细胞培养的基本技术
细胞培养无菌操作基本技术
细胞培养无菌操作基本技术细胞培养是现代生物学研究中常用的一种实验技术，能够使细胞在体外条件下生长和繁殖。
无菌操作是细胞培养过程中非常重要的一项技术手段，可以保证细胞培养环境的无菌纯净，避免细胞被外部微生物污染。
本文将介绍细胞培养中常用的无菌操作基本技术，并结合实例进行详细说明。
无菌操作基本技术主要包括以下几个方面：1.实验前准备在进行无菌操作前，首先需要准备好实验所需的培养基、培养器具和其他实验工具。
这些器具和工具需要经过高温高压灭菌处理，以确保其无菌。
此外，实验人员还需佩戴无菌手套、穿戴无菌实验服，并对实验台面进行彻底的清洁消毒，保持实验环境的无菌。
2.灭菌操作在进行无菌操作前，需要对培养器具进行灭菌处理。
常用的灭菌方法有干热灭菌和湿热灭菌两种。
干热灭菌是将培养器具置于高温烘箱中，持续加热若干小时，以达到灭菌目的。
湿热灭菌则是将培养器具置于高压高温的蒸汽中，进行高压灭菌。
此外，对于一些无法耐受高温高压的培养器具，还可使用化学灭菌方法，如使用过氧化氢和酒精进行消毒。
3.无菌操作技术在进行无菌操作时，需要遵循一定的操作规范。
首先，实验人员应将实验器具放入无菌工作台中，在UV灯的照射下进行灭菌处理。
然后，实验人员需要将自己的双手放入无菌手套中，并使用无菌皮培养工具进行操作。
接下来，需要准备好含有培养基的培养皿，并用无菌注射器将细胞转移到培养皿中。
在操作过程中，需要注意避免造成培养基的污染，尽量减少对培养基的接触时间，以防止细菌或其他微生物的污染。
4.维持无菌操作环境在进行细胞培养过程中，需要维持无菌操作环境。
实验人员应避免在实验台面上散落细胞培养基、细胞碎片或其他可能造成污染的物质。
细胞培养箱和无菌安全柜的门不可长时间打开，以防止空气中的微生物进入工作区域。
并且需要定期对无菌安全柜和细胞培养箱进行清洁和消毒。
同时，实验室人员需要经常进行手部清洁，并定期更换无菌手套和实验服，保持实验环境的无菌。
细胞培养中的无菌操作是进行细胞培养实验的基础，能够产生可靠的实验数据，并在细胞学研究中发挥重要作用。
细胞培养技术的应用与发展
细胞培养技术的应用与发展细胞培养技术已经成为了现代生命科学研究的重要工具之一，随着技术的不断发展与创新，其在医学、工业、农业等领域中的应用越来越广泛。
本文将从细胞培养技术的基本原理、应用及未来发展趋势等方面进行论述。
一、细胞培养技术的基本原理细胞培养技术是指通过体外培养的方式，使细胞在相对理想的营养、温度、氧气、二氧化碳、水分等条件下生长、繁殖和分化，并保持其生物学的特性。
具体而言，细胞培养技术包括以下几个方面。
1. 细胞的来源细胞培养的第一步是选择合适的细胞来源，包括原代细胞、细胞系和细胞株。
其中原代细胞是从组织或器官中分离出的未经连续培养的细胞；细胞系是一组经连续次传代和分离的细胞，具有特定的生物学特性；细胞株则是从细胞系中特定的细胞分离而来，保留了一定程度的细胞特性。
2. 细胞的培养条件对于不同的细胞类型，其生长繁殖的最适温度、培养基成分、营养物质、生长因子等条件也不尽相同。
因此，在细胞培养过程中，需要根据具体的需求设计出最适合细胞生长的培养条件，保证其能够正常生长繁殖，并保持特定的生物学特性。
3. 细胞的分离和传代在细胞培养中，细胞的分离和传代也是非常重要的环节。
细胞分离的目的是把细胞从组织或器官中分离出来，单独培养；而细胞的传代则是指将已经培养的细胞分割成两个或多个部分，继续培养，保持其生长繁殖的能力。
二、细胞培养技术的应用1. 医学领域细胞培养技术在医学领域中的应用广泛，例如用于研究人类生理、病理以及药物毒性等方面。
此外，细胞培养技术还可以用于制备干细胞和肿瘤细胞等细胞种，以供疾病治疗或药物研发之用。
在肿瘤治疗方面，细胞培养技术可以用于研究肿瘤细胞的特性以及药物对肿瘤细胞的作用机制，为临床治疗提供参考。
2. 工业领域在工业领域中，细胞培养技术也被广泛应用于生物制品的生产过程中。
例如，在生物药品的制备过程中，细胞培养技术可以用来制造细胞培养物，这是制备生物制品的重要步骤。
3. 农业领域在农业领域中，细胞培养技术可以被用作繁殖和改良农业作物。
043动物细胞工程-第四章第三节 细胞的基本培养技术
4．重新加入TdR培养基(浓度同上)进行第2次阻断，作用16 h。
5．再弃掉TdR培养基，Hanks液洗2—3次后换上普通培养基。第2次 TdR释放0 h时取样则细胞处于G1/S期交界处；如2-7 h取样则为不同 阶段的S期细胞。 注意：具体TdR作用和释放的时间应参考每一种待 同步化细胞的细胞周期各时相测定的参考值，也可根据经验确定。
有的只有永生性和无异体接种致癌性，有些则相反（恶性）。
第四节 细胞系和细胞株的建立 一、细胞系和细胞株的种类 1．初代培养 初代培养又称原代培养，即直接从体内 取出的细胞、组织和器官进行的第一次的 培养物。
