从土壤中分离产淀粉酶的芽孢杆菌实验方案

土壤中产淀粉酶芽胞杆菌的筛选及其淀粉酶活力的测定设计性实验方案

一、综述：

淀粉酶是淀粉降解酶。它们广泛存在于微生物、植物和动物体中。它们将淀粉及相关的聚合物分解为带有具体淀粉分解酶特征的产品。淀粉酶广泛存在于动植物和微生物中，是最早用于工业生产并且迄今仍是用途最广、产量最大的酶制剂产品

之一。淀粉酶种类繁多，特点各异，可应用于造纸、印染、酿造、果汁和食品加工、医药、洗涤剂、工业副产品及废料的处理、青贮饲料及微生态制剂］等多种领域。在酿造发酵工业如酒精生产、啤酒制造、发酵原料液化及糖化工艺过程中均有重要价值，如添加淀粉酶分布非常广泛，是人们经常研究的一种酶。从纺织工业到废水处理，这些酶都有不同规模的应用【1】。

常见产淀粉酶的主要为芽孢杆菌属。其中的常见产淀粉酶的芽孢杆菌菌种有：地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌和纳豆芽孢杆菌122、凝结芽孢。

由于芽孢杆菌属是一类好氧或兼性厌氧、产生抗逆性内生抱子的杆状细菌，许多为腐生菌，主要分布于土壤和植物体表面及水体中【4】。所以此次实验从土壤中分离产淀粉酶的芽孢杆菌。

二、实验目的要求

1. 了解生物分离提纯的原理和方法技术

2. 掌握从土壤中筛选产淀粉酶菌株的原理和方法

3. 掌握微生物摇瓶培养方法及淀粉酶活力测定的原理和方法

4. 培养学生的综合应用微生物实验方法的能力

5. 培养学生自行设计实验流程、综合分析问题解决问题和判断实验结果的能力。

三、实验原理

自然界中，土壤是微生物生活最适宜的环境。土壤具有微生物进行生长繁殖和生命活动中所需的各种条件。

土壤中微生物的数量因土壤类型、季节、土层深度与层次等不同而异。一般地

说，在土壤表面，由于日光照射及干燥等因素的影响，微生物不易生存，离地表10 cm〜30 cm的土层中菌数最多，随土层加深，菌的数量减少【5】。

从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。平板分离法普遍用于微生物的分离与纯化。其基本原理是选择适合与待分离微生物的生长条件，如营养成分、酸碱度、温度和氧等要求，或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其他微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。

值得指出的是，从微生物群体中经分离生长在平板上的单个菌落并不一定保证是纯培养。因此，纯培养的确定除观察其菌落特征外，还要结合显微镜检测个体形态特征后才能确定，有些微生物的纯培养要经过一系列分离与纯化过程和多种特征鉴定才能得到。

芽孢杆菌属的共同特征是：革兰氏阳性；接触酶阳性；水解淀粉；VP试验阳性；不产生吲哚；苯甲氨酸不脱氨；分解酪素；不分解酪氨酸；不产生二羟丙酮；营养体的最高生长温度大约从25 C到75 C以上；最低生长温度大约5 C到45 C;生长

最低pH值，从7.5 —8到2左右；耐盐范围从低于2%的NaCI到25%NaCI ;营养明胶（22 C）7天内液化1厘米或1厘米以上。枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌在糖

发酵试验用阿拉伯糖，木糖和甘露糖代替葡萄糖可产酸；作为营养生长的最低限培

养基是无维生素的，但含有葡萄糖、柠檬酸盐和一个氨态盐作为唯一的碳源和氮源

【6】

。

细菌特性

1. 繁殖快速：代谢快、繁殖快，四小时增殖10万倍，标准菌四小时仅可繁殖6倍。

2. 生命力强:无湿状态可耐低温-60C、耐高温+280C，耐强酸、耐强碱、抗菌消毒、耐高氧（嗜氧繁殖）、耐低氧（厌氧繁殖）。

3. 体积大:体积比一般病源菌分子大四倍数，占据空间优势，抑制有害菌的生长繁殖。

四、实验材料和用具

4.1 土样采集：采集广大植物园内的有机土壤，和生化楼下花坛的有机土壤

4.2营养琼脂（％）:蛋白胨1牛肉膏0.3 氯化钠0.5 琼脂1.5〜2.0 蒸馏水

将除琼脂以外的各成分溶解于蒸馏水内，加入15%氢氧化钠溶液约2mL，校正pH

至7.2〜7.4。加入琼脂，加热煮沸，使琼脂溶化。

4.3淀粉牛肉膏蛋白胨培养基（％）:可溶性淀粉0.2 牛肉0.3蛋白1.0 氯化钠0.5 琼脂1.5〜2.0 校正pH至7.2〜7.4

4.4发酵培养基（％）:玉米粉2 黄豆饼粉1.5 CaCI 0.02 MgSO4 0.02

NaCI 0.25 K2HPO4 0.2 柠檬酸钠0.2 硫酸氨0.075（溶解后加）Na2HPO40.2 校正pH值7.0

4.5葡萄糖蛋白胨培养基（V.P试验用）（%）:葡萄糖0.5 蛋白胨0.5

K2HPO4 0.2 校正pH 7.2 〜7.4

4.6蛋白胨水培养基（吲哚试验用）（%）:蛋白胨1% 氯化钠0.5% 校正

pH 7.2 〜7.4

4.7西蒙氏柠檬酸盐培养基（%):氯化钠0.5 硫酸镁(MgSO4・ 7H20)0.02

磷酸二氢铵0.1 磷酸氢二钾0.1柠檬酸0.5 琼脂2溴麝香草酚蓝溶液4酚红

试剂校正pH6.8

先将盐类溶解于水中，校正pH，再加入琼脂，加热融化，然后加入指示剂,

混匀后分装试管，121 C高温灭菌15min

4.8配制营养明胶培养基（%）:蛋白胨0.5、牛肉膏0.3、明胶1.2，调pH 6.8~7.0 4.9耐

盐培养基（%）:

①蛋白胨1牛肉膏0.3氯化钠2琼脂1.5〜2.0蒸馏水

②蛋白胨1牛肉膏0.3氯化钠10琼脂1.5〜2.0蒸馏水

③蛋白胨1牛肉膏0.3氯化钠20琼脂1.5〜2.0蒸馏水

④蛋白胨1牛肉膏0.3氯化钠25琼脂1.5〜2.0蒸馏水

加入15%氢氧化钠溶液约2mL，校正pH至7.2〜7.4。加入琼脂，加热煮沸，使琼脂溶化。

4.10溶液或试剂染料

革兰氏染色：草酸铵结晶紫染色液、卢戈氏碘液、95%乙醇；

芽孢染色：5%孔雀绿溶液，石炭酸复红液；香柏油、二甲苯吲哚试验：乙醚、吲哚试剂

V.P.试验：40 % NaOH溶液、a -奈酚，

淀粉酶活力测定：1%3, 5-二硝基水杨酸试剂

4.11仪器或其它用具

无菌玻璃涂棒无菌吸管接种环无菌培养皿土样三角瓶烧杯

洗瓶玻棒试管酒精灯擦镜纸接种环酒精灯载玻片吸水纸等。

恒温摇床恒温培养箱高压蒸汽灭菌箱超净工作台水浴箱紫外灯照射箱磁力搅拌器玻璃珠移液管涂布器显微镜