0.002 0.001 0 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8
渐近线
复合物浓度(nmol/L)
KD=0.05nmol/L KD=0.20nmol/L KD=0.10nmol/L RT=0.005nmol/L
32例乳腺癌ER状态与激素治疗关系
____________________________________________________________ cytosol/nuclear 治疗例数 反应例数 无反应例数 ____________________________________________________________ ＋／＋ 22 18 4 －／－ 6 1 5 ＋／－ 3 0 3 －／＋ 1 0 1 ____________________________________________________________
K1 V1 [R]+[L] [RL] E K2 V2 KD: 平衡解离常数 [RT]: 受体初始浓度(总浓度) [LT]:配基初始浓度
[RT RL][LT RL] KD [RL]
[RL]2-[RL][RT+LT+Kd]+[RT][LT]=0 (Goldstein)
受体与配基结合反应的主要特点：