2．细胞系 初代培养物开始第一次传代培养后的细胞，即称之为细胞 系。如细胞系的生存期有限，则称之为有限细胞系(finite cell line)；已获无限繁殖能力能持续生存的细胞系，称连续细胞 系或无限细胞系(infinite cell line)。
位是否准确、组织是否保持活性、材料处理是否恰当，直接
1.鸡胚组织的取材：用于病毒与疫苗的研究
受精鲜蛋--孵化箱37℃孵育9-12d--从气室处
破壳--挑取鸡胚--按需取材。
2.鼠胚组织的取材：常用材料，易于培养。
杀死小鼠---75%酒精溶液整体消毒2--3s---固
定---剪开皮肤解剖取材。
2.取鼠胚：常用 材料，易于培养。
一次进行传代之前的时期，一个特征性的必然 的生长阶段。
完成了从体内环境到体外环境的过渡和适
应过程，恢复了分裂增殖与生长发育 的能力
取材——分离细胞——接种
一、原代培养
优点：组织和细胞刚刚离体，生物学特性未发生很 大变化，仍具有二倍体遗传特性，最接近和反映体内生 长特性，很适合作药物测试、细胞分化等实验研究。 （一）．组织取材 决定实验的成败。 取材是原代培养的最初环节，取材的部
细胞培养的基本原理与技术
第一章细胞培养的基本原理与技术现代生物技术一般认为包括基因工程技术、细胞工程技术、酶工程技术和发酵工程技术，而这些技术的发展几乎都与细胞培养有密切关系，特别是在医药领域的发展，细胞培养更具有特殊的作用和价值。
比如基因工程药物或疫苗在研究生产过程中很多是通过细胞培养来实现的。
基因工程乙肝疫苗很多是以CHO细胞作为载体；细胞工程中更是离不细胞培养，杂交瘤单克隆抗体，完全是通过细胞培养来实现的，既使是现在飞速发展的基因工程抗体也离不开细胞培养。
正在倍受重视的基因治疗、体细胞治疗也要经过细胞培养过程才能实现，发酵工程和酶工程有的也与细胞培养密切相关。
总之，细胞培养在整个生物技术产业的发展中起到了很关键的核心作用。
第一节体外培养的概念一、基本概念体外培养（in vitro culture），就是将活体结构成分或活的个体从体内或其寄生体内取出，放在类似于体内生存环境的体外环境中，让其生长和发育的方法。
组织培养：是指从生物体内取出活的组织（多指组织块）在体外进行培养的方法。
细胞培养：是指将活细胞（尤其是分散的细胞）在体外进行培养的方法。
器官培养：是指从生物体内取出的器官（一般是胚胎器官）、器官的一部分或器官原基在体外进行培养的方法。
二、体内、外细胞的差异和分化1、差异：细胞离体后，失去了神经体液的调节和细胞间的相互影响，生活在缺乏动态平衡相对稳定环境中，日久天长，易发生如下变化：分化现象减弱；形态功能趋于单一化或生存一定时间后衰退死亡；或发生转化获得不死性，变成可无限生长的连续细胞系或恶性细胞系。
因此，培养中的细胞可视为一种在特定的条件下的细胞群体，它们既保持着与体内细胞相同的基本结构和功能，也有一些不同于体内细胞的性状。
实际上从细胞一旦被置于体外培养后，这种差异就开始发生了。
2、分化：体外培养的细胞分化能力并未完全丧失，只是环境的改变，细胞分化的表现和在体内不同。
细胞是否表现分化,关键在于是否存在使细胞分化的条件，如Friend细胞（小鼠红白血病细胞）在一定的因素作用下可以合成血红蛋白，血管内皮细胞在类似基膜物质底物上培养时能长成血管状结构，杂交瘤细胞能产生特异的单克隆抗体，这些均属于细胞分化行为。
细胞培养技术
三、培养细胞技术
（二）细胞来源 （2） 消化培养法 与组织块培养法区别： A. 用酶制剂处理组织块，除去细胞间
质，使细胞分离，形成细胞悬液； B. 细胞生长方式多为单层。
优点：更易摄取营养、排除代谢产物生长 较快。
缺点：操作繁杂，易污染；消化可能对细 胞有损伤。
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三、培养细胞技术
（二）细胞来源 2. 细胞系（cell line） 原代培养物开始第一次传代培养后的细
底物：胶原、玻璃、塑料、其它细胞
血清中有促使细胞贴壁的冷析球蛋白
和纤粘素、胶原等糖蛋白（生长基质），这些
带正电荷的糖蛋白的Байду номын сангаас贴壁因子先吸附于底物
上，悬浮细胞再与吸附有促贴壁因子的附着。
进口塑料培养瓶涂有生长基质（化学合成的功 能基团）
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潜伏期
此时细胞有生长话动，而无细胞分裂。
单克隆抗体制备：包括诊断用单克隆抗体,治疗用单
克隆抗体。
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细胞培养目的和作用
基础研究 (1) 药物作用机理； (2) 基因功能； (3) 疾病发生 机理。
2、生物制药 疫苗生产：如病毒性疫苗(肝炎病毒疫苗,艾滋病疫苗
等),肿瘤疫苗(多肽疫苗)等。 基因工程药物生产：如在临床医学中具有治疗价值的
过滤）
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二、培养细胞相关条件
（二）培养用品
（1）培养瓶（25 、75 cm3）
6孔）
培养板（96、48、24、12、
培养皿（各种直径规格）
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二、培养细胞相关条件
（二）培养用品 （2）离心管（15、50 ml） （3）移液管、吸管 （4）冻存管、EP管 （5）试剂瓶等。
细胞培养技术
细胞培养技术
细胞培养技术，是生物学研究中非常重要的一个实验技术。
通过细
胞培养技术，研究人员可以将细胞在体外进行培养、繁殖和实验操作，从而深入研究细胞的生理功能、生化特性和病理变化。
细胞培养技术
的应用范围非常广泛，涉及生物医学、药物研发、基因工程、毒理学
等多个领域。
一、细胞培养技术的基本原理
细胞培养技术是基于细胞的自身生存条件进行设计的。
细胞在体外
培养时，需要提供适当的生长环境，包括营养物质、生长因子、温度、湿度等条件。
在细胞培养中，通常会使用培养基来提供细胞所需的养
分和环境，培养基的种类和配方会根据不同的细胞类型和实验目的进
行选择。
二、细胞培养技术的应用领域
细胞培养技术在生物医学领域有着重要的应用，可以用于研究细胞
生长、细胞信号传导、细胞凋亡等生理过程，也可以用于筛选药物、
评估药效及毒性。
此外，在基因工程和生物技术领域，细胞培养技术
也扮演着关键角色，如基因转染、蛋白表达等方面均需要借助细胞培
养技术。
三、细胞培养技术的挑战和发展
随着科学技术的不断进步，细胞培养技术也在不断发展。
但是，细
胞培养中仍然存在一些挑战，如细胞的纯化、传代过程中的遗传变异
等问题，这些都对研究结果的准确性提出了挑战。
未来，细胞培养技术将继续向着更高效、更精准的方向发展，为生物学研究提供更多可能。
细胞培养技术作为生物学研究中不可或缺的一部分，其重要性不言而喻。
通过不断地探索和创新，相信细胞培养技术将会在更多领域展现出其巨大的应用潜力，为人类的健康和生活质量带来更多的改变和进步。
细胞培养的基本操作方法
细胞培养的基本操作方法
1. 制备培养基：按照实验需求配制好所需的培养基，并进行质量控制和滤过处理。
2. 细胞的筛选与取样：选择适合实验需要的细胞进行培养，并从中分离出所需数量的细胞。
3. 细胞的接种：将取出的细胞均匀地分布到培养皿或培养板上，并加入足量的培养基使其充分生长。
4. 细胞的观察和记录：观察细胞在培养基中的生长情况，并及时记录。
5. 细胞的维护和传代：在适当的时间点及条件下，通过传代将细胞扩增并保持其良好的生长状态。
6. 细胞的冻存：在一定的条件下，将细胞进行保存和冻存，以备后续实验使用。
7. 细胞的再生：在需要时，重新接种冻存细胞并恢复其生长状态。
8. 细胞的应用：根据实验需求，将细胞用于不同的实验设计中。
植物细胞培养的基本技术_PPT幻灯片
一、植物材料的准备 二、培养基的准备 三、培养方法的选择
一、植物材料的准备
1、外植体
外植体：
植物组织培养中作为离体培养材料的器官或 组织的片段。
在继代培养时，将培养的组织切段移入新的 培养基时，这种切段也称外植体。
选取：
建立无菌材料时，取材的大小根据不同植物 材料而异。
植物培养物的生长取决于生长素和分 裂素的比例
高浓度生长素和低浓度生长素分裂素 刺激细胞分裂
低浓度生长素和高浓度生长素分裂素 刺激细胞生长
但是，过量赤霉素和酚类化合物能掩盖上述 现象。
（4）、需要有机氮源
有机氮源为蛋白质水解产物（如谷氨酰胺） 或各种氨基酸。
对细胞早期生长有利
氨基酸的加入主要是为了代替或增加氮源 的供应
常用培养基
MS、N6、B6、LS、RM-1964、B5、 White等。
MS培养基是Murashige（穆拉希吉）和 Skoog（斯科格）于1962年为烟草细胞培养 设计的，其特点是无机盐和离子浓度较高， 是较稳定的离子平衡溶液，它的硝酸盐含量 高，其养分的数量和比例合适，能满足植物 细胞的营养和生理需要，因而适用范围比较 广，多数植物组织培养快速繁殖用它作为培 养基的基本培养基。
原生质体培养 按 培养对象 分
单倍体细胞培养
按 培养基类型 分
固体培养 液体培养
按 培养方式 分
悬浮细胞培养
固体培养基
定义： 利用琼脂作为支持物的固体培养和固定化细胞培养
特点： 简便易行、培养所占空间小
常用的固化剂： 琼脂、藻酸盐、角叉藻聚糖、明胶、羟乙基纤维素、 聚丙烯酰胺、淀粉、硅胶
固体培养基
苏氨酸、甘氨酸和缬氨酸，通过灭活位于 叶绿体和细胞质上的谷氨酸合成酶而降低氮 的利用
细胞培养基本知识基本技术
医学院 中心实验室 谷景义 85225841
主要内容： •1、细胞培养基本知识 •2、培养细胞生长环境 •3、细胞培养基本技术
•4、培养细胞质量控制
一、 细胞培养
• 把取得的组织用机械或消化的方法分 散成单个细胞，用培养基制成细胞悬 液，在体外适宜条件下，使细胞生长 繁殖，并保留其一定的结构和功能特 性。
二、培养细胞生长环境
Cell Culture Environment
Substrate Gas Medium Serum Supplements
Glass ﹠ Plastic Culture Vessels ……
O2 CO2
……
pH Osmolality Temperature ……
Hormones FBS Growth factors NCS Antibiotic ……
培养细胞的特性1 -生长方式及类型
• 贴附型、悬浮型
培养细胞的特性2 - 增殖特点
• 体外培养的细胞既保持了一定的体内细 胞的基本特性，但也具有本身的一些特 点。 • 贴附-伸展 • 接触抑制-增殖的密度抑制
贴附-伸展
接触抑制
• 当一个细胞被其他细胞围绕导致无处 可去而保持接触时，细胞不再移动， 在接触区域的细胞膜活动将停止。 • 因此，一般正常细胞并不相互重叠于 其上生长。
• 应用： • 软骨和骨组织（软骨细胞和干细胞，再生损伤的软骨、骨） • 循环系统和心脏（有目的地改变血管形成）
细胞培养技术的特点及应用
优点：
1）研究的条件可以人为控制 2）研究的样本均一 3）研究内容方便观察、检测、记录 4）研究的费用相对于经济
缺点：体外培养的细胞不能完全Байду номын сангаас同于体 内的细胞。
细胞培养基本知识技术
物质溶解其中。 • 4．大气的CO2溶解 （二）纯化水制备应注意事项： • 在准备室选择一处洁净、无尘、清静的地方放置纯
化水的装置。 • 所得的纯化水贮备在专用的干净玻璃瓶内，最好用
硼砂硅玻璃瓶内，标记上制备的日期。
• CO2培养箱是培养细胞的专用设备. • CO2培养箱培养细胞必须满足细胞生长的
三个条件. • 稳定的温度. • 大于95%的相对湿度. • 稳定的CO2浓度 • 三气培养箱是从CO2培养箱基础上发展出来
的新品种,它可同时控制O2浓度.
注意事项
• 1 用螺旋口瓶培养细胞时需将瓶盖微松，以保证 通气。但瓶口过松，易污染。
倒置显微镜
工作原理
一般情况下,人眼只能在光波的波长(颜色)和振幅(亮 度)发生变化时,才能看到被检测物体.但生活状态下的细胞 都呈无色透明,光线通过这些物体时波长和振幅并不发生 变化，因此用普通显微镜无法看清活细胞的形态和结构。 相差显微镜是利用细胞内各结构密度的不同而对光产生折 射率有差异的原理，即光波在折射率大的物体中比在折射 率小的物体中前进的距离较短，此距离叫光程差，由于光 程差引起光的相位变化称为相位差或相差。使用相差显微 镜可使肉眼不能分辨的相位差变为可分辨的振幅差（即明 暗差），使无色透明的物体在镜下反差显著、影像清晰。
（三）纯化水的常用制备方法
• 1.去离子法和石英双重玻璃蒸馏器法结合
• 水中含有溶解或不溶解的矿物盐、油脂及酸类， 以及O2,CO2,H2S,Cl2等。这些物质通过离子交换 树脂除去。
• 采用阳离子树脂或阴离子树脂处理。常使用强酸 性阳离子交换树脂和强碱基性阴离子交换树脂， 将水流通过离子交换柱即得纯净的去离子水。
第四章 动物细胞培养的基本技术和方法
境
二、细胞传代方法
1.贴壁细胞的消化法传代：
（1）吸弃或者倒掉瓶内陈旧的培养液
（2）于培养瓶内加入适量消化液 （3）消化2-5min，在显微镜下观察细胞状态，发现细胞质回缩，细胞间隙 增大后，应即刻停止消化 （4）吸除或者倒掉消化液 （5）吸管吸取新鲜培养液，按照顺序吹打瓶壁细胞，注意动作要轻柔 （6）计数后，按要求的接种量接种在新的培养基内
结果分析：
（1）作图法 （2）公式法
三、细胞培养的污染检测及排除
培养细胞的污染包括：微生物、化学物质、细胞交叉
1.微生物污染
污染途径：空气、器材、操作、血清、组织样本 污染对细胞的影响：抑制细胞生长，产生有毒物质，促使细胞死亡 微生物污染的检测与排除： （1）真菌污染 培养液中有白色或者浅黄色的漂浮物，细胞间有丝状菌丝体，可以采用霉菌素或者酮康唑对细 胞进行处理 （2）细菌污染 培养液短期颜色变黄、变浑浊，使用5-10倍抗生素剂量冲击法 （3）支原体感染 相差显微镜检测；荧光染色法；电镜检查；DNA分子杂交检查
2.悬浮细胞的传代方法：
（1）直接传代法 （2）离心传代法
三、细胞系的维持
细胞系的维持是通过换液、传代、再换液、再传代和细胞冻存实现的 注意事项： （1）做好细胞系的档案记录工作
（2）遵从细胞生长规律
（3）防止细胞间的交叉污冻存、复苏和运输技术
一、细胞的冻存
第四节 动物细胞传代培养技术
一、原代培养的首次传代
传代：细胞由原培养瓶内分离稀释后传到新的培养瓶的过程 首次传代注意事项： （1）待细胞生长到足以覆盖瓶底壁的大部分表面后再传代 （2）传代时候不同细胞需要消化的时间不同，要根据需要具体观察，
及时进行处理
（3）首次传代时，细胞接数量要多一些，促使细胞尽快适应生长环
细胞培养基本技术PPT课件
目录
• 细胞培养技术简介 • 细胞培养的基本条件 • 细胞培养的常用技术 • 细胞培养的实验操作 • 细胞培养的注意事项与安全防护
01 细胞培养技术简介
细胞培养技术的定义
细胞培养技术是指将活体组织或细胞 从生物体中分离出来，在模拟体内环 境的条件下，进行培养、繁殖和维持 生命活动的一种技术。
有特定功能的细胞。
细胞克隆技术的优点是能够筛 选出具有特定功能的细胞，缺 点是需要花费大量时间和精力
进行筛选。
细胞融合技术
细胞融合技术是通过将两个或多个细 胞融合成一个新的细胞，用于生产单 克隆抗体、制备杂交瘤细胞等。
细胞融合技术的优点是能够制备出具 有两个或多个细胞特性的杂交瘤细胞， 缺点是需要筛选出具有所需特性的杂 交瘤细胞。
染条件。
04 细胞培养的实验操作
细胞接种与扩大培养
细胞接种
将少量细胞悬液加入培养容器中，轻 轻旋转使细胞均匀分布。
扩大培养
将已生长的细胞从原培养容器中取出 ，按比例加入新鲜培养基，继续培养 。
细胞的观察与检测
细胞形态观察
定期观察细胞形态变化，如生长状态、分裂速度等。
细胞数量与密度检测
使用细胞计数板或流式细胞仪测定细胞数量和密度。
传代细胞培养需要定期进行细胞 分裂和繁殖，以维持细胞的生长
和生产能力。
传代细胞培养的优点是能够大量 生产具有相同特性的细胞，缺点 是细胞的生长和生产能力会随着
传代次数的增加而降低。
细胞克隆技术
细胞克隆技术是通过将单个细 胞培养成一个个独立的群体， 用于筛选具有特定功能的细胞。
细胞克隆技术需要使用适当 的筛选方法来识别和分离具
细胞识别与鉴定
细胞培养的基本原理和技术
细胞培养的基本原理和技术细胞培养是现代生物学研究中的重要技术之一，它可以为疾病的发现、药物的研发、细胞相互作用的探究等提供技术支持，因此在生命科学领域中有着广泛的应用。
在本文中，我们将会从细胞培养的基本原理及技术进行探讨，包括细胞培养的种类、基本原理、培养环境和培养技术。
1.细胞培养的种类细胞培养可以分为体外细胞培养和体内细胞培养两种。
体外细胞培养是指将细胞置于培养液中并在特定的温度、湿度、氧气浓度、pH值等条件下；通过培养皿、培养器等实验设备进行体外培养；而体内细胞培养则是将生物体内的细胞移植到另一个生物体内进行培养。
因为体内细胞培养的操作过于复杂，因此体外细胞培养被广泛应用于现代生物科学研究中。
2.细胞培养的基本原理细胞培养的基本原理可以归纳为两个方面，生理学基础和实验室技术。
生理学基础主要是指细胞是生命体系中的基本单位，对于其生理生化反应机制的深入理解可以为培养细胞提供一些基本的理论指导，具体可以理解为，细胞培养需要提供适合其生长发育的生长基质、培养液、气氛、营养等元素，同时理解细胞的生理学功能、生物化学反应机制有助于提供培养条件的优化。
而实验室技术则包括无菌操作、培养器具、培养液的制备等方面，是保证细胞培养成功的关键。
3.培养环境的设定细胞培养所需要的培养环境包括适合细胞生长的生长基质、培养液、气氛等因素，其中生长基质是细胞生长发育的基本支持物，可以理解为支架。
常见的生长基质有培养皿、网状物、凝胶等，它们都是在实验基础的条件下，为细胞提供生长空间和黏着面的特种物质。
培养液是细胞生长发育所需要的保证，它包括必需的氨基酸、营养素、菌落刺激因子等，在细胞培养中，常常需要通过修改培养液的成分达到生长优化的目的。
而氧气浓度、pH值等则是影响细胞生长和分化的关键因素，理解它们的含义并合理控制可以为培养细胞提供更优质的环境。
4.细胞培养的技术细胞培养技术可以分为无菌操作、细胞接种、细胞增殖、颜色检测、活体显微镜检测等步骤。
动物细胞培养的基本技术
使用前半小时先开紫外线灯灭菌，再关灭菌灯启动风机 ，然后进行操作。使用后用75％的酒精擦洗台面。 切记：不要用有机溶剂擦拭挡风玻璃。
恒温培养箱
变通电热恒温培养箱 CO2培养箱
细胞培养总原则
1
2 3 4
无菌无毒害的环境 支持生长增殖的营养 其它类似体内的环境
维持细胞性状
(一) 细胞培养无菌无毒环境
实验室设计合理 常用设施及设备 培养器皿： 透明度好、无毒、利于细胞贴附和生长的 材料，常用一次性聚苯乙烯材料制品或中 性硬度玻璃制品。
细胞培养无菌操作基本技术
工作环境及表面的处理 细胞培养所用玻璃及塑料制品的处理 培养液与培养细胞的处理
单蒸水冲洗3次
121℃高压蒸汽灭菌20min
塑料器材
常用的塑料器材有多孔培养板（4孔、6孔、 12孔、24孔、96孔）、培养皿、培养瓶及吸 头。 重复使用的处理步骤： 自来水刷洗 3％HCl或2％NaOH溶液浸泡过夜 双蒸水冲洗3次
自来水充分冲洗
紫外线直接照射或辐照灭菌
橡皮器材
首次使用： 自来水刷洗 5％ NaOH溶液煮沸15min 4％HCl盐酸煮沸15min 单蒸水冲洗3次 自来水冲洗8次
37℃，饱和湿度，5％CO2
其他设备
酶标仪
二、细胞培养常用器材及处理方法
玻璃器材 塑料器材 橡皮器材 金属器材 其他用品
玻璃器材
常用的玻璃器材有各种规格的玻璃瓶、培养瓶、培养 皿、吸管、离心管。 首次使用：
自来水刷洗 0.1％稀盐酸浸泡过夜 自来水冲洗
重复使用的处理步骤：
自来水刷洗 硫酸－重铬酸钾浸泡过夜 双蒸水冲洗2次 自来水冲洗10次 晾干、包装
《细胞培养技术》课件
contents
目录
• 细胞培养技术简介 • 细胞培养的基本原理 • 细胞培养的实验操作 • 细胞培养技术的应用实例 • 细胞培养技术的发展前景与挑战
01
细胞培养技术简介
细胞培养技术的定义
细胞培养技术是指在体外模拟体 内环境，用于培养细胞的技术。
该技术通过提供适宜的营养、气 体和生长因子等条件，使细胞在
目前细胞培养技术面临的挑战
细胞来源
目前细胞培养的细胞来源有限，主要来源于肿瘤细胞和胚 胎干细胞，需要寻找更为安全、可靠的细胞来源。
培养环境
细胞在体外培养过程中需要模拟体内的生理环境，如温度 、湿度、pH值等，如何维持这些环境参数的稳定是当前 面临的重要挑战。
免疫排斥
在组织工程和器官移植等领域，免疫排斥反应是影响治疗 效果的重要因素之一，如何降低免疫排斥反应也是当前研 究的重点。
将细胞从旧的培养液中分 离出来，并接种到新的培 养液中。
细胞冻存
将细胞保存于低温或冷冻 状态，以便长期保存或未 来使用。
细胞培养中的注意事项
严格无菌操作
避免微生物污染，保证细胞的 健康生长。
适宜的细胞密度
确保细胞获得足够的营养和空 间，促进其生长和分裂。
定期更换培养液
清除代谢废物，提供新鲜的营 养物质。
01
02
03
04
生物医学研究
用于研究细胞的生长、发育、 分化、凋亡等过程，以及探索 疾病的发生机制和治疗方法。
药物研发
用于筛选和验证药物的有效性 和安全性，以及研究药物的细
胞作用机制。
再生医学
用于组织工程和干细胞治疗等 领域，为损伤修复和疾病治疗
提供新的手段。
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33
1.细胞种类：小鼠腹腔分离的单核巨噬细胞； 2.培养的天数：24h； 3.放大倍速：倒置显微镜 X10； 4.培养基种类：RPMI1640+10%胎牛血清； 5.细胞状态与特征简述：细胞呈圆形，边缘清晰 整齐，贴壁生长。
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（二）悬浮型：
见于少数特殊的细胞，如某些类型的癌细胞及白血病细胞。 胞体圆形，不贴于支持物上，呈悬浮生长。这类细胞容易大 量繁殖。
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概念：培养时不贴附于底物而呈悬浮状态生长 或以机械方法使保持悬浮状态下生长 来源：自血，脾或骨髓，尤以血中白细胞癌肿细胞也可能 特点：在悬浮中生长良好细胞圆形，单个或小细胞团 优点：生存空间大，提供数量大，传代方便(不需消化)， 易于收获，可获得稳定状态 缺点：观察不方便，很多细胞不能悬浮生长(尤以正常细 胞)
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名称：凡在培养中形态与成纤维细胞类似的 来源：由中胚层间充质组织起源的组织如： 真正的成纤维细胞，心肌，平滑肌，成骨细胞， 血管内皮 形态：似体内成纤维细胞的形态，胞体梭形或不规则 三角形，胞质向外伸出2—3个长短不等的突起， 中有卵圆形核 生长特点：排列成放射状，漩涡状，并不紧靠连成片， 细胞—细胞接触易断开而单独行动，游离的单独 的成纤维样细胞，常有几个伸长的细胞突起
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【培养前准备】 在开始实验前要制定好实验计划和操作程序。有关数据的计算要事 先做好。根据实验要求，准备各种所需器材和物品、清点无误后将其放 置操作场所(培养室、超净台)内，然后开始消毒。这可以避免开始实验 后，因物品不全往返拿取而增加污染机会。
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【操作野消毒】 无菌培养室每天都要用0.2%的新洁尔灭拖洗地面—次(拖布要专用)， 紫外线照射消毒30-50min，超净工作台台面每次实验前要用75％酒精擦洗。 然后紫外线消毒30min。在工作台面消毒时切勿将培养细胞和培养用液同 时照射紫外线，消毒时工作台面上用品不要过多或重叠放置，否则会遮挡 射线降低消毒效果。—些操作用具如移液器、废液缸、污物盒、试管架等 用75%酒精擦洗后置于台内同时紫外线消毒。
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人PBMC（PHA活化剂刺激16h后）： 1.细胞种类：人PBMC； 2.培养的天数：36h； 3.放大倍速：倒置显微镜 X10； 4.培养基种类：RPMI1640+10%胎牛血清； 5.细胞状态与特征简述：淋巴细胞母细胞化并聚集。
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人PBMC（经EB病毒转化后的淋巴母细胞）： 1.细胞种类：人PBMC； 2.培养的天数：2 weeks； 3.放大倍速：倒置显微镜 X10； 4.培养基种类：RPMI1640+15%胎牛血清（Hyclone公司)； 5.细胞状态与特征简述：淋巴细胞母细胞化并聚集。
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• 台盼蓝法
• • • 活细胞不被染色，死细胞染成蓝色； 用活细胞占细胞中的百分比表示细胞活力； 方法： 1、将细胞悬液以0.5ml加入试管中； 2、加入0.5ml 0.4%台盼兰染液，染色2一3分钟； 3、吸取少许悬液涂于载玻片上，加上盖片； 4、镜下取几个任意视野分别计死细胞和活细胞数，计细胞活力； 死细胞能被台盼兰染上色，镜下可见深兰色的细胞，活细胞不被染 色，镜下呈无色透明状。 活力测定可以和细胞计数合起来进行，但要考虑到染液对原细胞悬液 的加倍稀释作用。
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【火焰消毒】 在无菌环境进行培养或做其它无菌工作时，首先要点 燃酒精灯。以后一切操作，如按装吸管帽、打开或封闭瓶 口等，都需在火焰近处并经过烧灼进行。
培养瓶 试管 培养皿
滴管
吸管
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【操作】 进行培养时，动作要准确敏捷，但又不必太快，以防空 气流动，增加污染机会。不能用手触及已消毒器皿，如已接 触，要用火焰烧灼消毒或取备品更换。
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成纤维细胞
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成纤维细胞
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2、上皮型细胞：
细胞呈扁平不规则多角形，中央有圆形核，细胞彼此 紧密相连成单层膜。生长时呈膜状移动，处于膜边缘 的细胞总与膜相连，很少单独行动。起源于内、外胚 层的细胞如皮肤表皮及其衍生物、消化管上皮、肝胰、 肺泡上皮等皆成上皮型形态。
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名称：仅形态上似体内，实际上不完全相同 来源：来源于外胚层、内胚层细胞, 如： 皮肤及其衍生物,消化道，乳腺，肺泡, 上皮性肿瘤 形态：类似体内的上皮细胞扁平，不规则多角形，中有圆 形核 生长特点：易相连成片，相靠—紧密相连—成薄层—铺石状 生长时呈膜状移动，很少脱离细胞群而单个活动
细胞培养基本技术
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无菌操作技术
体外培养细胞缺乏抗感染能力，所以防止污染是决定培养成功或失败 的首要条件。即便使用设备完善的实验室，若实验者粗心大意，技术操作 不规范,也会导致污染。因而,为在一切操作中最大可能地保证无菌，每一 项工作都必须做到有条不紊和完全可靠。
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新生24小时wistar大鼠皮质神经细胞 1.细胞种类：大鼠皮质神经细胞； 2.培养的天数：5 天； 3.放大倍速：倒置显微镜 X200倍； 4.培养基种类：DEME-F12＋N2 5.细胞状态与特征简述：神经细胞聚集成球，向外爬行生长，各神经球之间 有丰富的神经丝联系。单个神经细胞胞体呈锥形或圆形，树突交错呈网，贴 壁生长 。
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Terms to remember :
消毒(disinfection)和消毒剂(disinfectant) 灭菌(sterilization) 防腐(antisepsis)和防腐剂 抑菌(bacteriostasis)和抑菌剂(bacteriostatic) 无菌(asepsis) 无菌技术/无菌操作(antiseptic technique)
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细胞传代培养—消化法
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细胞计数
•
培养的细胞在一般条件下要求有一定的密度才能生长良好，所以要进行细胞 计数。计数结果以每毫升细胞数表示。细胞计数的原理和方法与血细胞计数 相同。
• •
血细胞计数器：手工计数细胞 血球计数仪 ：自动计数
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细胞计数： 1、将血球计数板及盖片擦拭干净，并将盖片盖在计数板上。 2、将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计 数板之间。 3、静置3分钟。 4、镜下观察，计算计数板四大格细胞总数，压线细胞只计左侧和 上方的。然后按下式计算： 细胞数/ml＝4大格细胞总数/ 4×10000 注意：镜下偶见由两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计 算，若细胞团占10%以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液。
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无菌操作技术
1.工作环境及表面的处理 2.细胞培养所用玻璃及塑料制品的处理 3.实验者的操作技术 4.培养液的处理
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无菌技术概念
无菌技术 无菌区 非无菌区 相对无菌区 无菌物品 污染物品
是指在医疗、护理操 是指经过灭菌处理 是指未经过灭菌处理 是指无菌物品自无菌 作过程中，防止一切 是指经过物理或化学 且未被污染的区域。 ，或虽经过灭菌处理 是指未经处理或消毒 容器内一经取出，就 微生物侵入人体和防 方法灭菌后保持无菌 但又被污染的区域。 灭菌后又被碰脏的物 认为是相对无菌，不 止无菌物品、无菌区 状态的物品。 品。 可再放回。 域被污染的技术。 无菌区边缘向内3cm 为相对无菌区。
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【洗手和着装】 原则上和外科手术相同。平时仅做观察不做培养操作时，可穿 着细胞培养室内紫外线照射30min的清洁工作服。在利用超净台工 作时，因整个前臂要伸入箱内，应着长袖的清洁工作服，并于开始 操作前要用75％酒精消毒手。如果实验过程中手触及可能污染的物 品和出入培养室都要重新用消毒液洗手。进入原代培养室需彻底洗 手还要戴口罩、着消毒衣帽。
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细胞传代方法
• • • • • • • • 根据细胞生长的恃点，传代方法有3种： 1．悬浮生长细胞传代 离心法传代：离心（1000转/分）去上清，沉淀物加新培养液后 再混匀传代。 2．半悬浮生长细胞传代（Hela细胞） 此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接吹 打法使细胞从瓶壁脱落下来，进行传代。 3．贴壁生长细胞传代 采用酶消化法传代。常用的消化液有0.25％的胰蛋白酶液。
接种环、接种针
L形涂布棒
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培养细胞的观察
１．肉眼观察培养物颜色及混浊度
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体外培养细胞的常见问题
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２．倒置显微镜观察细胞生长状态
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体外培养细胞的方式
群体培养（mass culture），将含有一定数量细胞的悬液置于培 养瓶中，让细胞贴壁生长，汇合（confluence）后形成均匀的单细胞 层； 克隆培养（clonal culture），将高度稀释的游离细胞悬液加入 培养瓶中，各个细胞贴壁后，彼此距离较远，经过生长增殖每一个细 胞形成一个细胞集落，称为克隆（clone）。一个细胞克隆中的所有细 胞均来源于同一个祖先细胞。
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1.细胞种类：小鼠腹腔分离的单核巨噬细胞； 2.培养的天数：30h； 3.放大倍速：倒置显微镜 X10； 4.培养基种类：RPMI1640+10%胎牛血清； 5.细胞状态与特征简述：细胞形态不规则，向四 周伸展伪足，边缘不清，贴壁生长。
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4、多型细胞型：
有一些细胞，如神经细胞难以确定其规律和稳定的形 态，可统归于此类。
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其他染色方法
未固定凋亡细胞染色 ： 台盼蓝法： AO/EB双染色法： 致密浓染黄绿色：早期凋亡细胞， 致密浓染鲜红色：晚期凋亡细胞， 鲜红色膨大状：坏死细胞 凋亡细胞固定后染色观察： MGG染色法：玻片晾干后用MGG染液染色20 min，光镜观察 Hoechst3325染色法 HE染色法 其他： Annexin V /PI双染法： 正常活细胞Annexin V 、PI均低染； 凋亡细胞Annexin V高染、PI低染； 坏死细胞Annexin V/PI均高染 TUNEL染色：检测细胞凋亡 CFSE染色：检测细胞增殖 MTT比色法：测定细胞相对数和相对活力